Ctedra de Quimica Biolgica

Facultad de Ciencias Exactas, Fsicas y Naturales

Universidad Nacional de Crdoba

DOCENTES
Profesora Titular:

Dra Mara Anglica Perillo (Inv.Independiente CONICET))

Profesores Adjuntos:

Dr. Daniel A. Garca (Inv.Adjunto CONICET)

Dr. Ral H. Marn (Inv.Adjunto CONICET)

Jefes de Trabajos Prcticos

Dra. Julieta Mara Sanchez (Inv. Asistente CONICET)
Dra. Anahi del V. Turina (Inv. Asistente CONICET)
Dra. Vernica Nolan (Inv. Asistente CONICET)
Bil. Eduardo M. Clop (Becario doctoral CONICET)
Biol. Jackelyn M. Kembro (Becaria doctoral CONICET)
Biol. Benjamn Caruso (Becario doctoral CONICET)
Biol. Mariela E. Snchez (Becaria doctoral SeCyT-UNC)
Becarios
Biol.Pedro D.Clop (Becario doctoral Foncyt)
Biol.Gabriela Reiner (Becaria doctoral CONICET)
Biol. Natalia Corvalan (Becaria doctoral CONICET)
Adscripto
Biol. Leonardo Fruttero

PROGRAMA ANALTICO DE QUMICA BIOLGICA.

1. La lgica molecular de la vida
Diversidad biolgica y unidad bioqumica. Generalidades sobre metabolismo celular. Obtencin,
almacenamiento, liberacin y utilizacin de la energa. Ubicacin subcelular de la actividad metablica;
fraccionamiento subcelular por centrifugacin diferencial. Macromolculas y ensambles supramoleculares:
caracterizacin; papel del agua, efecto hidrofbico e importancia de las interacciones dbiles (puente de
hidrgeno, van del Waals) en su estructura y funcin. Propiedades coligativas de disoluciones acuosas.
Superpoblacin molecular: efectos sobre la actividad del agua y sobre la actividad y difusin de los
solutos.
2. Evolucin Bioqumica
Composicin qumica de la materia viva. Evolucin prebitica. Ribozimas. Evolucin: desde la informacin
unidimensional de la secuencia (ADN) a la informacin tridimensional de la funcin (protena).
Transferencia de informacin biolgica a nivel molecular (ADN- ARN- Protena; gradientes de carga y de
materia) y de la dinmica estructural (cambios conformacionales en protenas, catstrofe microtubular, el
citoplama celular como una matriz de percolacin de dimensin fractal). Evolucin de la estructura:
molcula, agregados supramoleculares, compartamentalizacin, aparicin de gradientes y de bombas.
Mecanismos de transduccin de energa y de seales. Evolucin de la complejidad. Patrones
bioqumicos: metabolones.
3. Estructura y funcin de las Protenas
Equilibrios cido-base en aminocidos. Unin peptdica. Protenas: estructura primaria, secundaria (hlice, hoja , giros, bucles), terciaria (motivos: patrones de clasificacin estructural) y cuaternaria.
Plegamiento: cooperatividad, estabilizacin progresiva. Desplegamiento. Cambios conformacionales y
actividad. Aislamiento, purificacin y fraccionamiento de protenas (precipitacin selectiva, cromatografas
de intercambio inico, filtracin molecular y de afinidad). Electroforsis: determinacin de la masa
molecular, nmero de protmeros y localizacin de puentes disulfuro. Ultracentrifugacin. Secuenciacin
de protenas. MALDI-TOFF. Inmunodeteccin y cuantificacin, ELISA, Western blot. Sntesis en fase
slida. Determinacin de estructura tridimensional: RMN (unidimensional y NOESY), dicroismo circular,
fluorescencia, difraccin de Rayos X. Cuantificacin de protenas.
4. cidos nucleicos y flujo de informacin gentica
Estructura qumica de los cidos nucleicos. Bases pricas y pirimdicas. Nuclesidos y nucletidos:
nomenclatura. Acido desoxirribonucleico (ADN): estructura primaria, secundaria y terciaria. Estructura de
los cidos ribonucleicos: mensajero(ARNm), de transferencia(ARNt) y ribosomal (ARNr). Duplicacin del
ADN, Transcripcin de ADN en ARN, Procesamiento del RNA, intrones y exones, Cdigo gentico.
Virus: tipos ADN-virus y ARN-virus de uno y de dos filamentos. replicacin. Virus oncognicos. El
bacteriofago : mecanismo de integracin al genoma de la celula huesped. Oncogenes. Viroides.
Plsmidos.
5. Investigacin en gentica
Ingeniera gentica: aplicaciones y obtencin del gen: por corte del ADN con endonucleasas de
restriccin, por sntesis orgnica en fase slida y a partir del ARNm. Secuenciacin por interrupcin
controlada de la replicacin. Amplificacin: PCR. Tecnologa del DNA recombinante: Unin de segmentos
de ADN de distinto origen: mtodo de las colas homopolimricas. Vectores: plsmidos semisintticos y
derivados del bacteriofago : caractersticas deseables. Introduccin del vector a la clula husped
(transformacin). Seleccin del clon con el ADN recombinante y clonado. Manipulacin de genes de
eucariotas, bibliotecas de genes a partir de ARNm. Niveles de expresin gnica, chips de genes
(microarrays). Animales transgnicos. Mutagnesis dirigida para producir protenas nuevas.
6. Investigacin en evolucin
Relaciones evolutivas a partir de secuencias de protenas. Homologas de secuencias: secuencias
alineadas, significacin estadstica (shuffling), matriz de sustitucin, bancos de datos para detectar
secuencias homlogas. Estudio de estructuras tridimensionales. Grfico autodiagonal (autoalineamiento)
para detectar secuencias repetidas. Relacin estructura/funcin: evolucin divergente y convergente.
Construccin de rboles evolutivos. Evolucin molecular en el laboratorio.
7. Bioenergtica
Estados de equilibrio y estados estacionarios. Entropa y vida. Bioenergtica: cambios de energa libre de
una reaccin. Relacin entre la constante de equilibrio y el cambio de energa libre estandar. Clculo del

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cambio de energa libre estandar y el cambio de energa libre de una reaccin redox. Reacciones
acopladas. Energtica del transporte activo. Compuestos con alto potencial de transferencia de fosfato:
factores que influyen en el cambio de energa libre estandar durante la hidrlisis.
8. Enzimologa
Enzimas clasificacin y nomenclatura. Ribozimas. Cofactores. Coenzimas: definicin: estructura qumica y
clasificacin. Coenzimas de oxido-reduccin: nicotinamida adenina dinucletido (NAD), nicotinamida
adenina dinucletido fosfato (NADP), flavina adenina dinucletido (FAD), coenzima Q (CoQ) y cido
lipoico. Coenzimas que transfieren grupos fosfato; que transfieren grupos acilo: Coenzima A (Co A). Que
transfieren grupros glicosilo. Que intervienen en reacciones de decarboxilacin: piridoxal fosfato y biotina.
Otras coenzimas. Vitaminas hidrosolubles que forman parte de coenzimas. Vitaminas liposolubles,
estructura y funcin. Estrategias catalticas.
9. Cintica Enzimtica
Mecanismo de la actividad enzimtica. Cintica. Reacciones monosustrato: el modelo de MichaelisMenten; determinacin de la Km y Vm por el mtodo deLineweaver-Burk. Activadores e inhibidores. Tipos
de inhibicin. Anlogos del estado de transicin. Anticuerpos catalticos (reconocen el estado de
transicin). Reacciones bisustrato: de desplazamiento simple y desplazamiento doble. Estrategias
reguladoras: enzimas alostricas (cintica y modelos), isozimas, modificacin covalente, escisiones
proteolticas.
10. Glcidos y Lpidos
Glcidos: Monosacridos, carbohidratos complejos, glicoprotenas, lectinas.
Lpidos: lpidos de membranas, balance hidroflico-hidrofbico, estructuras de autoagregacin.
11. Biomembranas
Estructura y funcin de la membrana biolgica. El modelo del mosaico fluido. Membranas internas de
clulas eucariotas. Membranas de clulas procariotas. Tipos de movimientos de las molculas
constituyentes. Difusin (FRAP, SPT). Fluidez (anisotropa) y curvatura. Efectos de factores fsicoqumicos y de la composicin. Protenas de membrana: extrnsecas, ancladas, intrnsecas. Prediccin de
secuencias transmembrana a partir de la estructura primaria. Secuencias sealizadotas de
direccionamiento de protenas. Fusin de membranas.
12. Transporte
Difusin: Difusin facilitada. Transporte activo.:Las bombas de Na+, K+ y Ca2+. Cotransporte y
contratransporte. Antibiticos de transporte. Medidas de conductancia: platch clamp. Sinapsis. Potenciales
de accin. Canales activados por voltaje. Canales activados por ligando. Nexus o uniones ntimas.
13. Transduccin de la informacin
Receptores de superficie. Curvas de saturacin. Receptores ionotrpicos. Receptores 7TM. Segundos
mensajeros. Conversacin cruzada. Sistema nervioso. Ultraestructura de la sinapsis. Teora qumica de la
transmisin nerviosa. El potencial de membrana. Liberacin, recaptacin y degradacin de los
neurotransmisores. Unin mioneural. El receptor nicotnico de acetilcolina: inhibidores. La acetil
coilinesterasa: inhibidores. Receptores de otros neurotransmisores.
14. Metabolismo
Metabolismo: visin de conjunto. Reacciones aclopladas. El ATP como divisa universal de energa libre.
Potencial de transferencia de grupos fosfato. Potencial de fosforilacin. Motivos recurrentes en las vas
metablicas. Transportadores activados. Evolucin de las vas metablicas.
Oxidaciones biolgicas. Enzimas de oxido-reduccin: Clasificacin y ejemplos. Metabolismo del
superxido. Gluclisis : reacciones, consumo y generacin de ATP a nivel de sustrato. Generacin de
NADH. Balance energtico. Destinos del piruvato: formacin de acetil-CoA, de etanol y de lactato. Entrada
de fructosa y galactosa. Gluconeognesis : reacciones. Ciclo de Cori: rendimiento de ATP del lactato.
15. Ciclo de Krebs
Ciclo de Krebs o de los cidos tricarboxlicos (TCA): reacciones, formacin de coenzimas reducida y ATP
a nivel de sustrato. Acoplamiento de las reacciones. Interaccin de los metabolismos de glcidos , lpidos
y proteinas. rendimiento de ATP en la oxidacin total de glucosa. Ciclo del glioxalato.
16. Fosforilacin oxidativa.

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Fosforilacin oxidativa. Ubicacin submitocondrial. Cadena Respiratoria Componentes. Niveles de
formacin de ATP. La hiptesis quimio-osmtica. Motores moleculares: ATPsintasa. Bioenergtica.
Regulacin de la fosforilacin oxidativa. Inhibidores.
17. Metabolismo de glcidos
Via de las pentosas-fosfato. Biosntesis del cido ascrbico. Degradacin intracelular del almidn y del
glucgeno: reacciones. Digestin. Interconversin de hexosas. Biosntesis del glucgeno, almidn y
celulosa: reacciones. Regulacin del metabolismo del glucgeno via AMPc. Biosntesis de disacridos.
18. Fotosntesis
Fotosntesis: ecuacin global. Ubicacin del proceso en el cloroplasto, pigmentos. Reaccin de Hill. Las
reacciones luminosas: fotosistemas I y II. Cadena transportadora de electrones. Formacin de ATP y
NADPH. Bioenergtica. Mecanismo de formacin de ATP. Reacciones enzimticas: ciclo de Calvin.
Eficiencia de la fotosntesis.
19. Metabolismo de lpidos
Biosntesis y degradacin de los triglicridos, glicerofosfolpidos y esfingolpidos. Biosntesis del colesterol
a partir de acetato. Formacin de colecalciferol y cidos biliares
Metabolismo de los cidos grasos, degradacin por -oxidacin de cidos grasos saturados de cadena
par e impar y de cidos grasos insaturados. Balance energtico.
y oxidacin. Ubicacin subcelular.
Biosntesis: sistema del citosol, reacciones. Sistemas microsomal y mitocondrial.
20. Metabolismo de amino cidos
Metabolismo de los aminocidos. Ciclo de fijacin del nitrgeno. Degradacin de los aminocidos:
reacciones de tipo general: desaminacin por transaminacin, desaminacin oxidativa, desaminacin no
oxidativa y descarboxilacin, ejemplos. Transporte del amonaco. Ciclo de la urea: reacciones. Los
aminocidos como precursores de otras biomolculas: metabolismo del triptofano, fenilalanina, tirosina,
histidina y glutamato. Glutatin. Porfirinas. Biosntesis del Hem. Hemoglobinas A, F y A2. Derivados de la
hemoglobina: oxihemoglobina, carboxihemoglobina, metahemoglobina y carbohemoglobina. Degradadcin
de la hemoglobina. Formacin de pigmentos biliares.
21. Metabolismo de cidos nucleicos
Sntesis de novo de pirimidinas. Biosntesis de bases pricas y desoxiribonucletidos. Sntesis de NAD+,
FAD, Coenzima A.
Uratos. Replicacin, recombinacin y reparacin del DNA, polimerasas,
topoisomerasas y helicasas. Fragmentos de Okazaki. Sntesis de DNA en eucariotas, ciclo celular,
telomerasa. Sntesis y maduracin del RNA. El ribosoma como estructura desupramolecular.
22. Metabolismo de protenas
Biosntesis de protenas. Codigo gentico: caractersticas. Formacin de aminoacil-ARNt. Mecanismo de
la sntesis de protenas: etapas de iniciacin, elongacin y terminacin. Modificaciones posttraduccionales. Antibiticos inhibidores. Endo y Exopeptidasas. Tipos de mutaciones.
23. Integracin metablica y control de la expresin gnica
Regulacin metablica. Control de la expresin gentica en procariotas. Oopern lac y opern trp:
induccin y represin. Control en eucariotas. Regulacin por modificacin de la actividad de la enzima:
activacin por precursor e inhibicin por producto final. Regulacin hormonal. Hormonas de mamferos:
bases moleculares del mecanismo de accin. Receptores de hormonas de estructura esteroide, peptdica
y derivada de aminocidos. Endocitocis y reciclo de los receptores. Hormonas vegetales y de insectos.
24. Inmunoqumica
Inmunoqumica. Induccin de anticuerpos especficos. La unin Ag-Ac. Heterogeneidad de los
anticuerpos. Estructura qumica de las inmunoglobulinas. Teoras sobre la formacin de anticuerpos.
25. Bioqumica de sistemas sensoriales
Olfato, gusto, visin, audicin y tacto, aspectos bioqumicos. Receptores y mecanismos de transduccin
de seales involucrados.
26. Motores moleculares
NTPasas de lazo P. Mecanismo de la contraccin muscular, asociacin cclica de la actina y miosina.
Microtbulos, tubulina, quinesina y dinena. Movimiento flagelar en bacterias, motor rotativo; quimiotaxis.

PROGRAMA SINTTICO DE QUMICA BIOLGICA .

1. La lgica molecular de la vida
2. Evolucin Bioqumica
3. Estructura y funcin de protenas
4. cidos nucleicos y flujo de informacin gentica
5. Investigacin en gentica
6. Investigacin en evolucin
7. Bioenergtica
8. Enzimologa
9. Cintica Enzimtica
10. Glcidos y lpidos
11. Biomembranas
12. Transporte
13. Transduccin de la informacin
14. Metabolismo
15. Ciclo de Krebs
16. Fosforilacin oxidativa
17. Metabolismo de glcidos
18. Fotosntesis
19. Metabolismo de lpidos
20. Metabolismo de amino cidos
21. Metabolismo de cidos nucleicos
22. Metabolismo de protenas
23. Integracin metablica y control de la expresin gnica
24. Inmunoqumica
25. Bioqumica de sistemas sensoriales
26. Motores moleculares

TRABAJOS PRACTICOS
TP 1: Espectrofotometra.
TP 2: Purificacin, cuantificacin y anlisis estructural de protenas
TP 3, 4 y 5. Cintica Enzimtica
TP 6: Fotosntesis.
TP 7: Mecanismos de transduccin de energa

OBJETIVOS GENERALES DE LA ASIGNATURA.

Al terminar el curso el estudiante deber:
Adquirir una clara comprensin del metabolismo celular a la luz de conceptos de:
- Mecanismos de transduccin de energa y de informacin.
- Termodinmica, cintica y catlisis de reacciones bioqumicas
- Importancia de la compartamentalizacin en la generacin de gradientes qumicos y
electroqumicos.
- Modulacin dinmica de la estructura y funcin de biomembranas, protenas y de la organizacin
compleja del citoplasma
- Vas metablicas fundamentales y su integracin
- Patrones bioqumicos y su evolucin
Desarrollar del pensamiento crtico.
Adquirir destreza en el uso de metologas del laboratorio bioqumico

BIBLIOGRAFIA
Bioqumica General
- Blanco, A. Qumica biolgica, Ed.El Ateneo, 2006.
- Bezkorovainy, A, Rafelson M.E. Concise Biochemistry. Ed. Marcel Dekker, New York, 1996*.
- Harper, H.A, Manual de Qumica Fisiolgica. Ed. El manual moderno 1980*
- Horton, R.H, Moran, L.A., Ochs, R.S., Rawn, J.D., Scrimgeour, K.G. Bioqumica. Ed.Pentice Hall,
Hispanoamericana, SA. Mexico, 1995, 1999*.
- Lehninger, Albert L.. Principios de bioqumica . 2Ed., Omega, Barcelona, 2001.

7
- Nelson, David L.. Lehninger : principios de bioqumica .3 Ed., Omega, Barcelona, 2001.
- Stryer L, Berg, JM y Tymoczko, JL. Bioqumica, 5 Ed., Revert SA, Espaa, 2003.
- Torres, H.M., Carminatti H. Y Cardini E. Bioqumica General. Ed. El Ateneo, Bs.As. 1983*.
- Voet D., Voet JG, Pratt C.W. Fundamentos de Bioqumica. La vida a nivel molecular, Ed. Mdica
Panamericana. 2006.
- Walker, J. M.. Biologa molecular y biotecnologa .2 Ed. Acribia, Zaragoza, 1997.
Problemas
- Esteban J.M. y Cavanillas J.M.. Problemas de Qumica. Ed. Alhambra. 4a. Espaa. 1976.
- Holme, David J. . Resolucin de problemas de bioqumica analtica, Acribia, Zaragoza, 1996.
- Segel I.J. Clculos en Bioqumica. Acribia. Saragoza. Espaa. 1972.
Bibliografa de consulta sobre temas especficos
Qumica General, Qumica Orgnica y Qumica-Fsica
- Atkins, P.N y M.J Clugston. Principios de Fisicoqumica. 1986. Addisson-Wesley. Ed. Iberoamericana.
Mxico.
- Atkins, P.W. Fisicoquimica. Ed. Addison-Wesley Iberoamericana, S.A. Wilmington, Delaware, USA.1991
- Brown, T. L., LeMay, H. E.
y Bursten, B.E.. Qumica, La Ciencia Central. Prentice-Hall
Hispanoamericana, S.A., Quinta Edicin. 1993.
- Morris, J.G. Fisicoqumica para bilogos. Ed. Revert. Barcelona. 2002.
- Whitten, W.K y K.D Gailey. Qumica General. Ed. Interamericana. Mxico. 1986.
Biofsica-Qumica y Biologa Celular
- Alberts, B. . Biologa molecular de la clula , 3 Ed., Omega, Barcelona, 1996-2002.
- De Robertis, E.M.F.. Biologa celular y molecular de Eduardo D. P. De Robertis .12 Ed., El Ateneo,
Buenos Aires, 1998.
- Estrada Cerqueda, C.. Cintica del transporte a travs de membranas, Ed. Blume, Madrid, 1976.
- Grigera, J.R. Introduccin a la biofsica del agua, Eudeba, Buenos Aires, 1976.
- Maggio B. Introduccin a la biofsico-qumica. Ed.Gonzalez Truccone. Crdoba, Argentina. 1987*.
- Vicente Crdoba, C.. Biofsica, Ed.Sntesis, Madrid, 1992
Cintica enzimtica
- Segel I.H.. Enzyme kinetics. Behavior and analysis of rapid equilibrium and steady-state enzyme
systems. Wiley Classics Library Editions. Wiley Intersci.Pub., New York. 1993*.
- Neilands J.B., Stumpf P.K., Principios de enzimologa. Ed Aguilar. 1967.
- Methods Enzimology ed. Colowick-Kaplan vol. XXXI
Fotosntesis
- Andreo C., Vallejos R. Fotosntesis. Serie Biologa, monografa no 30 OEA, 1984.
- Hall D.O., Rao K. Fotosntesis. Ed. Omega, Barcelona, 1977.
- Tribe M y Whitaker P. Cloroplastos y motocondrias. Ed.Omega, Barcelona, 1977.
Anlisis Bioqumico e Instrumental
- Gore M.G.. Spectrophotometry and Spectrofluorometry A practical Approach. Ed. Oxford University
Press. Inc. NY. USA. 2000.
- Henry RJ, Cannon D.C. y Winkelman J.W. Qumica Clnica: Bases y Tcnicas. Tomo I. 2a Ed. Jims.
Barcelona. Espaa.1980*.
- Willard H.H. Merritt Jr. .L, y Dean J.A.. Mtodos Instrumentales de Anlisis. Ed. CECSA. Mxico. 1974.
- Skoog D.A. y West D.M.. Anlisis Instrumental. Ed.Interamericana. Mxico. 1975.
- D'Ocon Navaza, Mara Carmen. Fundamentos y tcnicas de anlisis bioqumico, Paraninfo, Madrid,
1999.
Bibliografa especializada
- Aon M.A. and Cortassa S. Dynamic Biological Organization. Fundamentals As Applied To Cellular
Systems. Chapman and Hall, London, UK. 1997*.
- Daune, M.. Molecular Biophysics. Structures in motion, Oxford University Press, Oxford. 1999*.
- Makishima, Shoji. Pattern dynamics : a theory of self-organization, Ed. Kodansha Scientific, Tokio, 2001.
La bibliografa citada est disponible en la Biblioteca Ricardo Lutti" (Centro) de la FCEFyN, UNC.
* disponibles en la Ctedra de Qumica Biolgica.

CRONOGRAMA
CLASES TERICAS:

Comienzan: 11de marzo

Finalizan: 26 de junio

TRABAJOS
PRCTICOS

Semana

CLASES TERICAS
Aulas 219 o 218
Mircoles
1215-1415 hs
Aula 219

Laboratorio 13
2o Semana
1o Semana
Comisiones Comisiones
1-3-5
2-4-6

TEMA

Viernes
10-12 hs
Aula 218

TEMA

11/03/09

La lgica molecular de la
vida

13/03/09

Metabolismo.
Evolucin Bioqumica

18/03/09

Protenas

20/03/09

Protenas

25/03/09

cidos nucleicos

27/03/09

Investigacin en
gentica

01/04/09

Investigacin en evolucin
/ Bioenergtica

03/04/09

Cintica Enzimtica

08/04/09

Cintica Enzimtica

10/04/09

Feriado
(Semana Santa)

15/04/09

Enzimologa

17/04/09

Glcidos / Lpidos

22/04/09

Biomembranas

24/04/09

Transporte

29/04/09

Transduccin de seales

01/05/09

06/05/09

Gliclisis
Gluconeognesis
Glucgenolisis

08/05/09

10

13/05/09

Ciclo de Krebs
Cadena Respiratoria

15/05/09

TP5
PRIMER EXAMEN
Cintica III y
PARCIAL
Seminario 1

11

20/05/09

Fotosntesis

22/05/09

Fotosntesis / Ciclo de
Calvin

12

27/05/09

Metabolismo de lpidos

29/05/09

Metabolismo de
lpidos

13

03/06/09

Metabolismo de
aminocidos/ Biosntesis
de Nucletidos

05/06/09

Biosntesis de cidos
nucleicos

12/06/09

Regulacin de la
expresion gnica

19/06/09

Bioqumica de
sistemas sensoriales

14

10/06/09

Biosntesis de protenas

15

17/06/09

Integracin metablica /
Inmunoqumica

16

24/06/09
01/07/09

SEGUNDO EXAMEN
PARCIAL
Recuperatorio
Ex.Parciales

26/06/09

Feriado (Da de
Trabajador)
Interconversin de
hexosas; Va de las
pentosas

Recuperatorio TP
y FIRMA REGULARIDAD

TP 1
Espectrofoto
metra
TP 1*
Espectrofoto
metra
TP 2*
Protenas
TP2
Protenas *
TP3
Cintica I
TP3
Cintica I
TP4
Cintica II *
TP4
Cintica II

TP5
Cintica III y
Seminario 1
TP6
Fotosntesis
TP6
Fotosntesis
TP7
Transduccin
de energa y
Seminario 2
TP7
Transduccin
de energa y
Seminario 2

CONDICIONES PARA EL CURSADO

Correlativas regularizadas: Qumica Orgnica y Fsica I.

TRABAJOS PRCTICOS
Concurrir con guardapolvo, gafas, guantes, calzado adecuado (cerrado) y cabello recogido.
No podr realizar el TP aquel alumno que concurra sin estos elementos mnimos de seguridad personal.

ASISTENCIA:
Clases Tericas: no obligatoria
Trabajos Prcticos: 80% obligatoria
ACTIVIDADES
Clases tericas: Exposicin.
Discusin de problemas tericos.
Trabajos prcticos:
Resolucin de problemas.
Trabajos de laboratorio.
Seminarios de discusin de trabajos cientficos.

EVALUACIONES
I. Trabajos Prcticos:
a) Evaluacin oral durante el desarrollo del TP. Se tendr en cuenta: desempeo, destreza, atencin, participacin,
puntualidad, y la presentacin de Trabajos Cientficos (cuando corresponda).
b) Una evaluacin escrita al final de cada TP. El resultado de la evaluacin estar disponible en el TP siguiente.
II Exmenes Parciales:
Se tomarn 2 (dos) exmenes parciales sobre temas desarrollados en clases tericas y prcticas.
Los alumnos debern inscribirse para rendir estos parciales durante la semana previa al parcial (al final de las clases
tericas). La inscripcin no es personal.
CONDICIONES PARA LA REGULARIZACIN
Desempearse satisfactoriamente durante los TP (item a) y aprobar el 80% de los TP (6 de las 7 evaluaciones escritas
de los Trabajos Prcticos (item b). Las evaluaciones de los TP se aprueban con el 60% de las respuetas correctas o
alcanzando el 60% de los contenidos de TP.
CONDICIONES PARA LA PROMOCIN:
Correlativas Aprobadas (al comenzar el cursado): Qumica Orgnica y Fsica I
Aprobar el 80% de los TP
Alcanzar un promedio de 7 puntos entre ambos Exmenes.Parciales, con una nota no inferior a 4 puntos.
RECUPERATORIOS (al final del cuatrimestre)
Se podr recuperar:
- Un TP que haya resultado reprobado, para alcanzar las condiciones indicadas ms arriba.
En caso de inasistencia, podr recuperarse el TP, slo por causa debidamente justificada, en alguna Comisin donde
el mismo an no se hubiera dictado. En el caso de inasistencias no habr recuperatorio al final del cuatrimestre..
- Un examen parcial (por cualquier razn: inasistencia, reprobado o para aumentar nota).

FIRMA DE REGULARIDADES
Se realizar el mismo da y horario del recuperatorio de TP. La firma de libretas se realiz unicamente ese dia.
El trmite no es personal.

10

NORMAS BASICAS DE TRABAJO Y SEGURIDAD EN LABORATORIOS1

INDICE
1. ORGANIZACIN DEL TRABAJO
2. HABITOS PERSONALES
3. MANIPULACIN EN LABORATORIOS.
4. MEDIOS DE PROTECCIN
4. ACTUACIN EN CASO DE ACCIDENTES
5. TELFONOS IMPORTANTES

Pg.
11
11
12
14
14
15

TEMAS
1. ORGANIZACIN DEL TRABAJO
La organizacin del laboratorio, debe ser estudiada a fondo y procurar que sea adecuada para
el mantenimiento de un buen nivel preventivo.
No debe trabajar nunca una persona sola en el laboratorio fuera de horas habituales, por la
noche o en operaciones con riesgo.
Cuando se realicen operaciones con riesgo, incluso las personas que no intervengan en ellas
deben estar informadas de las mismas.
Deber trabajarse en las campanas extractoras siempre que se manipulen productos txicos,
inflamables y/o que se desprendan en el proceso. En stas deber comprobarse
peridicamente el funcionamiento del extractor, su estado general, el cumplimiento de los
caudales mnimos de aspiracin, que su uso sea el adecuado, etc.
La programacin de trabajos con productos qumicos, deber ir acompaada de la adopcin de
medidas preventivas que se requiera en cada caso.
Deber comprobarse la ventilacin general del laboratorio.
Los reactivos almacenados en el laboratorio deben preservarse del sol, no guardarse en
estanteras altas, cuidar su etiquetado y mantenerlos en las cantidades imprescindibles. No
deber haber botellas con lquidos inflamables, incluso las botellas empezadas o los reactivos
preparados con mezclas de productos inflamables. Ha de controlarse que las botellas una vez
utilizadas, se cierren correctamente.
Est prohibido fumar, beber y comer en los laboratorios.
Los envases para recuperar se enjuagarn y colocarn, sin taponar, para el posterior proceso
de lavado.
No se permitir la presencia de personas no autorizadas y debidamente informadas de los
riesgos inherentes en el laboratorio.
2. HABITOS PERSONALES
Mantener en todo momento guardapolvos, camisas y vestidos abrochados.
No abandonar objetos personales en mesas de trabajo o poyatas.
No comer o beber en los laboratorios.
No guardar alimentos ni bebidas en las heladeras del laboratorio.
No fumar en los laboratorios.
Llevar recogidos los cabellos.
No llevar pulseras, anillos, colgantes o mangas anchas que pudieran engancharse en
los montajes.
Los guardapolvos no debern llevarse a lugares de asistencia comn como son las bibliotecas,
cafeteras, salas de reuniones, comedores etc.
1

Extrado de Seguridad y condiciones de trabajo en los laboratorios del CSIC-Espaa.

11

No es aconsejable guardar la ropa de calle en la mesada del laboratorios, para lo cual deber
disponerse de armarios o lugares especficos fuera del rea de trabajo.
Es recomendable usar gafas de seguridad cuando se manipule con productos qumicos
lquidos de cualquier tipo en ebullicin.
Si la naturaleza del trabajo lo requiere, el personal del laboratorio deber utilizar los medios de
proteccin adecuados.
No utilizar lentes de contacto en el laboratorio, ya que en caso de accidentes por salpicaduras
de productos qumicos o sus vapores, al pasar por detrs de las lentes, podran provocar
lesiones en el ojo antes de retirarlas. En estos casos se recomienda el uso de gafas graduadas.
Si un producto qumico salpica a los ojos, utilizar inmediatamente un lavaojos y lavarlos durante
15 minutos sin interrupcin. Actuar con urgencia en menos de 10 segundos. No dirigir una
corriente de alta presin directamente al ojo porque podria lesionarse. Es necesario mantener
los ojos abiertos con ayuda de los dedos para el lavado debajo de los prpados.
Lavarse las manos: antes de abandonar el laboratorio, siempre que se quiten los guantes
protectores y despus de toda operacin que haya comportado el posible contacto con material
irritante, custico, txico o infeccioso.
Para secarse las manos, en vez de toallas es preferible el uso de papel desechable o
secadores de aire.
La persona que al trmino de la jornada sea la ltima en abandonar el laboratorio deber
asegurarse que los procesos que no queden en funcionamiento, las conducciones de agua y
gas estn cortadas, la energa elctrica desconectada y que el local se encuentra en un estado
que excluya el riesgo de incendio.
3. MANIPULACIN EN LOS LABORATORIOS
Laboratorios con riesgo qumico
Toda persona que manipule un producto qumico, deber tener conocimiento de sus
caractersticas fsico-qumicas y toxicolgicas.
Debern conocerse, como mnimo, las frases de riesgo y seguridad (R y S ) de los productos.
Como norma general, cualquier manipulacin de una sustancia qumica deber realizarse
dentro de las vitrinas de laboratorio.
No llenar los tubos de ensayo ms de la mitad de su volumen total.
Calentar los tubos de ensayo de lado y utilizando las pinzas.
Utilizar en todo momento gradillas y soportes.
Tomar los tubos de ensayo con los dedos, nunca con las manos.
No llevar tubos de ensayo ni productos en los bolsillos.
No calentar nunca un recipiente totalmente cerrado. Cuando se caliente, dirigir siempre la
abertura en direccin contraria a uno mismo y a las dems personas cercanas.
Transportar los productos en bandejas o recipientes para evitar derrames en caso de
roturas.
No oler productos qumicos si no se est debidamente informado .
No tocar con las manos ni probar los productos qumicos.
En caso de producirse una contaminacin se limpiar la zona y no podr utilizarse
hasta tener seguridad de su descontaminacin utilizando los productos adecuados en cada
caso y que deben conocerse previamente.
No tocarse ninguna parte del cuerpo, material o instrumental con los guantes contaminados. En
el caso de que esta circunstancia hubiera ocurrido, limpiar con los productos adecuados y
eliminar los elementos utilizados en la limpieza, como residuos txicos.
No efectuar pipeteos con la boca. Se realizar con peras de goma para pipetas o pipetas de
seguridad.
No trabajar separado de la mesa.
Para el encendido de mecheros, utilizar encendedores piezoelectricos; no emplear fsforos
ni encendedores de bolsillo.
Los mecheros no debern dejarse encendidos sin vigilancia.
Asegurarse del enfriamiento de los materiales antes de aplicar directamente las manos

12

para tomarlos.
Al finalizar una tarea u operacin, recoger materiales, reactivos, equipos, etc, evitando las
acumulaciones innecesarias y dejando la zona de trabajo en las debidas condiciones de
limpieza.
Al terminar el trabajo, asegurarse de la desconexin de los aparatos, agua, gases, etc.
Emplear y almacenar sustancias inflamables en las cantidades imprescindibles.
Deber ponerse especial cuidado en cerrar botellas y frascos inmediatamente despus de
su utilizacin.
No transportar frascos o recipientes tomados por la tapa o tapn.
Siempre que sea posible se trabajar en bandejas con el fin de confinar un posible
derrame. Ser muy conveniente forrar con papel de filtro dichas bandejas.
Siempre que sea necesario, debern utilizarse guantes especficos para los productos que
se manipulan.
Los guantes y todo material contaminado con productos txicos y /o infecciosos debern
descontaminarse y/o esterilizarse antes de ser eliminados. Cuando no se utilicen guantes en la
manipulacin de sustancias qumicas, las manos debern lavarse frecuentemente. Al finalizar la
sesin de trabajo, es aconsejable un lavado cuidadoso antes de abandonar el laboratorio.
Las puertas de los laboratorios debern permanecer cerradas durante la jornada de trabajo.
Deber mantenerse la limpieza y el orden en los laboratorios en todo momento.
Debern mantenerse libres los espacios de trabajo, as como las zonas de paso y salida de los
recintos.
No utilizar nunca un equipo o aparato sin conocer perfectamente su funcionamiento.
Antes de comenzar un experimento asegurarse de que los montajes y aparatos estn en
perfectas condiciones de uso. Ante cualquier mnima duda consultar con el responsable del
trabajo.
Los trapos o materiales ensuciados con aceite o sustancias inflamables debern colocarse en
recipientes cerrados que debern vaciarse diariamente y su contenido ser neutralizado.
Las instalaciones, aparatos e instrumentos destinados a reparacin, debern enviarse limpios,
sin trazas de sustancias qumicas nocivas.
Antes de utilizar sustancias inflamables deberemos asegurarnos de que no hay cerca
mecheros encendidos, calentadores etc.
No debe dejarse sin vigilancia ningn tipo de reaccin qumica.
Al finalizar un experimento los productos debern etiquetarse y colocarse en lugar seguro.
Las sustancias cuya disolucin sea exotrmica, debern disolverse por porciones, agitando y
enfriando continuamente.
Durante la destilacin de sustancias inflamables de bajo punto de ebullicin, deber controlarse
la llegada de agua al refrigerante y alejar del aparato cualquier otra materia inflamable.
Cuando se derrame alguna sustancia combustible se proceder a:
- Apagar el mechero, si ha lugar.
- Cortar la corriente elctrica en el exterior del laboratorio.
- Asegurar una ventilacin eficaz.
- Se absorber el lquido con un cuerpo poroso que posteriormente se depositar en
un lugar sin peligro.
- Se eliminar como residuo txico.
Las sustancias qumicas debern estar colocadas en recipientes con materiales adecuados y
etiquetados debidamente. Los recipientes debern estar cerrados.
Los recipientes que contengan lquidos debern estar protegidos contra la accin directa de los
rayos solares o contra el calentamiento.
Los metales alcalinos como sodio o potasio debern conservarse con una capa protectora de
un solvente con un punto de ebullicin elevado (petrleo, aceite de parafina) y el fsforo blanco
con una capa de agua.
Los productos incompatibles debern guardarse separadamente.
Los recipientes que contengan productos agresivos no debern almacenarse a una altura
superior a sesenta y cinco cm. Y sern recipientes de pequea capacidad para su fcil manejo.

13

4. MEDIOS DE PROTECCIN
El trabajo en laboratorios requiere la utilizacin de guardapolvos, que en trabajos con riesgo
deber considerarse el tejido de los mismos.
Los guardapolvos debern tener los puos ajustados a las muecas. Asimismo, debern estar
cerrados en la parte delantera y en el cuello.
Tener siempre a disposicin las gafas de seguridad. Es recomendable el uso permanente de
las mismas. Estas sern de uso personal.
Utilizar los guantes adecuados para cada tarea que requiera el uso de tales prendas.
Conocer la proteccin brindada por los distintos equipos de proteccin individual para las
vas respiratorias.
Conocer la aplicacin de los productos de primeros auxilios del botiqun y los
mecanismos para recibir posibles ayudas exteriores.
Mantener en condiciones de uso las duchas de emergencia y lavaojos.
Conocer y ensayar el funcionamiento de equipos extintores.
5. ACTUACIN EN CASO DE ACCIDENTES
5.1 Derrames
. Lquidos inflamables
Absorber con carbn activado productos especficos.
Alejar cualquier foco de calor.
. cidos
Neutralizar con bicarbonato o emplear productos especficos comercializados para su
neutralizacin o absorcin.
Si por casualidad se ha producido un derrame sobre la piel, el remedio inmediato sera exponer
la zona afectada al chorro de agua del grifo durante cinco o diez minutos.
Las duchas de emergencia sern utilizadas en los casos en que la zona afectada del cuerpo sea
grande. Es necesario quitar la ropa contaminada de la persona afectada mientras est bajo la
ducha. Si se produjesen quemaduras se precisar la asistencia mdica.
No utilizar cremas ni pomadas grasas en las quemaduras graves.
.Bases
Emplear productos especficos comercializados para su neutralizacin y absorcin.
.Otros lquidos no corrosivos ni inflamables
Absorber con aserrn.
5.2. Salpicaduras.
En piel y ojos
Deben lavarse con abundante agua (si es en los ojos, mediante un lavaojos).
No intentar neutralizar. Acudir al mdico con prontitud.
En la ropa
Debe quitarse rpidamente la ropa, lavndola , o colocarse bajo la ducha, segn la magnitud de
la impregnacin.
Si hay contacto con la piel, lavar la zona afectada y acudir al mdico.
5.3. Cortes
Se debern lavar con abundante agua corriente durante diez minutos como mnimo. Si son
pequeos y dejan de sangrar en poco tiempo, Lavar con agua y jabn y taparlos con una venda
o apsito adecuados. Si son grandes y no dejan de sangrar, se requiere asistencia mdica
inmediata.
5.4. Ingestin
Si es un cido o una base. Beber abundante agua, salvo que la sustancia ingerida reaccione con
ella.
No provocar el vmito, salvo indicacin expresa.

14

Disponer de informacin sobre los productos que se manipulan, consultando a un servicio de

informacin toxicolgica cuando sea posible.
Si la persona est inconsciente, Ponerlo en posicin inclinada con la cabeza de lado y estirarle
la lengua hacia fuera. Taparlo para que no coja fro.
Acudir al mdico con una etiqueta del producto.
5.5. Inhalacin
Conducir a la persona afectada a un lugar con aire fresco.
Al primer sntoma de dificultad respiratoria, iniciar la respiracin artificial boca a boca.
Tratar de identificar el vapor txico.
5.6. Incendio
Dar la alarma inmediatamente
Apagar los fuegos pequeos tapndolos sin utilizar agua.
Escoger adecuadamente el tipo de extintor, recordando el modo de empleo y la duracin de la
carga. No utilizar nunca sobre una persona.
Si prende fuego la ropa:
-Tenderse en el suelo y rodar sobre si mismo para apagar las
llamas. No correr ni intentar llegar a una ducha de emergencia salvo que est muy cercana.
-Se le cubrir con una manta apagafuego, llevarle a una ducha de
emergencia o hacerle rodar por el suelo. Una vez apagado el fuego, mantener a la persona
tendida procurando que no coja fro y proporcionarle asistencia mdica.
Si se evacua el laboratorio, cerrar las puertas al salir.
.Comportamiento ante un incendio en un local donde existan botellas de gases
La elevada temperatura provoca un aumento de la presin interna de la botella pudiendo
explotar.
Las botellas que puedan activar el fuego no debern abrirse, cerrando las que estn en servicio.
Siempre que se pueda se desalojaran de la zona del incendio y si se han calentado se
refrigeraran con chorro de agua fra para disminuir la presin interna, avisando de ello al
suministrador.
En caso de intervenir el Cuerpo de Bomberos se les advertir de la presencia de stas
indicndoles, cuantas son, donde estn y contenido.
6. TELFONOS IMPORTANTES
En todos los laboratorios debe haber un listado telefnico con los Centros de URGENCIA que
enumeramos a continuacin, el cual ser de conocimiento general.
ECCO (visitantes y alumnos)

44666666

BOMBEROS

100

4686868

SEGURIDAD INTERNA
ART

(Docentes y Becarios SeCyT)

(Becarios CONICET) La Caja

Taxi

EMI 4149093
0-800-8880200
4650303

15

NORMAS BSICAS DE TRABAJO Y SEGURIDAD EN

LABORATORIOS

He ledo las NORMAS BSICAS DE TRABAJO Y SEGURIDAD EN

LABORATORIOS incluidas en la Gua de Trabajos Prcticos de Qumica Biolgica
(Ciencias Biolgicas-Facultad de Ciencias Exactas, Fsicas y Naturales-Universidad
Nacional de Crdoba) y estoy al tanto de las medidas de seguridad de trabajo en el
laboratorio.

Nombre y Apellido: ..
DNI: .
N de Matrcula:

Firma: ..

Completar, firma, cortar y entregar al Jefe de Trabajos Prcticos en la

primera clase prctica.
Los contenidos sern objeto de evaluacin en el primer TP.

16

17

TRABAJO PRACTICO N 1
ESPECTROFOTOMETRA
Los problemas y la gua de estudio debern ser resueltos por los alumnos antes de concurrir a la clase. En
caso de necesitar aclarar dudas los docentes estrn disponibles en sus horarios de consulta, en la ctedra.
Los alumnos sern evaluados al final del TP (evaluacin escrita) y durante el desarrollo de la experiencia
prctica (evaluacin oral), sobre los contenidos que se encuentran en la gua de TP.
Debern concurrir con guardapolvo, gafas, guantes, cabello recogido y calzado cerrado.

OBJETIVOS:
- Conocer los fundamentos tericos y las aplicaciones de la espectrofotometra.
- Comprender las propiedades que deben reunir los mtodos experimentales de anlisis.
- Adquirir destreza en el manejo del espectrofotmetro.
- Valorar la importancia del dominio de tcnicas auxiliares para poderlas aplicar con criterio ante los problemas
planteados.

TEMAS PARA REPASAR:

-

Disoluciones.
Estequiometra.
Luz. Teora ondulatoria. Teora cuntica.
Ondas electromagnticas. longitud, frecuencia,
perodo de una onda y unidades en que se miden.
Relacin entre velocidad, longitud de onda y
frecuencia. Energa de ondas electromagnticas.

PROPIEDADES DE LOS MTODOS QUMICOS DE ANLISIS

Exactitud: es el grado en que la medida promedio se aproxima al valor real. La determinacin de la
exactitud se logra comparando los resultados observados con el valor real. Expresa la correccin de una
medicin.
Precisin: es el error debido al azar, la variacin de los resultados obtenidos con una tcnica cuando la
misma muestra se analiza repetidamente. Expresa la reproducibilidad de una medicin. Cuanto menor sea
la variacin observada, mayor es la precisin.
Sensibilidad: es la variacin mnima en la cantidad de un compuesto que puede ser detectada, o la
mnima cantidad significativamente diferente del blanco.
Especificidad: es la propiedad del mtodo de medir slo la especie qumica en estudio, sin la
interferencia de otras que puedan estar presentes. Todo mtodo exacto es preciso, pero un mtodo
preciso no es necesariamente exacto.

ERRORES EN LAS MEDICIONES DE LABORATORIO

Error: es la diferencia entre el valor observado y el real, es decir, la combinacin del error sistemtico y el
error debido a la falta de precisin. Los errores pueden dividirse en dos clases: 1) errores determinados, 2)
errores indeterminados.
Errores determinados: son aquellos cuya magnitud puede determinarse:
a) errores instrumentales y debidos a aparatos y reactivos: balanza y pesas, aparatos volumtricos,
material de vidrio calibrado, reactivos, etc.;
b) errores operativos: son de naturaleza fsica, asociados con manipulaciones en un anlisis.
c) errores personales: errores operativos del analista.
d) errores del mtodo: tienen origen en las propiedades qumicas y fisicoqumicas del sistema analtico.
Errores indeterminados o aleatorios: son pequeas fluctuaciones en los sucesivos valores de una
cantidad medida. No son evitables ni previsibles por parte del observador. Pueden tratarse por mtodos

18
estadsticos. Dada una cantidad de datos el analista puede estimar la incertidumbre introducida por
errores aleatoreos y concluir con respecto al efecto de esos errores en un resultado analtico.

ESPECTROFOTOMETRA
La espectrofotometra es una tcnica que permite medir la absorcin de radiacin electromagntica,
ultravioleta y visible de numerosas especies qumicas inorgnicas y orgnicas, para su anlisis cuali y
cuantitativo.
Las molculas son capaces de absorber radiaciones electromagnticas. Tanto la longitud de onda de la
radiacin absorbida como la eficiencia con que se absorbe, dependen de:

la estructura de la molcula y
el medio en que se halla.

En el proceso de absorcin de la radiacin, un fotn incidente cede su energa a una molcula, lo que da
lugar a la excitacin de la misma que pasa a un nivel de energa superior:
h.
A

A*

A = molcula absorbente
A* = molecula absorbente en estado de excitacin energtica.
h. = energa de un fotn
donde h= Constante de Planck y : frecuencia de radiacin.
Los estados excitados de los tomos o molculas son de vida media corta (10-9 s) y, en
consecuencia, la molcula en estado excitado vuelve rpidamente al estado fundamental. Comunmente,
la energa es liberada al medio como calor, pero en ciertos casos la especie qumica excitada puede sufrir
un cambio (reaccin fotoqumica) o emitir parte de la energa absorbida como radiacin electromagntica
de longitud de onda mayor a la incidente (fluorescencia o fosforescencia).

LEYES DE LA ABSORCION
Cuando la luz atraviesa una muestra, slo una fraccin de ella es transmitida. La proporcin de luz
transmitida se denomina Transmitancia (T) y se calcula de la siguiente manera:
T = I / I0
Donde I = la intensidad de luz transmitida por la muestra
I0 = la intensidad de luz incidente
La transmitancia toma valores entre 0 1. Tambin se expresa como porcentaje si se multiplica por 100 y
sus valores estn en el rango de 0-100%:
%T = (I / I0 ) x 100
La relacin (I / I0 ), tambin puede ser expresada como luz absorbida en lugar de luz transmitida. En ese
caso nos referimos a la Absorbancia (A) de una muestra.
La Absorbancia es adimensional, vara en el rango de 0 - y se define como:
A = log 1/T = log10 (I0 / I)

19
Por sustitucin se comprueba que la absorbancia y el porcentaje de transmitancia estn relacionados
mediante la siguiente expresin:
A = log (100 / %T)
A = 2 - log( % T)

LEY DE LAMBERT:
La fraccin de luz absorbida por un medio transparente es independiente de la intensidad
de luz incidente, y cada capa sucesiva del medio, absorbe una fraccin igual de la luz que pasa a travez
de l.
Esto lleva a un decaimiento exponencial de la intensidad de luz a lo largo del paso ptico
en la muestra, que puede ser expresado matemticamente como sigue:
Log10 (I0/I) = A = K b
Donde b = la longitud del paso ptico de la cubeta de espectrofotometra y K es una constante del medio,
que fue descifrada por Beer.

LEY DE BEER:
La cantidad de luz absorbida es proporcional al nmero de molculas de cromforo que la
luz atraviesa.
La constante K, es proporcional a la concentracin de cromforo (c) : K = a c , donde a es
la absortividad o coeficiente de absorcin, una propiedad del cromforo en s misma.
La absortividad a es una constante que depende de:
la longitud de onda de la luz incidente,
la identidad de la sustancia analizada y
del medio en que sta se encuentre (pH, solvente e interaccin con otras sustancias)
La constante a representa la probabilidad de absorcin a una longitud de onda determinada
La LEY DE LAMBERT Y BEER queda resumida entonces, en la expresin:
Log10 (I0/I) = a c b
A=acb
Cuando el paso ptico est expresado en cm y la concentracin en M, la absortividad se denomina
-1
-1
coeficiente de extincin molar o absortividad molar (), entonces sus unidades son M cm .
Cuando b=1 cm, la absorbancia se denomina Densidad ptica (DO)

DETERMINACIN DE LA CONCENTRACIN DE SOLUTO EN UNA SOLUCIN

Dadas una disolucin de concentracin desconocida a la que llamaremos problema y otra
disolucin de concentracin conocida a la que llamaremos testigo, aplicando la ley de Lambert y Beer a
cada disolucin se obtienen las siguientes expresiones:
Ap=a.b.cp

At=a.b.ct

Dado que el problema y el testigo son disoluciones de una misma sustancia cuyos valores de
absorbancia se determinan a la misma , los valores de absortividad sern iguales. Adems, dado que se
utiliza la misma cubeta para medir la A, los valores de b tambin sern iguales.
En consecuencia:

Dividiendo m.a.m.
a.b.cp
Ap/ At = __________
a.b.ct

20
Ap.ct
podemos simplificar a y b, y al despejar queda:

cp=
At

donde Ap= absorbancia del problema.

At= absorbancia del testigo.

cp = concentracin del problema.

ct = concentracin del testigo.

CURVA DE CALIBRACIN
Una curva de calibracin es un grfico de A o %T en funcin de la concentracin de soluto; su
empleo es necesario en los trabajos cuantitativos en los que hay que calcular la concentracin del
absorbente. En general se grafica A en funcin de la concentracin (Fig.1a) pero, hay instrumentos que
slo miden %T (Fig.1b). En ste caso, deben transformarse las lecturas de %T en valores de A, mediante
el empleo de la ecuacin A = 2 - log( % T).
Alternativamente, puede trazarse el grfico de %T en funcin de la concentracin en papel
semilogartmico (Fig.1c). De otro modo, resultara difcil utilizando un nmero limitado de puntos obtenidos
experimentalmente, comprobar grficamente si la lectura sigue o no la ley de Lambert y Beer .
Papel semilogartmico
b

%T

Concentracin (mg/ml)

%T

Concentracin (mg/ml)

Concentracin (mg/ml)

Fig.1: Curvas de Calibracin

Por consideraciones del error fotomtrico, debe procurarse que los puntos situados entre valores
de A de 0,1 y 1,0 (10% y 80% T) sean representados de la forma ms exacta posible al trazar la grfica.
Las escalas del sistema de registro del aparato son: lineal para %T y logartmica para A: por ste
motivo, el error en las lecturas de %T es constante en toda la escala, lo cual no ocurre con la A. Sin
embargo, debido a que A y concentracin se relacionan proporcionalmente, en la prctica se lee A.
En equipos con visores digitales, es posible trabajar con disoluciones con 0,1>A>1,0, como se indica ms
arriba. En los equipos donde los valores de A se determinan de acuerdo a la posicin de una aguja que se
mueve sobre una escala (galvanmetro), la aplicacin de esta tcnica se limita a muestras que produzcan
lecturas comprendidas entre 0,1 y 0,3, dado que en este rango de valores an es posible interpolar datos
en la escala logartmica. Valores menores pueden estar por debajo de la sensibilidad del equipo y, a
valores mayores, las menores divisiones de la escala son muy pequeas y la apreciacin de las lecturas
resulta poco precisa.

ESPECTRO DE ABSORCIN
Las soluciones absorben energa preferentemente en una ms regiones del espectro
electromagntico, siendo la absorcin inferior o nula en las dems regiones. Se denomina Espectro de
absorcin a la representacin grfica de la probabilidad de absorcin en funcin de la longitud de onda.
El espectro de absorcin se determina midiendo la absorbancia a distintas longitudes de onda para
establecer la longitud de onda de mxima absorcin ( max).
En el siguiente ejemplo, la max es aproximadamente 420nm (indicada por la fecha).

21
0.20

Fig. 2. Espectro de Absorcin

Absorbancia

0.15

0.10

0.05

0.00
300

max
350

400

450

500

Long onda (nm)

ESPECTROFOTMETRO
Las mediciones de absorbancia se realizan en un espectrofotmetro, que bsicamente consta
de una fuente de luz, un monocromador para seleccionar la longitud de onda, una cubeta transparente
para contener la muestra, un detector de intensidad luminosa y un sistema de registro (Fig. 3).

Sistema de
Registro

Fig. 3. Esquema de un espectrofotmetro

MEDICION DE LA ABSORBANCIA
1) Si tenemos una solucin coloreada de concentracin desconocida, la denominamos tubo problema.
Podemos conocer su concentracin midiendo la absorbancia en el fotocolormetro o espectrofotmetro a
una longitud de onda apropiada.
2) Previamente a la lectura, el aparato es llevado a cero de absorbancia con un tubo que contiene
solvente sin la sustancia problema y se denomina blanco. Este tubo puede contener varias sustancias,
adems de disolvente, a la misma concentracin en que se encuentra en el tubo problema, excepto la
sustancia que se desea cuantificar. Por ej. si la sustancia coloreada problema se encuentra disuelta en
agua conteniendo NaCl al 1% e KOH al 2%, el tubo blanco contendr NaCl al 1% e KOH al 2% en agua,
sin la sustancia en estudio. La finalidad de usar el tubo blanco es descontar la absorcin de sustancias
que no sean especficamente la sustancia problema y as poder medir la absorbancia propia de la
sustancia en estudio.
3) Un tercer tubo que denominamos testigo corresponde a una solucin de concentracin conocida de la
sustancia en estudio. Se prepara disolviendo una cantidad conocida de soluto en un volumen conocido de
solvente conteniendo las mismas sustancias que la solucin problema: por ej. NaCl al 1% e KOH al 2%
para el caso que se est analizando. Se lee al espectrofotmetro, llevado previamente a cero de

22
absorbancia con el blanco, de la misma forma que se hizo con el tubo problema. Finalmente, la
concentracin del tubo problema se puede calcular mediante la interpolacin del valor de absorbancia en
una curva de calibracin (para lo cual es necesario la preparacin de varios tubos testigos) o mediante la
comparacin con un testigo.
4) Lo descripto en los puntos anteriores es vlido para medir la concentracin de sustancias incoloras
siempre que estas sustancias sean capaces de reaccionar con otras, dando productos de reaccin
coloreados y que el color finalmente obtenido sea proporcional a la concentracin de la sustancia en
estudio. El tubo blanco, el cual no contiene la sustancia que desarrolla color, deber ser tratado de forma
similar al tubo problema y a los testigos, es decir tendr los mismos reactivos y se los procesar de forma
similar y paralela a los otros tubos. Hay sustancias incoloras que tienen la propiedad de absorber la luz
ultravioleta; en estos casos pueden ser cuantificadas sin tratamiento previo, midiendo la absorbancia a
una comprendida entre 200 y 400 nm (correspondiente al rango de luz ultravioleta).

GUIA DE ESTUDIO
1. Observe el esquema del espectro electromagntico de la Fig.4 y compare c (velocidad), (longitud de
onda), (frecuencia) y energa de la radiacin electromagntica indicada.
2. Defina luz blanca y luz monocromtica.
3. Qu tipos de monocromadores conoce ?
4. Qu efecto produce la absorcin de la luz por una molcula?
5. Existe alguna restriccin con respecto a la longitud de onda de la luz que una sustancia puede
absorber?
6. Cul es la utilidad de un espectro de absorcin?
7. Concepto de ley de Lambert y Beer.
8. Definicin de absorbancia y transmitancia.
9. Cmo se preparan y qu utilidad tienen los tubos blanco, testigo y problema?
10. Cmo construye y qu utilidad tiene una curva de calibracin ?
11. Cmo elige la longitud de onda de trabajo?
12. Cul es el fundamento qumico del mtodo de Biuret para cuantificar protenas?

Fig. 4: Espectro Electromagntico

Color

(m)

x 10

Violeta

3.90 4.55

7.69 6.59

Azul

4.55 4.92

6.59 6.10

Verde

4.92 - 5.77
5.77 5.97

6.10 5.70
5.70 5.03

5.97 6.22

5.03 4.82

6.22 7.80

4.82 3.84

Amarillo
Naranja
Rojo

23

(Hz) x 10-17

E = h.

E=

h.c

PROBLEMAS
1- Una disolucin de protenas de concentracin desconocida, se diluye 5 veces con agua destilada. A
partir de esta dilucin, se vuelve a diluir 3 veces con agua destilada. Esta ltima dilucin di por mtodo
Biuret una absorbancia de 0,12 (testigo de concentracin = 4 mg/ml, di 0,25 de absorbancia).Cul es
la concentracin de la solucin original de protenas? R = 28,8 mg/ml.
2- Una solucin de protenas de concentracin desconocida, di por mtodo de Biuret una A = 0,09
(testigo de concentracin 4mg/ml di A = 0,25 ).De dicha solucin se desea tomar 100 ug. Qu
volumen de dicha solucin se debe pipetear? R = 69 l.
3- Interprete el significado de las sig. curvas de calibracin para la cuantificacin de protenas por el
mtodo de Biuret. Cul de ellas corresponde a un esquema de trabajo correcto?
2

1
Absorbancia

Concentracin (mg/ml)

4- Los datos de la Tabla 1 corresponden a absorbancias de una solucin de flunitrazepam 25 M en etanol 3% V/V y
en tris HCL 50 mM, pH 7,4 medidos a diferentes longitudes de onda:

210

220

250

260

270

280

290

320

330

340

350

360

370

0.2

0.604

0.446

0.407

0.320

0.286

0.272

0.250

0.190

0.120

0.070

0.040

0.020

a)Grafique el espectro de absorcin y coloque el ttulo correspondiente.

b)Qu longitud de onda elegira para realizar una curva de calibracin?
c) Cmo se prepar el tubo blanco?
d) Es necesario descontar el blanco cada vez que se cambia la longitud de onda? Si-No. J.S.R.
5- El siguiente es un protocolo de trabajo para la cuantificacin de ADN en base a su contenido de
desoxirribosa empleando el reactivo de difenilamina.

24
Blanco
NaCl 1M

Testigo

Problema

1ml

ADN 100g/ml

1 ml

en Nacl 1M
ADN [ ] desc en
NaCl 1M
difenilamina

2ml

Volumen final

a) Complete los espacios en blanco.

b) Por qu coloca NaCl 1M y no agua destilada en el blanco?
c) Cmo realizara una curva de calibracin si slo cuenta con una solucin de ADN de 100 g/ml?
d) Qu precauciones debe tener al elegir las concentraciones de los testigos?
e) Cmo corregira este protocolo en los casos en que: 1-la absorbancia del problema sea >> 0,3 y 2la absorbancia del problema sea << 0,1 ?
f) Por qu deben tener todos los tubos igual volumen final?
6- Calcular la absorbancia que corresponde a cada uno de los siguientes valores de transmitancia:
a) 0%

b) 0,2%

c) 0,8%

d) 1,52%

e) 68%.

7- Calcule el coeficiente de extincin molar del p-nitrofenol si A = 0,2 y la concentracin es 11.428 oles/l,
= 410 nm y b = 1 cm. R = 17.500
8- Se cuantific una solucin de tirosina por absorcin al UV. Esta solucin dio A = 0,16 ; calcule la
concentracin nM de tirosina considerando que dicha solucin haba sido diluida primero 3 veces y
luego 2 veces ms. = 14.000 l.mol-1 . cm-1 , = 274 nm. R = 6,85.10-5 M.
9- Una solucin de una sustancia de PM 600 a una concentracin de 40 g/ml tiene A = 0,3 a 540 nm,
medida en una cubeta de 1 cm de paso ptico. Calcule el coeficiente de extincin molar. R = 4.500
10- Una solucin contiene dos flavonoides : flavonoide 1 (F1) y flavonoide 2 (F2). Se quiere cuantificar
ambos sin una purificacin previa. Analizando la Fig. 6 se observa que entre 220 nm y 420 nm sus
espectros se superponen, por lo tanto la cuantificacin de cualquiera de ellos interfiere con la del otro.
A longitudes de onda superiores a 420 nm slo absorbe F1. Calcule la concentracin molar de F1 y
F2 en sa solucin sabiendo que:
Testigo de F1

Absorbancia

F1

Testigo de F2

c1 = 15 M

c2 = 15 M

A350 = 0,105

A350 = 0,195

A450 = 0,293

F2

Solucin problema (mezcla de F1/F2)

c1 = ?

c2 = ?

A350 = 0,25
A450= 0,3

Respuesta:

0
250

300

350

400

450 500

Longitud de onda (nm)

-5

concentracin de F1=1,54.10 M.

concentracin de F2=1,09.10-5 M.

25
EJERCITACION ADICIONAL
1- Calcule el nmero de moles, micromoles y milimoles que hay en 2g de Na(OH) (PM=40).
2- Qu cantidad de glucosa (PM=180) tiene que pesar para preparar 200 ml de una solucin 0,05 M?
R = 1,8 g.
3- Qu volumen de una solucin 10 mM se puede preparar con 1 g de glucosa (PM=180). R = 555,6 ml.
4- Si tiene 3 litros de una solucin de Na(OH) 0,5 M, Cuntos moles y que concentracin molar poseen
los siguientes volmenes: a) 50 ml; b) 0,25 ml; c) 1 litro.
R: a) 0.025 moles, 0.5 M; b) 1.25 x 10-4 moles, 0.5 M; c) 0.5 moles, 0.5 M
5- Qu molaridad tiene una solucin que contiene 60 gr de NA(OH) (PM=40) por litro? R: 1.5 M.
6- Qu cantidad de NA(OH) (PM=40) estan contenidos en 3 litros de una solucin 2.5 M ? R: 300gr.
7- Una solucin de cido sulfrico al 98% P/P, cuya densidad es 1.8 g/cm3, qu molaridad tiene? R: 18
M.
8- Cul ser la molaridad de una solucin de cido clorhdrico (PM=36.5) al 37% P/P cuya densidad es
1.19 g/cm3?. R: 12 M
9- Cmo procedera para preparar 2 litros de una solucin de ClK 10 mM a partir de una solucin 3 M ?
R: tomar 6.67 ml (3 M). colocarlos en un matraz de 2 litros enrasar con agua destilada.
10-Se quieren preparar 6 litros de una solucin 0.25 M de cido sulfrico a partir de una solucin 63% P/P
3
(densidad=1.7 g/cm ). Qu volumen debe tomar?. R: 137,28 ml.
11-Los siguientes son los resultados de la cuantificacin de H2SO4 en una misma muestra realizado por
un mtodo "A" por cuatro analistas diferentes:
a- 50,00 % P/P, densidad= 1,3952 g/ml
b- 70,00 % P/V
c- 7,00 M
d- 7100 mM
De acuerdo al enunciado anterior diga:
a-Cmo procede para comparar los resultados anteriores?
b-Que puede decir acerca de la precisin del mtodo empleado en la cuantificacin?
DATOS: PM H2SO4 = 98,08
12-Se desea investigar los efectos de flunitrazepam sobre el comportamiento de ratas en situacin de
"stress". Para ello cuenta con dos lotes de cinco ratas de 300 g cada una. El lote N1 (experimental) es
inyectado con una solucin de flunitrazepam 67M en cloruro de sodio 0,8775 % P/V (solucin
fisiolgica).
a) Cmo procede para preparar 100 ml de dicha solucin ?
b) Cul es la utilidad del segundo lote de ratas? Con qu inyecta esas ratas? Cmo prepara esa
solucin?
c) Si la dosis de flunitrazepam cuyo efecto se desea investigar es 70 g/kg de peso corporal, qu
volumen debe inyectar a cada animal?.
DATOS: flunitrazepam = droga slida , PMflunitrazepam = 313,3 PACl = 35,5 PANa = 23
13-

En el siguiente grfico se muestran espectros de absorcin de varias sustancias. Cul de las

longitudes de onda indicadas elegira para luego trabajar con un fotocolormetro y cul para trabajar

26
con un espectrofotmetro? Estos espectros fueron obtenidos con un espectrofotmetro o con un
fotocolormetro? Podria obtener un espectro como el B si slo dispusiera de un fotocolormetro para
analizar su muestra?

Absorbancia

0.4
0.3

B
A

0.2
0.1

0.0

300

450

600

750

Long Onda (nm)

14- La siguiente tabla corresponde a absorbancias de soluciones estndares de albmina srica bobina:
[Albmina] (Mx103)

a) Se cumple la ley de Lambert y Beer en este intervalo de

concentraciones?
b) Si no fuera as. Cul es el lmite superior de concentracin
del rango lineal?
c) Determinar la concentracin de albmina cuya absorbancia
medida en las mismas condiciones experimentales es 0,116.

0.2

0.033

0.5

0.081

1.25

0.195

3.12

0.440

7.81

0.703

15- Se desea investigar el contenido de glucosa en sangre despus de la administracin por va oral de
0,5 g de dicho compuesto. Se trabaj con un grupo de 20 ratas de 2 meses de edad, peso promedio
300 g. Se tomaron muestras de sangre a 0, 30, 45, 60, 90 y 120 minutos despus de la ingestin y se
determin en suero la cantidad de glucosa por un mtodo fotocolorimtrico, expres como el valor
promedio en mg % P/V de glucosa en sangre. (Tabla 4). En otro experimento se tom otro grupo de
20 ratas con las mismas caractersticas y sometidas al mismo tratamiento que las anteriores. Una
hora antes del experimento fueron inyectadas por va endovenosa con 200 l de una solucin 20 M
de Glucagn (el glucagn es una hormona pancretica que incrementa el nivel de glucosa por la
estimulacin de la degradacin de glucgeno en higado) (Tabla 5).
a) Identifique para cada experimento la variable dependiente y la independiente. J.S.R
b) Grafique los resultados y coloque ttulo a los mismos.
c) Indique la ecuacin matemtica a la que se ajustan los datos.
TABLA 4
mg % p/v glu/sangre

TABLA 5
tiempo min

mg % p/v glu/sangre

tiempo min

70

140

105

30

175

30

122

45

195

45

140

60

210

60

175

90

260

90

210

120

290

120

16Postule dos modelos de experimentacin donde pueda identificar variables dependientes e

independientes.

27

PARTE PRACTICA
CUANTIFICACIN DE ALBMINA POR EL MTODO DE BIURET

FUNDAMENTO DEL MTODO DE BIURET (Gornall, A.G et al., 1949, J. Biol. Chem., 177-766):
Las sustancias que contienen dos -CONH2 ; -CH2NH2; -C(NH)(NH2); o -CSNH2, unidos, sea
directamente entre s, o a travs de un tomo de carbono o nitrgeno; y las estructuras peptdicas que
contengan como mnimo dos enlaces peptdicos, en presencia de Cu++y en solucin alcalina, forma un
complejo de color violeta, el complejo de Biuret.
O

NH
RC H
O

C
NH
RC H

HN
Cu2+

H CR
C

HN
H CR

Violeta-prpura
Complejo protena-Cu(II)
El nombre de la reaccin procede del compuesto coloreado llamado Biuret que se forma cuando
se calienta la urea a una temperatura de unos 180C, en presencia de Cu++y en medio alcalino.
NH2
O

180 C

NH2

UREA

2+

NH
O

C
NH

NH2

NH2

NH2

C
NH2

+ NH2

NH2

Cu

NH2

C
NH

BIURET
O

NH2

Cu2+

NH2
O

HN

HN

NH2

NH2

Complejo Cu-Biuret
Esta reaccin tambin es producida, naturalmente, por los enlaces peptdicos de las protenas y
es el fundamento de la tcnica del biuret para la determinacin de protenas en suero u otros lquidos
biolgicos.
El mtodo de biuret desarrollado por Gornall et al. permite cuantificar soluciones que contengan entre 1 y
10 mg de protenas por mililitros.
MATERIALES Y MTODOS:
Reactivo de biuret: Disolver 1,5 g de sulfato de cobre (CuSO4.5H2O) y 6g de tartrato de sodio y potasio
tetrahidratado en 500ml de agua destilada. Agitando constantemente, aadir 300ml de Na(OH) al 10%.
Diluir hasta 1 litro con agua destilada y guardar en frasco de plstico.
Solucin testigo: Albmina bovina a una concentracin de 5mg/ml en agua destilada.

28
Protocolo: En el tubo blanco colocar 1 ml de agua destilada; en el tubo testigo colocar 1 ml de solucin
testigo de albmina; en el tubo problema colocar 1 ml de la solucin problema. Agregar a cada uno de los
tubos 4 ml de reactivo de biuret, agitando y dejar en reposo a temperatura ambiente durante 30 minutos.
Con el tubo blanco llevar a cero de absorbancia al fotocolormetro (550 nm). Luego leer el tubo problema y
el tubo testigo.
En el trabajo prctico se prepararn varios tubos testigos a los fines de construr una curva de calibracin

RESULTADOS
Tubo
T1
T2
T3
P

Absorbancia

[Proteinas] (mg/ml

29
DISCUSIN

BIBLIOGRAFA
- Problemas de Qumica. J.M. Esteban y J.M. Cavanillas. Ed. Alhambra. 4a. 1976. Espaa.
- Clculos en Bioqumica. I.J.Segel. Ed. Acribia. Saragoza. Espaa. 1972.
- Mtodos instrumentales de anlisis. H.H. Willard,.L.Merritt Jr., y J.A.Dean. Ed. CECSA. Mxico. 1974.
- Anlisis Instrumental. D.A. Skoog y D.M. West. Ed.Interamericana. Mxico. 1975.
- Qumica Clnica: Bases y Tcnicas. R.J. Henry, D.C. Cannon y J.W. Winkelman. Tomo I. 2a Ed. Jims. Barcelona.
Espaa.1980.
- Lehninger Principles of Biochemistry. David L. Nelson & Michael M. Cox. Worth Publishers. 3 Ed. NY. USA.2000
- Spectrophotometry and Spectrofluorometry A practical Approach. Edited by Michael G. Gore. Ed. Oxford University
Press. Inc. NY. USA. 2000.

30

TRABAJO PRACTICO N 2
PURIFICACIN, CUANTIFICACIN Y ANLISIS ESTRUCTURAL DE PROTENAS
Los alumnos debern concurrir con la tarea de investigacin (por escrito) sobre tcnicas para estudios de
protenas que les fue asignada por el docente en el TP anterior. Se har una puesta en comn de la
informacin obtenida por cada grupo. Sern evaluados en forma escrita al final de esta clase.

OBJETIVOS
- Conocer los fundamentos tericos de las tcnicas utilizadas en la purificacin y caracterizacin de protenas.
- Valorar la importancia del dominio de diferentes tcnicas y del conocimiento acerca de las caractersticas
particulares de la protena a purificar, para poder aplicarlos con criterio.
- Adquirir y aplicar herramientas tericas para la resolucin de los problemas planteados.

TEMAS PARA REPASAR

1- Estructura de Protenas. Abreviaturas de los nombre de los aminocidos: cdigo de 1 y 3 letras.
2- Equilibrio Acido-Base de amino cidos y de protenas.
3- Coeficiente de sedimentacin.
4- Enzimas de restriccin.
5- Concepto Actividad especfica
6- Tema 3 del programa de la materia.

TCNICAS UTILIZADAS EN EL ESTUDIO DE PROTENAS:

1- Fraccionamiento subcelular
por centrifugacin diferencial y
por gradiente de sacarosa.
2- Precipitacin salina.

1-Espectrofotometra

ANALISIS DE
ESTRUCTURA
1- Espectrofluorimetra

2- Espectrofluorimetra

2- Dicroismo circular

3- Dilisis.

3- Elisa

3- RMN

PURIFICACIN

4- Cromatografa de filtracin por

gel.
5- Cromatografa de intercambio
inico.
6- Cromatografa de afinidad.
7- Cromatografa lquida de alta
presin.
8- Electroforesis en geles.
9-Isolelectroenfoque y
electroforesis bidimensional.

CUANTIFICACIN

4- FTIR
5- MALDI-MS
6- Secuenciacin
7-Perfil hidroptico
8-Difraccin de rayos X
9- Comparacin de
secuencias.

ANALISIS DE
ACTIVIDAD
1- Actividad
enzimtica
2- Unin de
radioligandos
3-Formacin de
complejo Ag-Ac
4- Conductancia
a iones

31

PROBLEMAS
1-

Forma y Dimensin (a) La tropomiosina, una protena muscular de 70 kDa, est formada por un
superhelicoide de -hlices con dos hebras. Calcular la longitud de la molcula. (b) Suponer que un
segmento protico de 40 residuos se pliega en una estructura -antiparalela de dos hebras con un
giro en horquilla de 4 residuos. Cul es la longitud mxima de este motivo?

2-

La ubicacin lo es todo. Las protenas transmembranas contienen a menudo -hlices. Teniendo en

cuenta que el interior de las membranas es muy hidrofbico, predecir qu tipo de aminocidos habra
en estas hlices. Porqu una -hlice es especialmente adecuada para encontrarse en el entorno
hidrofbico del interior de una membrana?

3-

Especies menores. En un aminocido como la alanina la forma principal a pH 7 en disolucin es la

zwitterinica. Suponiendo un valor de pKa de 8 para el grupo amino y un valor de pKa de 3 para el
cido carboxlico, calcular la proporcin entre la concentracin de la forma neutra del aminocido y
(con el cido carboxlico protonado y el grupo amino neutro) y la forma zwitterinica a pH 7.

4-

Mensaje oculto. Traducir la siguiente secuencia de aminocidos en cdigo de una letra: Leu-Glu-AlaArg-Asn-Ile-Asn-Gly-Ser-Cys-Ile-Glu-Asn-Cys-Glu-Ile-Ser-Gly-Arg-Glu-Ala-Thr.

5-

Concentrado en la concentracin. Una disolucin de una protena cuya secuencia incluye tres
residuos de triptofano, sin residuos de tirosina, ni de fenilalanina, tiene una absorbancia de 0,1 a 280
nm en una celda de 1 cm de paso ptico. Obtener la concentracin de la protena en unidades de
molaridad. Si la protena tiene una masa molecular de 100 kd, hallar la concentracin en miligramos
de protena por mililitro de disolucin.

6-

Movimiento lento. La tropomiosina, una protena muscular de 93 kDa , sedimenta ms lentamente

que la hemoglobina (65 kDa). Sus coeficientes de sedimentacin respectivos son 2,6 S y 4,31 S.
Cul es la carcteristica estructural responsable de su lentitud en la sedimentacin?

7-

Esferas que sedimentan Cual es la dependencia entre el coeficiente de sedimentacin S de una

protena esfrica y su masa? Cunto ms rapidamente sedimentar una protena de 80 kDa que
una de 40 kDa?

8-

Determinacin del tamao. Las movilidades electroforticas relativas de una protena de 30 kDa y
una de 92 kDa utilizadas como estndar en un gel de SDS-poliacrilamida son, respectivamente, 0,8 y
0,41. Cul es la masa aparente de una protena que tiene una movilidad de 0,62 en este gel?

9-

Una asociacin nueva? El gen que codifica una protena que tiene un nico puente disulfuro
experimenta una mutacin que sustituye un residuo de serina por uno de cistena. Se quiere
comprobar si el apareamiento de los sulfhidrilos en este mutante es el mismo que en la protena
original. Proponer un experimento que resuelva esta cuestin.

10- Elegir la columna. El octapptido AVGWRVKS se digiri con tripsina. a) Sera el intercambio inico o
la exclusin molecular la tcnica ms apropiada para separar estos productos? Explicarlo (b) Suponer
que el pptido se digiere con quimiotripsina. Cul sera la tcnica de separacin ptima? Explicarlo
11- Haciendo ms enzima? Durante la purificacin de una enzima un investigador realiza un paso de
purificacin que produce un incremento en la actividad total dando un valor mayor que el que est
presente en el extracto crudo. Explicar como se puede incrementar la actividad total.

32
12-

Problema de purificacin de protenas. Completar la siguiente tabla

Procedimiento de
purificacin
Extracto puro

Precipitacin con
(NH4)2SO4
Cromatografa DEAEcelulosa
Cromatografa de
exclusin molecular
Cromatografa de
afinidad

Protena
total (mg)

Actividad
total

20 000

4.000000

5000

3.000000

1500

1.000000

500

750 000

45

675 000

Actividad
especfica

Nivel de
purificacin

Rendimiento
(%)

100

13- Estructura cuaternaria. Una protena se purific hasta la homogeneidad. La determinacin del peso
molecular por cromatografa de exclusin molecular da 60 kDa. La cromatografa en presencia de
urea 6 M da una especie de 30 kDa. Cuando se repite la cromatografa en presencia de urea 6 M y mercaptoetanol 10 mM, aparece una especie molecular nica de 15 kDa. Describir la estructura de la
molcula.
14- Secuencia de protenas I. Determinar la secuencia de un hexapptido basndose en los siguientes
datos. Nota: Cuando no se conoce la secuencia, los aminocidos se separan con una coma.
(ver datos en la Tabla de ruptura especfica de los polipptidos, al final de la gua).

Composicin de aminocidos
Anlisis N-terminal del hexapptido
Digestin por tripsina
Digestin por carboxipeptidasa
Digestin por quimiotripsina

15-

(2R,A,S,V,Y)
A
(R,A,V) y (R,S,Y)
no hay digestin
(A,R,V,Y) (R,S)

Secuencia de protenas II. Determinar la secuencia de un pptido de 14 aminocidos en base a los

siguientes datos.

Composicin de aminocidos
Anlisis N-terminal del pptido
Digestin por carboxipeptidasa
Digestin por tripsina
Digestin por quimiotripsina
Anlisis N-terminal del pptido
Tratamiento con bromuro de ciangeno

(4S,2L,F,G,I,K,M,T,W,Y)
S
L
(3S,2L,F,I,M,T,W) y (G,K,S,Y)
(F,I,S) (G,K,L) (L,S) (M,T) (S,W) (S,Y)
(F,I,S), S
(2S,F,G,I,K,L,M*,T,Y) (2S,L,W)

33
DATOS
1 residuo de -hlice contribuye con 1.5 a la longitud total de la -hlice.
1 residuo de hoja plegada contribuye con 3.5 a la longitud total de la estructura .
1 residuo = 110 D

Ruptura especfica de los polipptidos

Reactivo - Ruptura qumica
Lugar de ruptura
Bromuro de ciangeno
O-Iodobenzoato
Hidroxilamina
2-Nitro-5tiocianobenzoato
Ruptura enzimtica
tripsina
clostripana
Proteasa de Staphylococcus

trombina
quimiotripsina
Carboxipeptidasa A

Lado carboxilo de los residuos metionina

Lado carboxilo de los residuos triptofano
Enlaces asparragina-glicina
Lado amino de los residuos cistena

Lado carboxilo de los residuos lisina y arginina

Lado carboxilo de los residuos arginina
Lado carboxilo de los residuos aspartato y
glutamato (el glutamato solo en ciertas
condiciones)
Lado carboxilo de los residuos arginina
Lado carboxilo de los residuos tirosina,
triptofano, fenilalanina, leucina y metionina.
Lado amino del aminocido C-terminal (salvo
arginina, lisina y prolina)

BIBLIOGRAFA
- Lehninger Principles of Biochemistry. David L. Nelson & Michael M. Cox. Worth Publishers. 3 Ed. NY.

USA.2000
- Stryer L, Berg, JM y Tymoczko, JL. Bioqumica, Ed. Revert SA, 5Ed. Espaa 2003.

34

TRABAJO PRCTICO N 3
CINTICA ENZIMTICA I
En la primera semana (Cintica Enzimtica I) se discutirn los aspectos tericos y, en la segunda y tercera
semana (Cintica Enzimtica II y III) se desarrollar la parte experimental. Los alumnos sern evaluados al
finalizar cada T.P de cintica (I, II y III) acerca de todos los apectos tericos del tema y de los fundamentos
de las tcnicas utilizadas.
Debern concurrir con guardapolvo, gafas, guantes, cabello recogido y calzado cerrado.

OBJETIVOS
- Conocer el mecanismo por el cual transcurren las reacciones catalizadas por enzimas.
- Comprender como influyen el tiempo de incubacin, la concentracin de enzima, la concentracin de sustrato,
temperatura, pH, y la presencia de inhibidores sobre la velocidad inicial y la concentracin de producto formado en
reacciones catalizadas por enzimas Michaelianas. - Interpretar el significado de las constantes cinticas KM y Vmax.
- Valorar la importancia del trabajo prolijo y ordenado para la obtencin de resultados confiables.

TEMAS PARA REPASAR

- Soluciones amortiguadoras,
- pH,
- Fotocolorimetra.

INTRODUCCIN
Las enzimas son catalizadores biolgicos de naturaleza protica. Una determinada enzima (E) se combina
con un determinado sustrato (S) formando un complejo enzima-sustrato (E-S) el cual se descompone para
dar el producto (P) y enzima libre (E):

E+S

ES

E+P

La mayora de las reacciones biolgicas transcurren lentamente si no son catalizadas; las enzimas hacen
que el equilibrio de esas reacciones sea alcanzado rpidamente. Varios factores como a) el tiempo de
incubacin; b) la concentracin de enzima; c) la temperatura del medio; d) el pH y e) la concentracin de
sustrato influyen en el transcurso de la reaccin.

a) TIEMPO DE INCUBACIN: en la Fig. 1 se observa la variacin de las concentraciones de complejo enzimasustrato (E-S), de sustrato [S] y de producto [P], en funcin del tiempo. La velocidad inicial (Vo)
corresponde a la velocidad medida dentro de un lapso de tiempo lo suficientemente corto como para que
la cantidad de sustrato consumido sea despreciable respecto a la cantidad de sustrato inicial (en la
prctica menos del 5% del total). La velocidad se expresa como la cantidad de producto formado por
unidad de tiempo (por ej. moles/min)

[P]

Fig.1. Variacin de la concentracin de las

especies qumicas que participan en una
reaccin catalizada por enzimas, en funcin
del tiempo. [E]: concentracin de enzima; [S]:
concentracin de sustrato; [ES]: concentracin
de
complejo
enzima-sustrato;
[P]:
concentracin de producto.

[S]
[E]
[ES]

tiempo

35
b) CONCENTRACIN DE LA ENZIMA: Velocidad en funcin de la concentracin de enzima. La concentracin
de enzima ptima se elige un rango de concentracin de enzima tal que la velocidad inicial (Vo) sea
directamente proporcional a la concentracin de la enzima

Fig 2. V elocidad de reaccin

vs concentracin de enzima

E
Concentracin
de enzima ptima
c) EFECTO DE LA TEMPERATURA DE INCUBACIN: Dentro de ciertos lmites, la velocidad de reaccin aumenta
con la temperatura. En general la velocidad se duplica a cada incremento de unos 10C y viceversa.
Existe una temperatura ptima, por encima de esta, la velocidad decrece rpidamente por
desnaturalizacin de la enzima. La temperatura de mxima actividad no corresponde necesariamente a la
temperatura de mxima estabilidad.
Fig.4. Actividad enzimtica vs temperatura
% Actividad
mxima

Temperatura
d) EFECTO DEL PH DEL MEDIO DE INCUBACIN: Cambios moderados en el pH afectan el estado inico de la
enzima y con frecuencia tambin del sustrato. En general , la actividad ptima se encuentra entre pH 5 y
pH 9 como la tripsina. ver Fig.5., sin embargo algunas enzimas como la pepsina Fig.6 tiene su ptimo a
valores de pH bastante alejados de dichos lmites. A valores extremos de pH se produce desnaturalizacin
de la enzima.

Actividad

Actividad

10

pH

pH

A partir de estos grficos se puede determinar las constantes cinticas que caracterizan a una enzima: KM
(constante de Michaelis) y Vmax (velocidad mxima), para un sustrato y en condiciones determinadas.
KM: este valor corresponde a la concentracin de sustrato necesaria para alcanzar una velocidad igual a la
mitad de la Vmax

36
Vmax: es la velocidad que se alcanza cuando la enzima est saturada con sustrato (a altas
concentraciones de sustrato).
e) EFECTO DE LA CONCENTRACIN DE SUSTRATO: Variacin de la velocidad inicial en funcin de la
concentracin de sustrato. Si aumenta la concentracin de S, mientras permanecen constantes las dems
condiciones, V0 crece hasta un valor mximo. La velocidad crece hasta que la enzima es saturada por el S
y se alcanza la velocidad mxima (Vmax).
Vo

1
Vo

(a)

(b)

Vmax
1
Vmax

Vmax
2

[S]

1
KM

1
[S]

Fig.6 (a) Curva de MichaelisMenten de Vo en funcin de la concentracin de S; (b) Grfico de

Lineweaver-Burk o de dobles recprocas.

GUA DE ESTUDIO
1. Catalizadores.
2. Enzimas. Caractersticas. Sitio activo de una enzima: caractersticas. Cofactor. Coenzima. Holoenzima.
3. Clasificacin de enzimas.
4. Ubicacin de las enzimas en la clula.
5. A que se llama sustrato y producto?.
6. Mecanismo de accin de las enzimas.
7. Alteran las enzimas el equilibrio de la reaccin?
8. Cmo se mide la concentracin de una enzima?.
9. Qu es la actividad especfica de una enzima y en qu unidades se expresa?.
10. Factores que influyen en una reacin catalizada por enzimas.
11. Funcin de Michaelis Menten. Representacin grfica.
12. Velocidad inicial. Velocidad mxima. Unidades.
13. Porqu se debe trabajar a velocidad inicial?
14. KM. Unidades. Cmo se determina?
15. Ecuacin de Lineweaver-Burk. Representacin grfica.
16. Inhibicin reversible e irreversible, concepto. Inhibidores competitivos y no competitivos, concepto.
Cmo se diferencian? cmo son las curvas de las directas e inversas de la velocidad en funcin de la
concentracin de sustrato?.

37

PROBLEMAS
1. Explique el siguiente grfico
V

Tiempo

2. a. Grafique velocidad en funcin de concentracin de sustrato

b. Grafique la inversa de velocidad en funcin de la inversa de la concentracin de sustrato.Identifique en
cada una de estas curvas Km y Vm.
3. Qu relacin existe entre Km y la afinidad de una enzima por un determinado sustrato?
4. Cundo la concentracin de sustrato es igual a Km, Como es la velocidad inicial?
5.Qu relacin exste entre Km y sustrato cuando la reaccin catalizada por la enzima alcanza el 80% de
la Vm?
6. Para medir la actividad cataltica de la fosfatasa cida de higado de rata, la preparacin enzimtica fue
obtenida homogenizando 0.5 g de hgado en 10 ml de buffer. Se incubaron 0.2 ml de la preparacin
enzimtica a pH 5 y 37C en presencia de Ca++ durante 6' , en un volumen de 0.4 ml, el cual fue diluido a
4 ml para detener la reaccin. Calcule los moles de producto formado por min. y por mg de tejido,
sabiendo que la absorbamcia fue 0.2, : 17500.
7. Se incubaron 200 l de una preparacin enzimtica (0,3 mg protenas/ml) en presencia de 0,5 ml del
sustrato correspondiente y de 0,5 ml de buffer pH 5, durante 15 min. a una temperatura constante de
37C. La reaccin se detuvo por dilucin del incubado hasta un volumen final de 10 ml con NaOH 0,1 M.
La absorbancia de esta solucin fue 0,215. Calcular los moles de producto formado por min. y por mg de
protenas. Solucin testigo 2 M Abs. 0,15.

8. La trehalasa cataliza la hidrlisis de la trehalosa, en determinadas condiciones (pH 7, 30C). Una

muestra de trehalasa presenta un valor de Vm de 1.5 mol de glucosa formada por minuto por mg de
protena. Cul ser el valor de Vm para la misma preparacin enzimtica pero en presencia de de 5
mmoles de trehalosa 6-fosfato el cual es un inhibidor competitivo con Ki = 2mmol/ml?
9. Pseudomonas aeruginosa cultivada en un medio de acetato posee una enzima que puede hidrolizar la
propionamida.
CH3CH2CONH2 + H2O -----------------> CH3CH2COOH + NH3
los estudios de velocidad inicial en los que se midio la produccin de amonaco a partir de la propionamida
o
a pH 7 y 37 C demostraron que la urea inhibe esta reaccin. Examinando los efectos de dos
concentraciones diferentes de urea sobre un rango de concentraciones de propionamida se obtuvieron los
siguientes resultados:

38
[Propionamida]

VELOCIDAD INICIAL
(moles de NH3 liberados/min/mg de protena)
SIN INHIBIDOR
CON INHIBIDOR (Urea)
1 mmol/ml

5
6.7
10
20
50

160
194
263
400
576

2 mmol/ml

111
140
183
279
400

76
95
123
188
277

Determinar la Km para las diferentes condiciones. Acta la urea como un inhibidor competitivo o no
competitivo?
10. A partir de los siguientes datos de una reaccin enzimtica, determinar a) tipo de inhibicin b) KM del
sustrato.
Concentracin de S (mM)

VELOCIDAD
(g de producto formado/hora)
Sin inhibidor

2
3
4
10
15

139
179
213
313
370

Con inhibidor 6 mM
88
121
149
257
313

39

TRABAJO PRCTICO N 4
CINTICA ENZIMTICA II

PARTE PRACTICA I
ESTUDIO SOBRE LA FOSFATASA CIDA DE HGADO

OBJETIVOS
- Medir la formacin de producto en funcin del tiempo de incubacin.
- Determinar la variacin de la velocidad inicial en funcin de la concentracin de la enzima.
Es decir, se determinarn las condiciones ptimas de tiempo de incubacin y de concentracin de enzima, las que
sern usadas durante el trabajo prctico siguiente para determinar KM y Vmax.

FUNDAMENTO DE LA REACCIN
La fosfatasa cida de hgado cataliza la siguiente reaccin:
p-nitrofenol + PO43-

p-nitrofenilfosfato + H2O

HO

OH

O
OH

Enzima

+ Enz + PO4-3

H+
O2N

p-nitrofenilfosfato

O2N

O-

OH-

+ H2O

O2N

p-nitrofenol

p-nitrofenolato

El sustrato p-nitrofenilfosfato disdico, es una reactivo artificial que tiene la propiedad de ser hidrolizado
por esta enzima del hgado y de otros tejidos, por ello puede ser usado para estudiar dichas enzimas. La
reaccin es medida siguiendo la cantidad de producto formado, el p-nitrofenol, el cual se puede medir
mediante fotocolorimetra en un medio alcalino a 410 nm (Coeficiente de extincin molar: 17500) (ref.
Methods Enzimology ed. Colowick-Kaplan vol. XXXI).

MATERIALES Y MTODOS
Preparacin de la enzima:
Homogeneizar (en homogeneizador a embolo) 0.25 g de hgado en 15 ml de agua destilada. Dejar en
bao de hielo durante 10 min. En esas condiciones hipo-osmticas, se rompen los lisosomas que
contienen la enzima, la cual queda soluble. Luego llevar la suspensin a 30 ml con buffer actico- acetato
de sodio, pH 5, y 0,2 M. La suspensin queda con una concentracin de 1 mg de protena por ml.

40
Sistema de incubacin:
Contiene cantidades variables de los siguientes componentes:
Sustrato: p-nitrofenilfosfato, 25 mM. PM 371,12.
Buffer: acido actico- acetato de sodio, pH 5, 0,1 M.
Enzima: homogeneizado de hgado 1 mg de protena / ml.
Activador: Cl2Ca 11 mM.
Inactivador: NaOH 0,1M
Recomendaciones:
Colocar en un tubo todos los componentes menos la enzima. La reaccin comienza con el agregado de la
enzima y la incubacin a 37C. Mezclar rpidamente y continuar la incubacin durante un tiempo que se
indicar en cada caso. La reaccin se detiene por el agregado de 5 ml de NaOH 0.1 M. El lcali, por un
lado inactiva a la enzima y por otro da el medio alcalino necesario para que el producto (p-nitrofenol)
desarrolle color. Es importante hacer en cada caso un tiempo de cero de incubacin, este tubo contiene lo
mismo que los tubos problema pero con la enzima agregada despus del NaOH. Este tubo se usa como
blanco para el fotocolormetro.

PROTOCOLO
A) CURVA DE TIEMPO :
o

Tubo N

sustrato l

Cl2Ca l

buffer l

enzima l

tiempo
(min)

100 (5 mM)

100

250

100 (0,1 mg

10

prot)
2

100

100

250

100

15

100

100

250

100

20

100

100

250

100

25

100

100

250

100

30

blanco

100

100

250

100

Incubar a 37C. Al cabo del tiempo de incubacin frenar la reaccin agregando 5 ml de NaOH 0.1 M. En el
blanco la enzima debe aadirse despus del alcali. Leer en el fotocolormetro a 410 nm y calcular los
moles de producto formado.
RESULTADOS
Tubo No
1
2
3
4
5

Absorbancia

moles de P

moles de p/min

41
GRFICO

CONCLUSIONES

B- CURVA DE CONCENTRACIN DE ENZIMA

Tubo No

Sustrato (l)

Cl2Ca (l)

Buffer (l)

enzima (l)

tiempo (min)

100 (5 mM)

100

300

50 (0,05 mg prot)

SEGN

100

100

250

100 (0,1 )

100

100

200

150 (0,15 )

DETERMINADO

100

100

150

200 (0,2

EN: A

100

100

100

250 (0,25 )

blanco

100

100

100

250 (

LO

Incubar a 37C durante el tiempo determinado en A. Frenar la reaccin agregando 5 ml de NaOH 0.1 M.
En el blanco la enzima debe aadirse despus del lcali. Leer en el fotocolormetro a 410 nm y calcular los
moles de producto formado.
RESULTADOS

42
o

Tubo N
1
2
3
4
5

GRFICO

CONCLUSIONES

Absorbancia

moles de P

moles de p/min

43

TRABAJO PRCTICO N 5
CINTICA ENZIMTICA III

PARTE PRCTICA II
ESTUDIO SOBRE LA FOSFATASA CIDA DE HGADO

OBJETIVO
- Determinar los valores de KM y Vmax de la fosfatasa cida de hgado.

PROTOCOLO
PREPARACIN DEL SISTEMA DE INCUBACIN:
Tubo

sustrato (l)

Cl2Ca (l)

Buffer (l)

enzima (l)

tiempo (min)

50 (2,5 mM)

100

250

SEGN

SEGN

100 (5 mM)

100

200

LO

LO

150 (7,5 mM)

100

150

ESTIMADO

ESTIMADO

200 (10 mM)

100

100

EN: B

EN: A

250 (12,5 mM)

100

50

blanco

100

100

200

Incubar a 37C segn el tiempo determinado en A. Luego agregar a cada tubo 5 ml de NaOH 0.1 M. En el
blanco la enzima se aade despus del alcali. Leer en el fotocolormetro a 410 nm y calcular los moles
de P formado.
ANLISIS DE DATOS:
a) Calcular las inversas de la concentracin de sustrato indicadas en la tabla.
b) calcular las inversas de moles de producto formados en cada tubo.
c) graficar 1/Vo en funcin de 1/[S]. d) Determinar los valores de KM y Vmax.
RESULTADOS:
Curva de Saturacin
Tubo No
1
2
3
4
5

Absorbancia

moles de P

moles de P/min

44

Curva de dobles recprocas

Tubo No
1
2
3
4
5

1/V

1/[S]

45
CONCLUSIONES

46

DISCUSIN DE TRABAJOS CIENTFICOS

GUA DE ESTUDIO.

Trabajo cientfico:
Jung G.Y. and Stephanopoulos G. (2004). A functional protein chip for pathway optimization and in
vitro metabolic engineering. Science 304: 428-431.
1. Escriba la cita bibliogrfica completa (busque en bases de datos tales como PubMed).
2. Optimizacin de vas metablicas: a) cul es su inters?, b)dnde reside su dificultad?, cmo puede
encararse?.
3. Qu son los microarreglos?, en qu contexto se comenzaron a desarrollar?.
4. Cul es el objetivo del presente trabajo?
5. Cul es la estrategia experimental elegida? (palabras clave: fusin RNA-protena, polilisina, DNA,
hibridizacin).
6. Cules son las dos reacciones acopladas que se usan para poner apunto el sistema experimental?.
Cul es la utilidad del DNA marcado con fluorescena?. Cmo se detecta el producto de estas
reacciones acopladas?. Describa los experimentos realizados para poner a punto la tcnica (Figs. 1 y 2).
7. Qu es la trehalosa y cul es su importancia?
8. Cul es la va metablica a cuyo estudio se aplica la tcnica desarrollada?
9. Describa la Fig. 3.
10.Cules son las conclusiones alcanzadas respecto al funcionamiento de esta va metablica? Es
posible generalizar estas conclusiones a otras vas metablicas?.

BIBLIOGRAFA
. Stryer L, Berg, JM y Tymoczko, JL. Bioqumica, Ed. Revert SA, 5Ed. Espaa 2003.
. Lehninger Principles of Biochemistry. David L. Nelson & Michael M. Cox. Worth Publishers. 3Ed. NY.
USA. 2000.
. Harper H.A, Manual de qumica fisiolgica. Ed. El manual moderno 1980
. Neilands J.B., Stumpf P.K., Principios de enzimologa. Ed Aguilar. 1967.
. Morris J., Fisicoqumica para bilogos.
. Bezkorovainy, A, Rafelson M.E. Concise Biochemistry. Ed. Marcel Dekker, New York, 1996.
. Horton R.H, Moran L.A., Ochs R.S., Rawn J.D., Scrimgeour K.G. Pentice Hall, Hispanoamericana, SA.
Mxico, 1995.
- Methods Enzimology ed. Colowick-Kaplan Vol. XXXI.

47

TRABAJO PRCTICO N 6
FOTOSNTESIS
Los problemas y la gua de estudio debern ser resueltos por los alumnos antes de concurrir a la clase. En
caso de necesitar aclarar dudas, los docentes estrn disponibles en sus horarios de consulta en la ctedra.
Los alumnos sern evaluados al final del TP (evaluacin escrita) y durante el desarrollo de la experiencia
prctica (evaluacin oral), sobre los contenidos que se encuentran en la gua de TP.
Debern entregar un informe escrito de la experiencia prctica en donde se detallen claramente: Objetivos,
Hiptesis, Materiales y Mtodos, Resultados y Discusin.
Debern concurrir con guardapolvo, gafas, guantes, cabello recogido y calzado cerrado.

OBJETIVOS
- Valorar la importancia de la fotosntesis como proceso necesario para la vida en el planeta
- Conocer los procesos bioqumicos y termodinmicos involucrados en el proceso.
- Comprobar algunos aspectos de la fotosntesis por medio de experimentos.

TEMAS PARA REPASAR

- Termodinmica de las reacciones redox.

INTRODUCCIN
La fotosntesis es un proceso que puede tener lugar tanto en clulas de plantas y como de bacterias
verde-azules; por medio de este proceso estos organismos son capaces de utilizar la luz solar como
fuente de energa para efectuar la sntesis de ciertos compuestos.
La ecuacin global de la fotosntesis es :
Luz
6 CO2 + 6 H2O -----------------> C6H12O6 + 6O2
Puede resolverse en dos procesos caracterizados por el tipo de reacciones que se realizan en cada uno,
estas son:
reacciones dependoentes de la luz ( o reacciones claras): la energa luminosa es captada por los
pigmentos y la transforman en ATP y NADPH y simultaneamente se libera oxgeno molecular.
Reacciones de fijacin del carbono (o de fase oscura): llamada as porque no es necesaria la luz para
llevarse a cabo; aqu el ATP y el NADPH se emplean como fuentes de energa y poder reductor,
respectivamente, y se produce la reduccin del CO2 y la sntesis de glucosa.
Fotlisis del agua:
Esta reaccin se conoce como reaccin de Hill:
H2O + A ----------------> AH2 + 1/2 O2
El estudio del transporte electrnico inducido por la luz comienza con el descubrimiento de R.L Hill: "La
iluminacin de cloroplastos en presencia de aceptores electrnicos artificiales provocaba el
desprendimiento de oxgeno y la simultnea reduccin del aceptor.
En la fotosntesis normal el aceptor es el NADP pero en la reaccin de Hill se utiliza un aceptor
artificial por ejemplo, un colorante que al reducirse se decolora.

48

GUIA DE ESTUDIO
1. Concepto de fotosntesis.
2. Concepto de reacciones dependientes de la luz y de fijacin del carbono.
3. Formas de captacin y transferencia de Energa.
4. Fuerza electrn-motriz.
5. Fuerza protn motriz.
6. Diferencia entre mitocondrias y cloroplastos.
7. Dadores y aceptores de electrones.
8. Importancia de la reaccin de Hill
9. Diferencias entre fosforilacin a nivel de sustrato, fosforilacin oxidativa y fotofosforilacin. Ejemplos.

Rol Dual de citocromo b6f (cytochrome b6f) y citocromo c (cytochrome c) en cianobacterias como
ejemplo de transporte electrnico y fosforilacin en la fotosntesis y en la cadena respiratoria.
Estos organismos utilizan citocromo b6f, citocromo c y plastoquinonas para la fosforilacin oxidativa y la
fotofosforilacin. (a) En la fotofosforilacin los electrones fluyen desde el agua al NADP+ (b) En la
fosforilacin oxidativa los electrones fluyen desde el NADH al O2. Ambos procesos son acompaados por
el movimiento de protones a travs de la membrana.

Figura tomada de: Lehninger

Principles of Biochemistry. David
L. Nelson & Michael M. Cox. Worth
Publishers. 3Ed. NY. USA. 2000.

49

Integracin de fotosistemas I y II en el cloroplasto.

Este esquema en Z muestra el transporte de electrones transferidos desde el agua (abajo a la izquierda)
hacia el NADP+ ( a la derecha) en la fotosntesis no cclica. La posicin en escala vertical de cada portador
de electrones refleja su potencial de reduccin estandar. Para elevar la energa de electrones derivados
del agua al nivel energtico requerido para reducir NADP+ a NADPH, Los electrones deben ser
impulsados por fotones absorbidos en PSI (Photosystem I o Fotosistema I) y PSII (Photosystem II o
Fotosistema II) (ver flechas anchas). Un fotn es requerido por un electrn de cada Fotosistema. Luego de
la excitacin los electrones de alta energa fluyen corriente abajo a travs de una cadena transportadora.
Los protones se mueven a travs de las membranas tilacoidales durante la lisis del agua y durante el
transporte de electrones a travs del complejo citocromo b6f (o cytochrome b6f) generando un gradiente
de protones que es central para la formacin de ATP. La flecha punteada indica la va cclica de la
transferencia de electrones, donde solo esta involucrado PSI, los electrones regresan por una va cclica al
PSI, en lugar de reducir NADP+ a NADPH.

Direccin del flujo de electrones

Adaptado de : Lehninger Principles of Biochemistry. David L. Nelson & Michael M. Cox. Worth
Publishers. 3Ed. NY. USA. 2000.

50

PARTE PRACTICA

Mecnica del TP:

1) Determinar el o los objetivos de cada experiencia prctica.
2) Enunciar la o las hiptesis que se pondrn a prueba con cada una de las experiencias.
3) Elaborar un protocolo de trabajo tomando en cuenta la informacin disponible en la Gua de TP.
4) Desarrolar la experiencia y registrar los resultados.
5) Discutir y fundamentar adecuadamente los resultados obtenidos. Las preguntas que se encuentran en
la guia deben ser usadas para orientar la discusin de los diferentes aspectos del problema que se
aborda con cada una de las experiencias.
6) Exponer los resultados y redactar un informe acerca de la experiencia prctica utilizando un lenguaje
adecuado, detallando claramente: Objetivos, Hiptesis, Materiales y Mtodos, Resultados y Discusin.
7) Evaluacin escrita al final del TP.

EXPERIENCIA N 1: Fotosntesis y luz. Liberacin de oxgeno y fijacin de CO2.

MATERIALES
Material vegetal: un trozo de Elodea
Solucin de bicarbonato de sodio al 1% P/V.
Tubos de ensayo, tapones de goma atravesados por un tubo de 0,5 cm de dimetro, pipetas de 0,2 ml.
Fuente de luz blanca.
Soportes y gradillas.
PROCEDIMIENTO:
1. Disponer los elementos en la manera indicada en la Fig.1, teniendo en cuenta que desde el tubo de
ensayo hasta la pipeta graduada el sistema debe estar lleno de solucin de bicarbonato de sodio al
1%.
2. Marcar el nivel del lquido contenido en la pipeta.
3. Medir el pH de la solucin de bicarbonato de sodio
4. Conectar la fuente de luz a 10 cm de distancia y observar la base del tallo de Elodea.
5. Controlar el pH de la solucin a los 45 min de iniciada la experiencia.

Fig.1

a)
b)
c)
d)
e)

Por qu utiliza una solucin de bicarbonato de sodio en lugar de agua?

Cmo es la reaccin de la que participa el dixido de carbono disuelto en agua?
Qu efecto produce el desprendimiento de oxgeno en el sistema?
Qu sucedera en el sistema si modificara la distancia entre la planta y la lmpara?
Cambi el pH?

51

EXPERIENCIA N 2: Consumo de CO2

MATERIALES:
Material vegetal: Elodea
Dos tubos de ensayo
Solucin de rojo de fenol
Fuente de luz blanca.
Papel de aluminio.
PROCEDIMIENTO:
1. Colocar 10 ml de solucin de rojo de fenol en dos tubos de ensayo e insuflar aire con una pipeta hasta
que la solucin vire de color rojo a color amarillo.
2. Introducir en cada tubo de ensayo un trozo de Elodea.
3. Exponer un tubo a la luz y cubrir el otro con papel de aluminio (oscuridad).
4. Observar los tubos a los 45 min de iniciada la experiencia.

Fig. 2

CO2

Rojo

a)
b)
c)
d)
e)

Qu funcin cumple el Rojo Fenol?

Por qu el color vira a amarillo cuando se insufla dixido de carbono?
Cul es la fuente de dixido de carbono?
Cambi el pH?
Que sucedera en el sistema en ausencia de luz?

52

EXPERIENCIA N 3: Fotlisis del agua. Reaccin de Hill.

MATERIALES:
Material vegetal: hojas de Palam-palam o de espinaca (50 g)
Solucin de NaCl 0,035 M.
Solucin de NaCl 0,35 M.
-4
Solucin de 2,6-diclorofenolindofenol 2,5 x 10 M
Licuadora (tanto el vaso de la licuadora como las soluciones deben mantenerse en fro (0-4oC)
Aislamiento de cloroplastos
Homogeneizar en licuadora 50 g de material vegetal en 100 ml de NaCl 0,35 M durante 1 min. Filtrar por
gasa doble, recoger en un vaso y mantener en bao de hielo. Tomar 30 ml del homogeneizado y
centrifugar a 1000 rpm durante 5 min. Decantar y eliminar el precipitado de restos celulares. Centrifugar el
sobrenadante a 4000 rpm durante 10 min. Separar el sobrenadante y resuspender el precipitado de
cloroplastos en NaCl 0,035 M (1 ml). Mantener en bao de hielo.
PROCEDIMIENTO:

2,6 di-Cl-fenolindofenol

f)
g)
h)
i)
j)

Porqu utiliza NaCl 0.35 M para realizar el homogeneizado?

Porqu utiliza NaCl 0.035 M para resuspender los cloroplastos?
Qu funcin cumple el 2,6-diclorofenolindofenol?
Cmo podra demostrar la produccin de oxgeno?
Cmo podra mejorar esta experiencia?

53

PROBLEMAS
1. Interprete el siguiente grfico en el que se observan varios factores que afectan la velocidad de la
fotosntesis:
*
Velocidad
de
fotosntesis

Efecto de la intensidad de luz a:

1
2

1. 25 C y CO2 0,4%
2. 15oC y CO2 0,4%
3. 25oC y CO2 0,01%

Intensidad de la luz incidente

Qu indica la zona marcada con *?

Concentracin

2. Explique las causas de las interconversiones entre RuDp (ribulosa difosfato) y PGA (cido
fosfoglicrico) en experimentos de fotosntesis, cuando varan la intensidad de iluminacin y la
concentracin de CO2.
Luz

1% CO2

Oscuridad

0,003% CO2

RUDP

PGA

PGA

RUDP
Tiempo (min)

Tiempo (min)

3. Calcular Go para la reduccin del NADP+ por FRS.

4. Calcular la fuerza electron-motriz expresada en voltios, registrada por un electrodo sumergido en una
solucin que contiene las siguientes mezclas de NAD+ y NADH a pH=7 y 25oC, con referencia a una
semicelda de 0,00V:
a) NAD+ 1 mM y NADH 10 mM
+
b) NAD 1 mM y NADH 1 mM
c) NAD+ 10 mM y NADH 1 mM
5. Ordenar las siguientes sustancias segn su tendencia creciente a ceder electrones:
a)clorofila del fotosistema I, b) plastoquinona, c) ferredoxina, d) agua, e) Feofitina (pheo),

6. Ordenar las siguientes sustancia segn su tendencia creciente a aceptar electrones:

a)clorofila del fotosistema II, b) P680*, c) NADP+, d) plastocianina.
7. Suponiendo que se necesitan 8 cuantos de luz para la incorporacin de una molcula de CO2 en
molculas de glcidos por medio de la fotosntesis, calcule la eficiencia termodinmica en condiciones
estndar, para la sntesis de 1 mol de glucosa, si la longitud de onda de la luz utilizada es a) 400 nm y
b) 750 nm. (Energa necesaria= 686 Kcal).

54
8. Cul es la diferencia entre las cadena transportadoras de electrones que tienen lugar en
mitocondrias y en cloroplastos? Calcule el G para la transferencia de electrones que ocurre en ambos
casos y justifique los resultados.
9. El aparato fotosinttico del alga verdeazulada contiene grandes cantidades de ficoeritrina y ficocianina,
adems de la clorofila A. La ficoeritrina tiene una absorcin mxima entre 480 y 680 nm; la ficocianina
a 620 nm. Sugerir la misin de estos pigmentos.
10. Observe y analice el siguiente grfico. Indique el tipo de fosforilacin y justifique su respuesta.

- - - moles de oxgeno liberado

___ moles de fosfato esterificado

Tiempo
11. Observe y analice el siguiente grfico. Indique el tipo de fosforilacin y justifique su respuesta.
- - - moles de oxgeno liberado
___ moles de fosfato esterificado

Tiempo
DATOS: Para resolver los problemas.
Agua: +0,82 V
NADP+: -0,324 V
Ferredoxina: -0,4 V
P700: +0,4 V
P680: +0,95 V
P680*: -0,95 V
Feofitina (Pheo): -0.75 V
Plastoquinona: +0,1 V
Plastocianina: +0.13V
NAD+: -0.32V

BIBLIOGRAFA
. Lehninger Principles of Biochemistry. David L. Nelson & Michael M. Cox. Worth Publishers. 3Ed. NY.
USA. 2000.
. Stryer L, Berg, JM y Tymoczko, JL. Bioqumica, Ed. Revert SA, 5Ed. Espaa 2003.
. Hall D.O., Rao K. Fotosntesis. Ed. Omega, Barcelona, 1977.
. Tribe M y Whitaker P. Cloroplastos y motocondrias. Ed.Omega, Barcelona, 1977.
. Andreo C., Vallejos R. Fotosntesis. Serie Biologa, monografa no 30 OEA, 1984.
. Molt A.S. et al. 1951, Plant Physiology, 26, 164-175.
. Torres H.M., Carminatti H. Y Cardini E. Bioqumica General Ed. El Ateneo, Bs.As. 1983.
. Harper H.A, Manual de qumica fisiolgica. Ed. El manual moderno 1980
. Morris J., Fisicoqumica para bilogos.
. Bezkorovainy, A, Rafelson M.E. Concise Biochemistry. Ed. Marcel Dekker, New York, 1996.
. Horton R.H, Moran L.A., Ochs R.S., Rawn J.D., Scrimgeour K.G. Pentice Hall, Hispanoamericana, SA.
Mexico, 1999.

55

TRABAJO PRACTICO N 7
MECANISMOS DE TRANSDUCCIN DE ENERGA
Los problemas y la gua de estudio debern ser resueltos por los alumnos antes de concurrir a la clase. En
caso de necesitar aclarar dudas los docentes estrn disponibles en sus horarios de consulta, en la ctedra.
Los alumnos sern evaluados al final del TP (evaluacin escrita) y durante la discusin del trabajo cientfico
(evaluacin oral), sobre los contenidos que se encuentran en la gua de TP.

OBJETIVOS
- Reconocer la aplicabilidad de las leyes de la fsicas a los sistemas biolgicos.
- Analizar fenmenos biolgicas desde un punto de vista termodinmico. Fotosntesis, respiracin y motores
moleculares como ejemplos.

TEMAS PARA REPASAR:

Energia libre de Gibbs; reaciones de oxido reduccin; transferencia de energia en la fotosintesis; cadena respiratoria;
fuerza proton motriz; motores moleculares.

GUIA DE PROBLEMAS
1- Condiciones estndar frente a la vida real. La aldolasa cataliza la siguiente reaccin en la gliclisis:
aldolasa
Fructosa 1,6-bifosfato

dihidroxiacetona fosfato + gliceraldehdo 3-fosfato

El G 0 para esta reaccin es de + 5,7 kcal.mol-1, mientras que el G en la clula es -0,3 kcal.mol-1.
Calcular la relacin entre reactantes y productos en el equilibrio y en condiciones intracelulares.
Utilizando los resultados obtenidos explicar: cmo puede resultar esta reaccin endergnica en
condiciones estandar y exergnica en condiciones intracelulares?

2- No siempre es lo mismo. Las concentraciones de ATP, ADP y Pi difieren segn el tipo de clula,
consecuentemente la liberacin de energa libre para la hidrlisis de ATP ser tambien diferente segn
el tipo de clula. Utilizando los datos de la tabla siguiente, calcular G para la hidrlisis de ATP en las
0
clulas de msculo, hgado y cerebro. Teniendo en cuenta que el G para esta reaccin es de - 7,3
-1
kcal.mol ,

Hgado
Msculo
Cerebro

ATP (mM)
3,5
8,0
2,6

ADP (mM)
1,8
0,9
0,7

Pi (mM)
5,0
8,0
2,7

3- Fuerza cida: El pK de un cido es una medida de su potencial de transferencia de grupos protnicos.

a) Establecer una relacin G 0 y pK.
0
b)Cul es el G para la inizacin del cido actico, si su pK es de 4,8?

4- Los opuestos se atraen. El grfico siguiente muestra como el G 0 para la hidrlisis de ATP vara en
funcin de la concentracin de Mg2+ (pMg=log 1/[ Mg2+ ]).
a) Cmo afecta el descenso de [Mg2+] al G para la hidrlisis de ATP?
b) Cmo se puede explicar este efecto?

8.4
8.2

34

8.0
7.8

33

7.6

32

7.4
31

-1

35

-G (kcal.mol )

-1

-G (kj.mol )

36

56

7.2

30
2

pMg 2
5- Cambio de divisas. Para una fuerza protn-motriz de 0,2 V (negativa en el lado de la matriz). Cul es
el valor mximo del cociente [ATP]/ [ADP] [Pi ] compatible con la sntesis de ATP? Calcular el valor de
este cociente de tres maneras, suponiendo que el nmero de protones translocados por cada ATP
formado es dos, tres, y cuatro respectivamente. La temperatura es de 25C.

6- Cruce de caminos. Es posible determinar el lugar exacto donde acta un inhibidor de la cadena
respiratoria gracias a la tcnica de punto y corte. Britton Chance diseo elegantes mtodos
espectroscpicos para determinar el cociente entre las formas oxidada y reducida de cada uno de los
transportadores. Este clculo es posible porque cada uno de los estados tiene un espectro de
absorcin caracterstico, tal y como se ilustra en el grfico adjunto para el caso de citocromo c. Si usted
se encuentra en posesin de un inhibidor y descubre que al aadirlo a mitocondrias que respiran, los
transportadores localizados entre el NADH y QH2 se encuentran ms reducidos y los transportadores
localizados entre el fitocromo c y el O2 se encuentran ms oxidados en qu punto acta el inhibidor?

57
7- Distancia. Supongamos que la transferencia de energa entre dos molculas de clorofila a distantes
entre s 10 tiene lugar en 10 picosegundos. Supongamos que la distancia se incrementa hasta 20
manteniendo constantes el resto de los factores. Cunto tardar en ocurrir la transferencia de
energa?

8- Se dice que es lenta? A su mxima velocidad una molcula de quinesina se desplaza con una
velocidad de 6400 por segundo. Teniendo en cuenta que el tamao de la regin motriz del dmero de
quinesina es de 80 , calcular su velocidad en unidades de su tamao por segundo. Segn esta
relacin cul sera la velocidad correspondiente de un automvil que tuviera una longitud de 3
metros?

9- Levantamiento de pesos. Un nico dominio motor de la miosina puede desarrollar una fuerza de
aproximadamente 4 piconewtons (4pN) Cuntas veces puede levantar su peso un dominio motor de
miosina? Tener en cuenta que 1 newton = 1 kg fuerza (1kg masa m.s-2). Considerar que la masa
molecular del dominio motor es de 100 kd.

10- Las helicasas como motores. Las helicasas tales como la PcrA pueden utilizar una hebra sencilla de
ADN como gua. En cada ciclo la helicasa se desplaza una base en el sentido 3-5. Teniendo en
cuenta que la PcrA en presencia de un molde formado por una hebra sencilla de ADN puede hidrolizar
ATP con una velocidad de 50 molculas por segundo (se hidroliza una molecula por ciclo) y que la
longuitud de una base de ADN es 3,4 . Cmo es esta velocidad comparada con la velocidad de la
quinesina que es de 6400 por segundo?A qu se puede deber la diferencia de velocidad entre estos
dos motores moleculares?.

11- Nuevamente se mueve. Cuando a las bacterias tales como E. coli se las mantiene en ayunas durante
un perodo de tiempo suficiente, dejan de moverse. Sin embargo, cuando estas bacterias inmviles se
colocan en un medio cido nuevamente comienzan a moverse. Aportar una explicacin teniendo en
cuenta el mecanismo de movimiento del flagelo de una bacteria.

12- Arrastrar cargas. Considrese la actividad de una nica molcula de quinesina que transporta una
vescula a lo largo de un microtbulo. La fuerza necesaria para arrastrar una partcula esfrica de radio
a con una velocidad en un medio de viscosidad es: F= 6 a x
Supongamos que una esfera de 2 m de dimetro se transporta con una velocidad de 0,6 m. s-1 en un
medio acuoso con una viscosidad de = 0.01 g.cm-1. s-1.
a) Cunta es la fuerza desarrollada por la quinesina? Expresar el valor en dinas (1 dina= 1 g.cm. s-2)
b) Cunto trabajo realiza en un segundo? Expresar el valor en ergios (1 ergio=1 dina cm).
c) Un motor de quinesina hidroliza aproximadamente 80 molculas de ATP por segundo. Cunta es
la energa asociada a esta hidrlisis de ATP expresada en ergios? Comparar este valor con el
trabajo realizado.

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DISCUSIN DE TRABAJOS CIENTFICOS

GUA DE ESTUDIO.

Trabajo cientfico:
Yasuda, R., Noji, H., Kinosita, K., & Yoshida M.. (1998). F1-ATPase Is a Highly Efficient Molecular
Motor that Rotates with Discrete Steps. Cell. 93: 11171124.

1. Cal es la funcin del ATP sintetasa? Cmo es su estructura? Cul es la funcin de cada una de las
subunidades?
2. Qu fenmeno se observa si la parte F1 se encuentra en ausencia de la parte F0 en un medio que
contiene ATP?
3. Cmo se logra experimentalmente observar la rotacin del F1-ATPase?
4. Explicar brevemente los resultados que se observa en la Figura 2a y 2b.
5. A cul de los experimentos que se realizaron en los T.Prcticos de la materia, se asemeja el
experimento del grfico 2b.

BIBLIOGRAFA
. Lehninger Principles of Biochemistry. David L. Nelson & Michael M. Cox. Worth Publishers. 3Ed. NY.
USA. 2000.
. Stryer L, Berg, JM y Tymoczko, JL. Bioqumica, Ed. Revert SA, 5Ed. Espaa 2003.