Universidad Nacional Autnoma de Mxico Facultad de Estudios Superiores Cuautitln Campo 4 Medicina Veterinaria Zootecnista Reporte de prctica#6: Medicin

de la actividad enzimtica. Cintica de la enzima ureasa.

Equipo #2:

Ciriaco Solano Lina Elizabeth Cruz Mrquez Salvador Gonzlez Buenda Mara del Carmen Luna de Alba Antonio Vallejo Martnez Silvia Laboratorio Bioqumica

Profesores: Q.F.B. Juana Alicia Alquiciara Camacho M.V.Z. Francisco Javier Cervantes Aguilar M.V.Z. Silvia Leticia Bonilla Orozco

Grupo: 2201

Fecha de entrega: 9 abril 2013

INDICE

PGINA

Resumen.3

Introduccin/Marco terico..4

Objetivos.7

Material y Metodologa.8

Resultados.10

Discusin14

Conclusin.14

Referencias15

RESUMEN El pasado 2 de abril cumpliendo con el protocolo esta blecido por el Manual de Practicas de Bioqumica para la Carrera de MVZ, llevamos a cabo la Practica nmero 6, correspondiente a la Cintica de la Enzima Ureasa. Bajo la supervisin de nuestro Profesor, elaboramos la experimentacin estipulada, con un manejo adecuado del material que el laboratorio nos proporcion. La prctica estaba comprendida por varios experimentos y debido a la complejidad y el tiempo que se requiere para elaborarlos, el Profesor decidi asignar un experimento diferente a cada equipo. El equipo numero 1 realizo el experimento nmero uno que corresponde determinacin del efecto de la variacin en la concentracin de sustrato (en caso urea) sobre la velocidad de reaccin de la ureasa, cabe destacar que experimento es muy importante pues de ellos dependa el anlisis de los resultados que posteriormente se explicaran en este trabajo. a la este este mas

En nuestro equipo, es decir el equipo nmero 2, realizamos el experimento nmero dos, que corresponda a la determinacin del efecto de la variacin en la concentracin de enzima (ureasa) sobre la velocidad de reaccin de la misma, con un establecimiento adecuado del experimento logramos cumplir con dicha determinacin, aunque los valores que se arrojaron fueron poco comunes, ms adelante abundaremos en ellos. Al equipo 3 le toco llevar a cabo el experimento nmero tres, que corresponda a la determinacin del efecto de la variacin de la temperatura sobre la velocidad de la reaccin de la ureasa. El equipo 4 se encarg de la determinacin del efecto de la variacin del pH del medio sobre la velocidad de reaccin de la ureasa. Habiendo realizado cada equipo su experimento, se obtuvieron resultados los cuales presentamos en el pizarrn a travs de unas tablas que mostraremos en los resultados. Cumpliendo con los objetivos de la prctica y habiendo obtenido los resultados de los experimentos cada equipo anoto los resultados de los dems equipos para completar y complementar la practica en su totalidad. Fue as que el pasado 2 de abril concluimos la prctica nmero 6, a continuacin expondremos el marco terico y todo lo que engloba a dicha prctica.

INTRODUCCION/ MARCO TEORICO: ENZIMAS Las son catalizadores proteicos que aceleran la velocidad de una reaccin. Actan en condiciones muy suaves, a temperatura por debajo de 70C,con un PH de +7.Tienen un alto Grado De Especificidad, solamente catalizan la reaccin en que participa un sustrato o un grupo de sustratos con ciertas caractersticas qumicas y geomtricas comunes. Sustrato: es una molcula sobre la que acta una enzima. El sustrato se une al sitio activo de la enzima, y se forma un complejo transformado en enzima-sustrato. El sustrato por accin de la enzima es producto y es liberado del sitio activo, quedando libre para recibir otro sustrato. ESPECIFICIDAD, CATALTICOS. SITIO ACTIVO Y GRUPOS

Las enzimas se unen a los sustratos por medio de interacciones hidrofbicas y electrostticas, puentes de hidrgeno y fuerzas de van der Waals. Los residuos de aminocidos de la enzima que participan en la interaccin con el sustrato estn alejados unos de otros; pero como resultado de la unin del plegamiento de la protena, se agrupan para formar el sitio activo de la enzima. Algunos residuos participan solo en la unin del sustrato y definen una regin del sitio activo que se llama sitio de fijacin o de unin de los sustratos. Los catalticos (residuos), se encargan dela transformacin del sustrato en producto. Normalmente, el nmero de residuos que intervienen en la unin del sustrato es mayor que el de residuos catalticos. Debido al plegamiento de la protena, su localizacin se encuentra en los surcos o huecos de la superficie de la enzima. INHIBICIN Los inhibidores son molculas que interactan con la enzima y disminuye su actividad cataltica. Tienen gran importancia desde un punto de vista mdico, debido a que un buen porcentaje de los medicamentos trabajan como inhibidores

de alguna actividad enzimtica. Su importancia industrial radica en su uso como pesticidas e insecticidas. Dentro del campo de la investigacin, como herramientas que se usan para indagar el orden de los componentes de una va metablica o una estructura y el mecanismo de reaccin de una enzima. Conviene pensar en los inhibidores como herramientas poderosas de gran utilidad y no como molculas que estorban en un ensayo enzimtico. INHIBICIN COMPETITIVA La caracterstica ms importante de este tipo de inhibicin es que el sustrato y el inhibidor son mutuamente excluyentes. Generalmente, se encuentra que el inhibidor es una molcula con estructura similar a la del sustrato. Sin embargo tambin se puede dar el caso de que el inhibidor sea estructuralmente diferente al sustrato y que, al interactuar con otro sitio diferente de la enzima, induzca un cambio conformacional que modifique el sitio para el sustrato. INHIBICIN NO COMPETITIVA Es un tipo de Inhibicin que reduce la tasa mxima de una reaccin qumica (Vmax) sin cambiar la afinidad aparente de unin del catalizador por el sustrato. La inhibicin no competitiva normalmente se aplica a enzimas, y difiere de la inhibicin competitiva en que el inhibidor siempre se une a la enzima por un sitio diferente al centro activo de la enzima. Esto afecta a la tasa de la reaccin catalizada por la enzima ya que la presencia del inhibidor produce un cambio en la estructura y la forma de la enzima. En este tipo de inhibicin, no hay competicin entre en inhibidor y el sustrato, as que incrementar la concentracin del sustrato no produce un aumento de la tasa de actividad enzimtica. INHIBICIN ACOMPETITIVA En la inhibicin acompetitiva, el inhibidor slo se une al complejo enzima sustrato, y no a la enzima libre. La adiccin de ms sustrato a la reaccin da lugar a un aumento de la velocidad de reaccin, pero no hasta el grado que se observa en las reacciones sin inhibir. La inhibicin acompetitiva suele observarse en las reacciones en las que las enzimas unen ms de un sustrato. INHIBICIN IRREVERSIBLE Los inhibidores irreversibles normalmente se unen covalentemente a la enzima,con frecuencia a una cadena lateral del lugar activo. EFECTO DEL pH.

El pH no afecta la actividad enzimtica directamente sino que modifica la concentracin de protones. Los protones adems de alterar la estructura de la enzima y el sustrato, pueden participar tambin en la reaccin como sustrato o producto. En esos casos, la concentracin de protones afecta directamente la velocidad de la reaccin. Cualquier cambio brusco de pH, sabiendo que las enzimas son protenas, puede alterar el carcter inico de los grupos amino y carboxilo en la superficie proteica, afectando as las propiedades catalticas de una enzima. A pH alto o bajo se puede producir la desnaturalizacin de la enzima y en consecuencia su inactivacin. La concentracin de ion hidrgeno afecta a las enzimas de diversas formas. En primer lugar la actividad cataltica est relacionada con el estado inico del lugar activo. Las variaciones de la concentracin de ion hidrgeno pueden afectar a la ionizacin de los grupos de lugar activo .En segundo lugar, los cambios de los grupos ionizables pueden alterar la estructura terciaria de la enzima. Los cambios drsticos del pH frecuentemente conducen a la desnaturalizacin. La mayora de las enzimas son activas dentro de un intervalo estrecho de PH. Por esta razn. Los seres vivos emplean amortiguadores para regular estrechamente el pH. El valor de pH al que la actividad de una enzima es mxima se denomina pH ptimo, y vara considerablemente segn la enzima. EFECTO DE LA TEMPERATURA. Cuando se estudia la velocidad de una reaccin qumica en funcin de la temperatura, y en ausencia de una enzima, se observa un incremento de la velocidad conforme se aumenta la temperatura. Se debe a dos razones: A) Al incremento en el nmero de choques por unidad de tiempo, debido al aumento en la energa cintica de las molculas con la temperatura. B) Al aumento en el nmero de molculas con la energa de activacin adecuada para que el choque entre los reactivos sea productivo.

OBJETIVOS: Determinar los diversos factores que influyen en la actividad de las enzimas y la manera en la que pueden ser observados y medidos en el laboratorio, tomando como ejemplo a la ureasa producida por el frijol de soya. Determinar la influencia del inhibidor bicloruro de mercurio (HgCl2) en la reaccin catalizada por la ureasa. OBJETIVOS PARTICULARES:

Confirmar la habilidad y conocimientos de la titulacion en esta practica gracias a las prscticas anteriores. Implemetar y aprender a manejar graficas para el analisis de resultados.

Material y Metodologa.

Material y equipo. 6 tubos de ensaye grandes 3 pipetas (1,5 y 10 mL) 2 matraces Erlenmeyer de 250 mL 1bureta de 50 m L 1 soporte universal 1 pinzas de bureta 1 propipeta Gradilla para tubos de ensaye Vortex Bao Maria

Reactivos y soluciones. Urea 0.25 M Amortiguador de fosfatos 0.05 M, pH 7.2. Bicloruro de mercurio al 1% cido clorhdrico 0.1 N. Rojo de metilo al 0.04%.

Muestra biolgica Extracto de Ureasa proveniente de frijol de soya.

METODOLOGIA .
Montaje adecuado de experimento y preparacin de los reactivos as como la elaboracin de mezclas en cada tubo 1-Para la titulacin se midieron 5mL del tubo 6 (blanco) y se vertieron en un matraz de 125 mL. 2-Se agregaron dos gotas de rojo de metilo y se observo la coloracin. 3-En caso de obtener coloracin amarilla proceda a titular con acido clorhdrico. 4- Se titulo 5 m L de cada uno de los 5 tubos restantes.

En el experimento 3, se preparo los tubos y se realizo la titulacin. Midiendo como afecta la temperatura la velocidad de reaccin,

En el experimento 2 se realizo la titulacin de cada tubo as como el clculo de VTC, como se indica. Viendo como afecta la concentracin de ureasa

Se realizo esto para cada experimento partiendo del punto numero 2.

En el experimento 4, se continuo con la titulacin de cada tubo midiendo como el pH afecta la velocidad de reaccin de la ureasa.

Se recojio y limpio el material usado Se Tabularon los resultados.

RESULTADOS OBTENIDOS
DETERMINACION DEL EFECTO DE LA VARIACION EN LA CONCENTRACION DE SUSTRATO (UREA) SOBRE LA VELOCIDAD DE REACCION DE LA UREASA.

TUBO 1 2 3 4 5

M de urea inicial en cada tubo

mL de HCL 0.1 N 1.4 ml 1.2 ml 1.3 ml 1.0 ml 0.4 ml -0.2ml -0.2ml -0.2ml -0.2ml -0.2ml

VTC 1.2 X 50 1.0 X 50 1.1 X 50 0.8 X 50 0.2 X 50

M de Urea hidrolizada

10 M 20 M 40 M 100 M 150 M

60 50 55 40 10

70 60 50 40 30 20 10 0 0 20 40 60 80 100 120 140 160 150, 10 10, 60 40, 55 20, 50 100, 40

10

DETERMINACION DEL EFECTO DE LA VARIACION EN LA CONCENTRACION DE ENZIMA (UREASA) SOBRE LA VELOCIDAD DE REACCION DE LA MISMA

TUBO 1 2 3 4 5

mL de enzima inicial en cada tubo

mL de HCL 0.1 N 0.4 ml 0.5 ml 0.5 ml 0.6 ml 0.7 ml -0.2ml -0.2ml -0.2ml -0.2ml -0.2ml

VTC 0.2 X 50 0.3 X 50 0.3 X 50 0.4. X 50 0.5 X 50

M de Urea hidrolizada

0.1 ml 0.3 ml 0.5 ml 0.7 ml 0.9 ml

10 15 15 20 25

1 0.9 0.8 0.7 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0 0 5 10 15 20 25 30 10, 0.1 15, 0.3 15, 0.5 20, 0.7 25, 0.9

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DETERMINACION DEL EFECTO DE LA VARIACION DE LA TEMPERATURA SOBRE LA VELOCIDAD DE REACCION DE LA UREASA

TUBO 1 2 3 4

TEMPERATURA

mL de HCL 0.1 N 0.3 ml 0.4 ml 0.4 ml 0.3 ml -0.2ml -0.2ml -0.2ml -0.2ml

VTC 0.1 X 50 0.2 X 50 0.2 X 50 0.1. X 50

M de Urea hidrolizada

0.1C 0.3 C 0.5 C 0.7 C

5 10 10 5

12

10

0.3, 10

0.5, 10

6 0.1, 5 4 0.7, 5

0 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8

12

DETERMINACION DEL EFECTO DE LA VARIACION DEL PH DEL MEDIO SOBRE LA VELOCIDAD DE REACCION DE LA UREASA.

TUBO 1 2 3 4 5

TEMPERATURA

VTC

M de Urea hidrolizada

3.0 5.0 7.0 8.5 10

0.2 1.8 1.4

10 90 70

100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 0 2 4 6 8 10 12 7, 10 10, 70 8.5, 90

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DISCUSION En la prctica realizada se utilizaron varios factores para demostrar la actividad enzimtica, en ste caso de la ureasa, en cuando a los resultados obtenidos podemos decir que: En la determinacin del efecto de la variacin de sustrato (urea) sobre la velocidad de reaccin de la ureasa, la grafica obtenida adquiere esa forma debido a que en cada uno de los tubos fue aumentando la [S], entonces, al principio la grafica va ascendiendo, pero llega un punto en el que sta se vuelve constante, esto es porque, a esa altura la enzima se ve saturada, tomando en cuenta de que las variables [E], T y pH se encuentran constantes. En el caso de la determinacin del efecto de la variacin en la concentracin de enzima (ureasa) sobre la velocidad de reaccin de la misma, se fue agregando a cada tubo una cantidad mayor de [E], teniendo como resultado una grafica ascendente, esto debido a que la enzima no se satura y sigue formando producto, en sta caso tuvimos contantes [S], pH y T. En cuanto a la determinacin del efecto de la variacin de la T y pH sobre la velocidad de reaccin de la ureasa, la grafica que se obtuvo fue una campana de Gauss, esto se debe a que la enzima va actuar a determinada temperatura y determinado pH, aqu las constantes fueron [E] y [S].

CONCLUSIN Los objetivos planteados al principio de la prctica se llevaron acabo, ya que pudimos obtener los resultados del comportamiento de la ureasa con las diferentes variaciones y poder observar mediante las graficas el comportamiento de la enzima y poder comprender el fundamento. Tambin se obtuvieron resultados de inhibidor utilizado que fue Bicloruro de Mercurio HgCl2 comprendiendo su accin sobre la enzima.

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Bibliografa Laguna J. Y Pia,E,1992.Bioquimica.Salvat.Mexico Lehniger A., 1993. Principios de Bioquimica. 2da edicin. Ed. Manual Moderno. Mxico Pacheco Leal 2012. Bioqumica Medica, 1ra edicin. Limusa. Mxico.

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