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Biología molecular de las plantas 35: 205-218, 1997. 205

c 1997 Kluwer Academic Publishers. Impreso en Bélgica.

Transformación del arroz mediada por Agrobacterium tumefaciens

Yukoh Hiei , Toshihiko Komari y Tomoaki Kubo

Laboratorio de Investigación de Fitomejoramiento y Genética, Japan Tobacco Inc. 700 Higashibara, Iwata,
Shizuoka 438, Japón ( autor para correspondencia)

Palabras clave: Agrobacterium tumefaciens, arroz, transformación, monocotiledones

Resumen

Agrobacterium tumefaciens se ha utilizado habitualmente para transferir genes a plantas dicotiledóneas, pero se
creía que las monocotiledóneas, entre las que se encuentran importantes cereales, eran recalcitrantes a esta
tecnología por estar fuera del rango de hospedadores de la agalla corona. Muchos laboratorios han intentado
infectar conAgrobacterium plantas monocotiledóneas, incluido el arroz, pero los resultados no han sido
concluyentes hasta hace poco. En 1994 y 1996 se publicaron protocolos de transformación eficaces para el arroz
mediados por Agrobacterium. Un punto clave de los protocolos era el hecho de que los tejidos consistentes en
células embrionarias en división activa, como embriones inmaduros y calos inducidos a partir de scutella, se
cultivaban conjuntamente conAgrobacterium en presencia de acetosiringonc, que es un potente inductor de los
genes de virulencia. Ahora está claro queAgrobacterium es capaz de transferir ADN a monocotiledones si se
infectan tejidos que contienen células "competentes". Los estudios de transformación del arroz sugieren que
numerosos factores, como el genotipo de las plantas, los tipos y edades de los tejidos inoculados, el tipo de
vectores, las cepas deAfgrobacterium, los genes marcadores de selección y los agentes selectivos, así como las
diversas condiciones del cultivo de tejidos, tienen una importancia crítica. Las ventajas de la transformación
mediada por Agrobacterium en el arroz, al igual que en las dicotiledóneas, incluyen la transferencia de trozos de
ADN con extremos definidos con mínimos reordenamientos, la transferencia de segmentos relativamente grandes
de ADN, la integración de pequeños números de copias de genes en los cromosomas de la planta, y la alta calidad y
fertilidad de las plantas transgénicas. El suministro de ADN extraño a plantas de arroz a través de A. tumefaciens es
una técnica rutinaria en un número creciente de laboratorios. Esta técnica permitirá la mejora genética de diversas
variedades de arroz, así como el estudio de muchos aspectos de la biología molecular del arroz.

Introducción Visión general de la transformación mediada por

La tecnología de transformación del arroz ha
experimentado notables mejoras en los últimos años.
Antes sólo era posible transformar el arroz mediante
métodos directos de liberación de genes, pero ahora el
arroz es una de las plantas que pueden transformarse
de forma rutinaria mediante métodos en los que
interviene la bacteriaAgrobacterium tumefaciens.
Agrobacterium
Agrobacterium tumefaciens es una bacteria del suelo
que puede transformar genéticamente células
vegetales con un segmento de ADN (ADN de
transferencia, abreviado como ADN-T) de
un plásmido inductor de tumores (plásmido Ti) con la
producción res- ultante de una agalla corona, que es
un tumor vegetal. Dado que los mecanismos
detallados de la transferencia de ADN de A.
tumefaciens han sido revisados por muchos autores
[54, 55, 63, 114, 119], nos limitaremos a resumir aquí
el proceso de inducción de la agalla corona en la
naturaleza, que consiste en una serie de pasos
discretos y esenciales. En primer lugar, la herida de
la planta permite la entrada de bacterias y
proporciona compuestos fenólicos que activan la
maquinaria de transferencia de ADN de A.
tumefaciens.
206 monocotiledóneas fue lento. La atención se centró en
otros métodos, como el suministro de ADN a
faciens. Las bacterias se multiplican en la savia de la protoplastos y el bombardeo de células y tejidos con
herida y se adhieren a las paredes de las células microproyectiles.
vegetales. El ADN-T se transfiere a las células vegetales
y se integra en el genoma de la planta. Los genes
codificados por el ADN-T se expresan en las células
vegetales incluso antes de la integración [59]. Los
tumores se desarrollan como resultado de divisiones
celulares desencadenadas por la producción continua
de auxina y citoquinina por parte de enzimas
codificadas en el ADN-T. Además, las células tumorales
producen y liberan enzimas. Además, las células
tumorales producen y excretan opinas que son
sintetizadas por enzimas que también están codificadas
en el ADN-T, y estas opinas son consumidas
específicamente por las bacterias infectantes.
Se han desarrollado una serie de sofisticados
vectores de transformación de plantas, diseñados
sobre la base de este mecanismo natural de
transferencia de genes, que se emplean ampliamente
en la biología molecular de plantas y en la ingeniería
genética de plantas [31]. El uso de estos vectores para
la transferencia de genes a plantas de alto crecimiento
tiene varias ventajas, además de su conveniencia y
eficiencia; permite la transferencia de grandes
segmentos de ADN con un reordenamiento mínimo y la
integración de un pequeño número de copias de genes
en los cromosomas de las plantas [43, 63, 113]. Los
genes extraños transferidos por este método suelen
transmitirse a las plantas progenitoras de forma
mendeliana [13, 28].
En el plásmido Ti, los genes responsables de la
transferencia del ADN-T están agrupados en una
región conocida como región de virulencia [64]. El
proceso de transferencia está activo incluso cuando los
genes de virulencia y el A D N - T se encuentran en
replicones separados en una célula A. tume- faciens
[49]. En un sistema binario ampliamente utilizado, un
plásmido Ti sirve como ayudante, proporcionando las
funciones de virulencia, y un ADN-T artificial, que
contiene un gen marcador seleccionable y otros genes
de interés, se coloca en un segundo plásmido
pequeño, que a menudo se denomina vector binario
[7].

Desarrollo de procedimientos para la

transformación del arroz

Los sistemas de transformación mediada por

Agrobacterium están bien establecidos para muchas
plantas dicotiledóneas. Sin embargo, las plantas
monocotiledóneas, en particular los cereales, estaban
originalmente fuera del rango de hospedadores de A.
tumefaciens, por lo que el desarrollo inicial de
sistemas para la transformación genética de
 monocotiledóneas, sugirieron que al menos algunas
especies monocotiledóneas podrían ser susceptibles a
Los primeros éxitos en la producción de arroz la infección por A. tumefaciens.De Cleene y De Ley [25]
transgénico implicaron la electroporación [91, 99, incluyeron dos familias de monocotiledóneas, Liliales y
116] o la transferencia de genes mediada por Arales, entre las familias que
polietilenglicol (mediada por PEG) [24, 45, 118]. Los
procedimientos para la transformación del arroz
mediada por protoplastos presentan ciertos
problemas. Sigue siendo difícil regenerar plantas a
partir de protoplastos de variedades japónicas de
élite y de la mayoría de variedades índicas, aunque
se han comunicado algunos resultados satisfactorios
[8]. Las plantas regeneradas a partir de protoplastos
son a menudo estériles y fenotípicamente anormales
[1, 23, 73]. Algunos de estos problemas están
probablemente relacionados con el uso de células
que han sido cultivadas durante largos periodos. Para
evitar estos problemas, se utilizó tejido escutelar de
embriones inmaduros para el aislamiento de
protoplastos [35]. Otros problemas incluyen la
integración de múltiples copias de genes en el
genoma [97], la fragmentación y reorganización de
genes [45, 110] y la herencia ocasional no
mendeliana de transgenes [83].
El bombardeo con microproyectiles, también
llamado método biolístico o método de pistola de
partículas, se ha intentado en muchos laboratorios.
Christouet al. [20, 21] informaron que los embriones
inmaduros son buenos para la transformación
biolística de cultivares importantes de arroz
Japonica, Javanica e Indica. Con el
perfeccionamiento de la técnica [72], el bombardeo
de embriones de arroz y células cultivadas se ha
convertido en un método rutinario para la
transformación del arroz Japonica. En informes
recientes se ha descrito la transformación con éxito
de variedades de arroz Indica utilizando células en
cultivo en suspensión [60, 117]. Otro método para
la transferencia directa de genes a tejidos intactos,
desarrollado para el arroz, es la electroporación de
embriones maduros, y Xu y Li [111] informaron de la
producción de arroz Indica transgénico fértil
mediante este método. En comparación con los
métodos mediados por protoplastos, los métodos
que utilizan células y tejidos intactos dependen
menos de cultivares específicos [8, 20, 21]. Varios
problemas, incluyendo la inserción de múltiples
copias de genes extraños [3, 29] y la herencia no
Mendeliana de trans- genes [95, 98], han sido
discutidos para otras plantas de cultivo.

Intentos de transformación de monocotiledóneas

mediada por Agrobacterium

Pruebas tempranas limitadas, como la formación de

tumores y la producción de opinas en ciertas
 207

incluía especies susceptibles a A. tumefaciens. Más microorganismos que estaban infectando

recientemente, la inducción de tumores tras la silenciosamente los tejidos de la planta huésped.
inoculación de Potrykus concluyó que, por lo tanto, en 1990 no había
Se ha demostrado la presencia de A. tumefaciens pruebas inequívocas de la transformación estable de
enAsparagus officinalis [46], Gladiolus [38] y Dioscora monocotiledóneas por Agrobacterium.
bulbifera
L. (ñame) [89], y se ha detectado la producción de
opoínas por tumores o en lugares de inoculación en
mono-cotiledones que incluyenAsparagus officinalis
[14, 46], Chlorophytum capense L. (Liliaceae) [56],
Narcissus canaliculatus (Amaryllidaceae) [56], Zea
mays [37] y Gladiolus [38]. En la mayoría de los
primeros estudios, se inocularon secciones de tallos y
hojas conAgrobacterium.
Otro tipo de estudio de la transferencia de ADN-T a
monocotiledones fue reportado por Grimsleyet al.
[40].
Se utilizó A. tumefacienscon el genoma del virus de las
estrías del maíz (MSV) en el ADN-T para inocular
plántulas de maíz [40, 41]. Las plántulas mostraron
síntomas sistémicos de infección vírica, lo que indicaba
que el ADN-T se había transferido a las células de maíz.
Este tipo de introducción de agentes infecciosos en las
plantas a través de A. tumefa- ciens se denominó
agroinfección. Grimsley et al.
[39] también demostraron que las regiones que
contenían el meristemo apical de las plántulas de maíz
eran particularmente susceptibles a la agroinfección.
Sin embargo, estos estudios de agroinfección no
aportaron ninguna prueba de la integración del ADN-T
en el genoma de la planta.
Raineri et al. [86] describieron la producción de
células transformadas del cultivar Japonica por
cocultivación de embriones maduros
conAgrobacterium. Los resultados de Southern blotting
indicaron la integración del ADN-T en el genoma de la
planta, pero no se regeneraron plantas transgénicas
(Tabla 1). Mooneyet al.
[77] produjeron células transformadas a partir de
embriones inmaduros de trigo que habían sido
cocultivados con A. tumefa- ciens. Aunque no pudieron
regenerar plantas de trigo a partir de callo transgénico,
detectaron ADN-T en tejido de callo mediante
hibridación Southern.
Los primeros estudios sobre la transformación de
monocotiledóneas mediada por Agrobacterium fueron
algo controvertidos. La integración del ADN-T en el
ADN genómico del huésped en plantas transgénicas
sólo se demostró de forma inequívoca en Asparagus
officinalis [14]. Potrykus [84, 85] presentó dos
revisiones críticas en 1990 y sugirió que los diversos
grupos de investigadores podrían haber pasado por
alto la posibilidad de expresión génica por células de
Agrobacterium que se habían adherido a células
vegetales, así como la transformación de
 En 1993, Chan et al. [18] obtuvieron unas pocas compuestos fenólicos
plantas de arroz transgénico inoculando embriones
inmaduros con una cepa de A. tumefaciens.
Demostraron la herencia del ADN transferido a las
plantas de la progenie mediante hibridación su-
terior, aunque analizaron la progenie de una sola
planta transformada. Hiei et al. [48] informaron
subsecuentemente de un método para la
producción eficiente de plantas de arroz transgénico
a partir de callos de cultivares Japonica que habían
sido cocultivados con A. tumefaciens. Sus pruebas
se basaban en análisis moleculares y estudios
genéticos de un gran número de plantas
transgénicas y en el análisis de la secuencia de
uniones T-ADN en el arroz. Rashid et al. [87]
informaron de la aplicación con éxito de dicho
método a cultivares Basmati de arroz Indica tras
realizar sólo pequeñas modificaciones. Dong et al.
[27] describieron la aplicación con éxito del método
al arroz Javanica. Aldemita y Hodges [2]
demostraron que los embriones inmaduros también
eran buenos materiales de partida para la
transformación mediada por Agrobacterium de
variedades Indica y Japonica.
Además de estos resultados exitosos en arroz, la
transformación eficiente de maíz por A. tumefaciens
fue demostrada por Ishida et al. [58] en 1996. Por lo
tanto, la controversia sobre la trans- formación de
monocotiledones mediada por Agrobacterium
parece haberse resuelto, al menos para estos dos
importantes cultivos de cereales.

Factores clave de la transferencia de genes al arroz

mediada por Agrobacterium

Está claro que numerosos factores son de

importancia crítica en la transformación del arroz
mediada por Agrobacterium y esta multiplicidad de
factores probablemente explica por qué al principio
fue tan difícil aplicar esta tecnología al arroz.
Analizaremos aquí los factores clave, incluidos el
tipo y la fase del tejido infectado, el tipo de vector,
el genotipo del arroz, las diversas condiciones del
cultivo de tejidos y los detalles de la infección.

Inducción de genes vir

Se supone que la bacteria se siente atraída por una

planta herida en respuesta a las moléculas señal
liberadas por las células vegetales a las que se
adhiere [50, 114]. Las células heridas de tabaco N(
icotiana sp.) exudan compuestos fenólicos, como 4-
acetil-2,6-dimetoxifenol (acetosiringona) y 4- (2-
hidroxi-acetil)-2,6-dimetoxifenol ( -hidroxi-
acetosiringona), que activan genesvir en Ti plas-
mids [96]. Bolton et al. [12] descubrieron que siete
 209

Tabla 1. Estudios de transformación del arroz mediada por Agrobacterium.

208
Variedad Cepa Gene Tejido Selección Comentarios Referencias

Japonica A281, A856, nos-nptII Embriones maduros Kanamicina Callos resistentes a la kanamicina; Raineri et al., 1990 [86]
Nipponbare LBA4404 CaMV35S- gus de germinado (200 mg/l) sin plantas;
Fujisaka5 oncogén semillas (heridas) Detección de ADN-T mediante análisis
Southern
Indica C58C1, LBA4404 nos-nptII Raíces de G418 Calibre resistente a G418; Chan et al., 1992 [19]
Nativo de Taichung CaMV35S- gus semillas germinadas (20 mg/l) sin plantas;
1
(heridos) Detección de ADN-T mediante análisis
Southern
Japonica A281 nos- nptII Cultivo inmaduro G418 Cuatro plantas transgénicas; Chanet al., [18]
Tainung 62 -Amy 8-gus embriones (40 mg/l) una planta produjo progenie;
(heridos) cultivo de patata en suspensión necesario
para
transformación
Japonica LBA4404 CaMV35S- hpt Callos derivados de Higromicina Un gran número de plantas transgénicas Hiei et al., 1994 [48]
Tsukinohikari EHA101 CaMV35S- int-gus scutella (50-100 mg/l) producidos con gran eficacia;
Asanohikari embriones Transmisión mendeliana a la generación
Koshihikari inmaduros, células R2 ; detección del ADN-T mediante
en suspensión análisis Southern;
(no herido) secuenciación de los límites del ADN-T;
vector "superbinario" era muy eficiente
Indica EHA101 CaMV35S- hpt Callos derivados de Higromicina Transformación eficaz de los cultivares de Rashid et al., 1996 [87]
Basmati
Basmati 370 CaMV35S- int-gus scutella (50 mg/ll) de arroz Indica
Basmati 385 (no herido)
Japonica LBA4404 CaMV35S-hpt Callos derivados de Higromicina vector "superbinario" era definitivamente Dong et al., 1996 [27]
eficiente en
Taipei 309 EHA101 CaMV35S- int-gus scutella (50 mg/l) transformación del arroz Javanica;
Javanica (no herido) Transmisión mendeliana a la generación R 2
Gulfmont
Jefferson

Japonica LBA4404CaMV35S- hptEmbriones inmaduros HigromicinaTransformación eficiente de arroz Japonica utilizandoAldemita y Hodges
Radon CaMV35S- int-gus (no herido) (30-50 mg/l) embriones inmaduros; 1996 [2]
Indica Plantas transgénicas de variedades del "grupo I"
TCS10 de arroz Indica; el vector "superbinario" fue
IR72 muy eficaz

Tropical Japonica EHA101 arroz actin1-int-bar Ápices de brotes PPT Se obtuvieron plantas transgénicas resistentes Parket al., 1996 [81]
Maybelle aislados (extra- (0,5 mg/l) al TPP con baja frecuencia
herida) se observó inactivación del transgén en la
progenie R 2
 209
adición de D-glutamina a los cocultivos fue más fuerte
indujeron la expresión de genes virales. Estas moléculas
cuando los cocultivos se incubaron entre 22 C y 28 . La
C

señal parecen ser muy importantes en el

adición de D-glucosa, D-galactosa o L-arabinosa, y de
reconocimiento por parte de A. tumefaciensde
huéspedes adecuados. Los mono-cotiledones, en
particular las gramíneas, parecen no producir estos
compuestos, o si lo hacen, los niveles son insuficientes
para servir como señales [94].
Una de las técnicas más utilizadas en la
transformación de plantas dicotiledóneas es la adición
de compuestos fenólicos, como la acetosiringona, a
cocultivos o cultivos bacterianos [104]. Su adición es
indispensable si la planta no produce un nivel
suficiente de moléculas señal. Las células de arroz
podrían ser capaces de producir un cierto nivel de
moléculas señal, ya que Raineri et al. [86] no
añadieron compuestos fenólicos en su exitoso intento
de obtener callos transgénicos. Vijayachandra et al.
[107] informaron de que los tejidos del arroz podían
inducir la expresión de genes vir, pero que la
inducción aumentaba considerablemente con la
acetosiringona. Así, los niveles de moléculas señal
producidas por el tejido de arroz parecen ser muy
limitados. Hiei et al. [48] demostraron que la
acetosiringona a 100 M es clave para el éxito de la
transformación del arroz. El nivel de expresión tran-
sente de -glucuronidasa (GUS), una enzima
marcadora, tras el cocultivo fue extremadamente bajo
cuando se omitió la acetosiringona. Chanet al. [18]
incluyeron en los cocultivos el medio de un cultivo en
suspensión de células de patata, que es una fuente
rica en compuestos fenólicos. La transferencia de
ADN-T se inicia en una fase temprana del cocultivo en
presencia de acetosiringona, y el pretratamiento de
las bacterias con acetosiringona no es esencial. Sin
embargo, el pretratamiento podría aumentar
ligeramente la eficacia de la transferencia genética [2].
Otros factores durante el cocultivo, como un pH
ácido [5, 100], el cultivo por debajo de 28 C [4], y la alta
presión osmótica [101], también se han reportado
como importantes para la expresión de los genes
virales. Veluthambiet al. [106] descubrieron que las
opinas estimulaban la inducción de sus genes. Además,
Shimoda et al. [92] y Cangelosi
et al. [15] informaron de que un grupo de aldosas,
como la D-glucosa y algunos azúcares no
catabolizables, como la 2-deoxi-D-glucosa y la 6-deoxi-
D-glucosa, potenciaban notablemente la expresión de
los genes virales. Los efectos de los azúcares eran
claros cuando los niveles de inductores fenólicos eran
limitados. Hiei et al. [48] confirmaron la importancia
de estos factores. La expresión transitoria de GUS en
callos derivados de scutella tras el cocultivo
conAgrobac- terium fue más fuerte cuando los
cocultivos se incubaron entre 22 C y 28 , y el pH del
C

medio de cocul- tivación estaba entre 4,8 y 6,2. La

210
a largo plazo no afecta de forma significativa a la
nopalina no tuvo ningún efecto sinérgico significativo
eficacia de la transformación, pero el riesgo de las
en presencia de 100 M de acetosiringona.
denominadas variaciones somaclonales podría estar
asociado a dicho cultivo a largo plazo.
La división celular activa y la elección de los tejidos del
Aunque los embriones inmaduros demostraron ser
arroz materiales pobres en los primeros estudios [18, 48], los
transformantes pueden
Los primeros experimentos con Agrobacterium
indicaron que la herida de la planta huésped es
necesaria para el desarrollo de tumores [74]. Binns y
Thomashow [11] señalaron la clara correlación
existente en la literatura entre la división de células
inducida por heridas y la competencia de dichas células
para ser transformadas por A. tumefaciens.
Propusieron que los procesos relacionados con la
síntesis de ADN y la división celular son necesarios
para la i n c o r p o r a c i ó n de ADN extraño en el
genoma huésped [11]. Se han encontrado pruebas
coherentes con esta hipótesis tanto en el caso de la
transformación mediada por Agrobacterium como en
el de la transformación directa [6, 57, 71, 80, 102,
109].
Las respuestas a las heridas de muchas
monocotiledóneas difieren de las de las
dicotiledóneas. En muchas monocotiledóneas, las
células en los lugares de las heridas tienden a ligarse
o esclerificarse sin divisiones celulares aparentes [61].
Por lo tanto, la mayoría de las monocotiledóneas son
huéspedes pobres para A. tumefaciens [11, 84, 85].
Los métodos comúnmente utilizados para la
transformación de dicotiledóneas mediada por A.
tumefaciens, como los métodos de disco foliar,
dependen en gran medida de la respuesta de las
plantas a las heridas y no son muy útiles para las
monocotiledóneas. Si las principales funciones de las
heridas en el proceso de transformación son la
producción de moléculas inductoras de virus y la
inducción de la síntesis de ADN y la rápida división de
las células, los tejidos en crecimiento activo de las
monocotiledóneas podrían ser transformables en
presencia de compuestos inductores de virus. Los
informes sobre la transformación exitosa de
monocotiledóneas apoyan esta hipótesis [48, 58]. Los
tejidos formados por células en división activa se
cocultivaron con
A. tumefaciens en presencia de 100 M de acetosirina.
Los cultivos de callos son excelentes fuentes de
células para la producción de arroz transgénico [27,
48, 87]. El uso de callos embriogénicos en
crecimiento activo es uno de los factores más
importantes para una transformación eficiente.
Dichos callos pueden obtenerse a partir de embriones
maduros o inmaduros. Otros tejidos, incluyendo
ápices de brotes, inflorescencias inmaduras y raíces
jóvenes, también pueden producir callo embriogénico
pero no han sido probados extensivamente. El cultivo
 211
de alta frecuencia de callos de arroz transgénico. En
a partir de dichos embriones gracias a la optimización
tales casos, un gen para GUS, que tiene un intrón en la
del procedimiento [2]. Otras mejoras del
región N-terminal de la secuencia codificante y está con-
procedimiento podrían permitir el uso de embriones
nectado al promotor 35S del virus del mosaico de la
maduros en una transformación eficiente.
coliflor,
El uso directo de células en cultivos en suspensión
para la cocultivación dio bajas frecuencias de
expresión transitoria de la actividad GUS y bajas
frecuencias de transformación estable, a pesar de que
dichas células proliferan activamente [48]. El
precultivo de células en medio sólido durante varios
días dio lugar a una transferencia de genes de alta
frecuencia. Así pues, los cultivos líquidos de células de
arroz parecen inadecuados para la transformación
mediada por Agrobacterium.
Se observó una fuerte expresión transitoria de GUS
en tejidos apicales de brotes de arroz que habían sido
cocultivados con A. tumefaciens [48, 75, 76]. Por lo
tanto, la transferencia de ADN-T a estos tejidos podría
ser bastante eficiente. Un problema asociado con
estos tejidos es, sin embargo, que las células que se
dividen más y finalmente dan lugar a órganos
reproductivos son muy limitadas. La producción de
plantas transgénicas a partir de estos tejidos podría
ser difícil a menos que la eficiencia de la
transformación sea extremadamente alta. Muy
recientemente, se informó de la producción de plantas
transgénicas de arroz a partir de ápices de brotes
aislados, aunque la frecuencia de transformación fue
muy baja [81]. No obstante, el uso de plantas intactas
sin un paso de cultivo de tejidos en la transformación
tiene importantes ventajas obvias y se necesitan
claramente más estudios para mejorar la eficiencia de
la transformación.

Composición de los medios

La composición del medio de cocultivo es un factor

importante que afecta a la eficacia de la
transformación, y son preferibles los medios que
puedan favorecer la división activa de las células. El
medio N6 simple modificado que contiene
acetosiringona, ácido 2,4-diclorofenoxiacético (2,4-D) y
casaminoácido es adecuado para la cocultivación [48].
Los medios solidificados con un agente gelificante son
mejores para la cocultivación que los medios líquidos.
Cuando la cocultivación se lleva a cabo en medio
líquido durante varios días con callos de arroz, la
expresión transitoria de GUS tras el cocultivo es
extremadamente baja. La optimización del medio
puede ser necesaria, dependiendo del genotipo del
arroz o del tipo de material, y puede lograrse
monitorizando la expresión transitoria de los genes
marcadores. Las condiciones que permiten una
expresión de alto nivel de los marcadores tras el
cocultivo se asocian generalmente con una producción
212
cepas eran la cepa "normal" LBA4404 [49] y la cepa
es muy útil porque la actividad GUS se expresa en
"supervirulenta" EHA101. Los vectores eran
las células vegetales pero no en las células deA.
pIG121Hm, un derivado del vector binario "normal"
tumefaciens [79, 103].
pBIN19 [10], y pTOK233, un derivado de un vector
Las plantas transgénicas se regeneran mediante
"supervirulento" [50].
embriogénesis somática después de la trans-
formación mediada por Agrobacterium por los
métodos descritos por Hieiet al. [48]. El
mantenimiento del estado embriogénico de los
callos en el medio de selección es importante para la
eficiente recuperación de regenerantes. Las técnicas
de embriogénesis somática a partir de cultivos de
callos han sido bien establecidas para varios
genotipos de arroz. Por lo tanto, parece probable
que los métodos mediados por Agrobacterium
puedan utilizarse para muchas variedades de arroz
con la introducción de los medios que permitan la
aplicación satisfactoria de dichas técnicas.
La inclusión de un agente selectivo en los medios
de regeneración y enraizamiento favorece
enormemente la producción de plantas transgénicas
que expresen transgenes de forma estable. Aldemita
y Hodges [2] utilizaron un medio de regeneración sin
higromicina y menos del 50% de sus regen- erantes
fueron GUS-positivos en un ensayo histoquímico de
plantas en algunos experimentos. Hieiet al. [48] y
Komari et al. [70] añadieron higromicina a sus
medios de regeneración y el 85% de los
regenerantes expresaron de forma estable el gen
para GUS.

Cepas bacterianas y vectores

Se ha aislado un gran número de cepas de A.

tumefaciens y varias de ellas han sido modificadas
para su uso en transformación (Tabla 2). La cepa
A281 [108] es una cepa "supervirulenta", y su rango
de hospedadores es más amplio y su eficiencia de
transformación es mayor que la de otras cepas [51,
67]. Estas características se deben al plásmido Ti,
pTiBo542, que alberga esta cepa [53, 69]. Se han
desarrollado dos nuevos tipos de sistemas basados
en pTiBo542. El primero se refiere a la cepa EHA101
[52], que porta una versión "desarmada" de
pTiBo542. El segundo consiste en un vector
"superbinario", en el que un fragmento de ADN que
incluía virB, virC y VirG de la región de virulencia de
pTiBo542 se ha introducido en un pequeño plásmido
portador de ADN-T [68] que se utiliza para la síntesis
de pTiBo542.
en un sistema de vectores binarios. Estos sistemas
han desempeñado un papel importante en los
estudios sobre la transformación del arroz y otras
monocotiledóneas.
Hiei et al. [48] probaron la eficacia de varias
combinaciones de dos cepas y dos vectores. Las
 213
Tabla 2. Cepas de Agrobacterium tumefaciens Cepas de Agrobacterium tumefaciens.

Cepa Características Referencias

Aislados
originales Albergando el plásmido Ti A6, tipo octopina Garfinkel et al., 1980 [34]
A6
B6S3 Albergando el plásmido Ti B6S3, tipo octopina De Greve et al., 1980 [26]
ATCC15955 Albergando el plásmido Ti 15955, tipo octopina Barker et al., 1983 [9]
Ach5 Albergando el plásmido Ti Ach5, tipo octopina Hoekema et al., 1983 [49]
T37 Portador del plásmido Ti T37, tipo nopalina Sciaky et al., 1978 [93]
C58 Portador del plásmido Ti C58, tipo nopalina Casse et al., 1979 [17]
Bo542 Alberga el plásmido Ti Bo542, tipo agropina; la virulencia de esta cepa es Guyon et al., 1980 [42]
más débil que la de la cepa A281 Hoodet al., 1986 [52]
Ag162 Albergando el plásmido Ti Ag162, tipo octopina Knauf et al., 1984 [65]

Cepa curada
A136 Derivado de la cepa C58 curado del plásmido Ti, incapaz de inducir tumores Sciaky et al., 1978 [93]
C58C1 Derivado de la cepa C58 curado del plásmido Ti, incapaz de inducir tumores Casse et al., 1979 [17]

Tensión reconstruida
A348 Derivado de A136 con pTiA6 Garfinkel et al., 1980 [34]
A208 Derivado de A136 con pTiT37 Sciaky et al., 1978 [93]
A281 Derivado de A136 con pTiBo542, supervirulento Guyon et al., 1980 [42]
Hood et al., 1986 [52]
A856 Derivado de A136 con pTiAg162 Knauf et al., 1984 [65]

Tensión desarmada
LBA4404 Derivado de Ach5 que alberga pAL4404, construido mediante la eliminación de Hoekemaet al., 1983 [49]
toda la región T-DNA de pTiAch5
C58C1 (pGV3850)alberga pGV3850, construido mediante la sustitución de la región de ADN-T
Zambryskiet al., 1983
[115] entre ambos límites de pTiC58 con pBR322
GV3Ti11SEDerivado de C58C1 que alberga pTIB6S3-SE, construido mediante la eliminación deFraley et al., 1985 [30]
toda la región de ADN-T de pTiB6S3 excepto su límite izquierdo, el gen 7 y el gen 5
EHA101Derivado de A281 que alberga pEHA101, construido con la sustitución de la región de ADN-T Hood et al., 1986
[52] de pTiBo542 por el gen nptII. La eliminación completa del ADN-T
los límites no están confirmados, super-virulentos

vector "binario" pTOK162 [68] (Figura 1). En los
experimentos de transformación, LBA4404 (pTOK233)
fue ligeramente más eficaz que LBA4404 (pIG121Hm)
y EHA101 (pIG121Hm) con el cultivar Tsukinohikari, y
fue sin duda el más eficaz con el cultivar Koshihikari.
Por razones desconocidas, E H A 1 0 1 (pTOK233) no
fue muy eficaz en la transformación del arroz. En
resultados recientes, LBA4404 (pTOK233) fue
definitivamente eficaz en la transformación del arroz
Javanica [27]. Estos datos sugieren que una
combinación "ordinaria" de vector/cepa se asemeja,
mejorada, a las combinaciones en la transformación
de cultivares que son "fáciles" de cultivar en cultivo de
tejidos. Por el contrario, la elección de vectores y
cepas es importante para la transformación de
cultivares "difíciles". Sin embargo, sólo un número
limitado de cepas
y el uso de otras cepas podría mejorar aún más la
eficacia de la trans- formación.
La transformación de cultivares Japonica fue
posible cuando la concentración del inóculo estaba
entre 1:0 106 y 1:0 1010 ufc/ml de la cepa LBA4404 de
A. tumefaciens (pTOK233) y alrededor de 1 :0 109
ufc/ml fue la concentración óptima [48].
Genotipos de arroz
Hiei et al. [48] informaron de que A. tumefaciens
puede transformar eficazmente varios cultivares de
arroz japónica, incluido el Koshihikari. Koshihikari es
bien conocido por la alta calidad de su grano y
muchos de los
214

Figura 1 . Representación esquemática de la expresión de cepas oAf . tumefaciens y vectores. A, cepa de tipo salvaje; B, cepa desarmada; C,
cepa portadora de un vector binario; D, cepa portadora de un vector superbinario. Abreviaturas; Vir, región de virulencia; S Vir, fragmento
que contiene los genes virB y virG de pTiBo542.

Los nuevos cultivares japoneses de élite están Qing Ai 1,

emparentados con Koshihikari. El Koshihikari y los
cultivares relacionados también son conocidos por su
escasa respuesta en el cultivo de tejidos y por las
dificultades asociadas a su transformación. El
establecimiento de un método rutinario y eficiente
para la transformación de Koshihikari debería
contribuir considerablemente a la mejora de los
cultivares de arroz japoneses mediante ingeniería
genética. Dong et al. [27] informaron de la
transformación mediada por Agrobacterium de los
cultivares de Javanica Gulf- mont y Jefferson que son,
respectivamente, ampliamente utilizados o están a
punto de entrar en el cultivo comercial en el sur de
EE.UU..
Rashid et al. [87] obtuvieron plantas transgénicas
de cultivares Bas- mati de arroz Indica. La mayoría de
las variedades Indica pertenecen a un grupo diferente,
el grupo I, cuando los cultivares de arroz se clasifican
en función de los resultados del análisis isoenzimático
[36]. Estas variedades Indica son genéticamente
recalcitrantes tanto en el cultivo de tejidos como en el
intento de transformación. En 1996, Aldemita y
Hodges informaron del éxito de la transformación por
A. tumefa- ciens de dos cultivares del grupo I, TSC10 e
IR72 [2], un paso importante hacia la modificación
genética del arroz Indica. Infectaron embriones
inmaduros con LBA4404 (pTOK233), un vector
superbinario, y la frecuencia de transformación
(número de plantas transgénicas
independientes/número de embriones 100%) se situó
entre el 1% y el 5%. También hemos logrado la
producción eficiente de transformantes de variedades
del grupo I de arroz Indica, incluidas Nan Jin 11, Xin
 215
Suewon 258, IR8, IR24, IR26, IR36, IR54, IR64 y
IR72, por un método similar.
A diferencia de los del arroz Japonica, los callos
embriogénicos de las variedades Indica no han sido
buenos materiales de partida para la transformación
mediada por Agrobacterium, probablemente porque
los callos Indica tienden a crecer muy lentamente. En
cambio, los embriones inmaduros recién aislados
están formados por células que se dividen
activamente. Por lo tanto, para la transformación de
la mayoría de las variedades de arroz Japonica y
algunas Indica [87], que producen callos
embriogénicos de crecimiento rápido, los cultivos de
cali son los materiales de partida preferidos. Se
puede preparar un gran número de piezas de callo
más fácilmente que de embriones inmaduros. Para la
transformación de otras variedades, como las
variedades del grupo I de arroz Indica, los embriones
inmaduros son probablemente los materiales más
adecuados.

Genes marcadores seleccionables

El gen de la neomicina fosfotransferasa n[ptII,

también llamado aph( )II o neo] se utilizó en muchos
30

de los primeros intentos de transformación directa

del arroz. Este gen confiere resistencia al antibiótico
aminoglucósido kanamicina. Aunque la kanamicina
puede utilizarse como agente de selección durante la
regeneración de protoplastos, no es eficaz para la
selección de calos transformados. Además, muchos
callos recuperados tras la selección con kanamicina
son incapaces de regenerar plantas verdes [8, 99].
G418 es un antibiótico aminoglucósido relacionado
que también es inactivado por la neomicina
fosfotransferasa. No sólo
216
observaciones similares con plantas transgénicas
fue la selección de callos transformados más eficiente
derivadas de
utilizando G418 que kanamicina, pero los callos
seleccionados con G418 tuvieron una mayor frecuencia
de regeneración en plantas verdes que los
seleccionados con kanamicina [8]. En la transformación
mediada por Agrobacterium, los callos transformados
de forma estable pueden producirse eficientemente
con G 4 1 8 , pero la ausencia de regenerantes sugiere
que la exposición de las células a G418 durante mucho
tiempo inhibe la regeneración [2].
Otro marcador seleccionable ampliamente utilizado
y más eficaz es la higromicina fosfotransferasa h( pt,
aph- IV o hph), que confiere resistencia al antibiótico
amino-glucósido higromicina. La higromicina permite
discriminar claramente entre tejidos transformados y
no transformados y no se han descrito problemas con
los albinos ni con la fertilidad de los regenerantes [8].
El gen hpt se ha utilizado como un gen marcador eficaz
para la selección tras la transformación mediada por
Agrobacterium [2, 27, 48, 87].
Otros posibles agentes selectivos son los herbicidas.
Se han aislado genes de resistencia a varios herbicidas
de importancia comercial. Entre ellos, el gen bar de la
fosfinotricina acetiltransferasa podría ser el más
valioso en el arroz [8]. El gen bar confiere resistencia a
la L-fosfinotricina (PPT), al glifosinato (una sal amónica
de la PPT) y al bialafos (un derivado de la PPT). El gen
bar se ha utilizado con éxito para seleccionar callos y
plantas transgénicas de arroz en varios laboratorios
[16, 20, 23, 88].
En muchos intentos exitosos de transformar arroz,
los genes de marcadores seleccionables han sido
dirigidos por el promotor CaMV35S de expresión
constitutiva. Este promotor parece dirigir una
expresión suficientemente fuerte de los genes para la
selección de transformantes con alta frecuencia. Sin
embargo, el nivel de expresión de este promotor en
cereales es hasta 100 veces menor que en
dicotiledóneas [33, 44]. Diferentes promotores, como
el del gen de la ubiquitina 1 (Ubi1 ) del maíz, y
elementos que potencian la expresión génica, como los
intrones, han sido probados con éxito en otros cereales
[105]. El uso de promotores y elementos más potentes
para la expresión de genes marcadores puede mejorar
aún más la eficiencia de la transformación del arroz
porA. tumefaciens.

Características del arroz transgénico y estabilidad

de los genes introducidos

En un estudio realizado en 1994, Hiei et al. [48]

descubrieron que casi todas sus plantas transgénicas
de arroz japónica tenían una morfología normal y que
el 70% eran completamente fértiles. Se hicieron
 217
eraciones había perdido los genes. El ADN de los
Variedades índicas. Cabe señalar que un cultivo
descendientes seleccionados se analizó mediante
prolongado durante la selección tiende a reducir la
hibridación Southern y
altura y la fertilidad de las plantas.
se demostró una estrecha correlación entre el
Se analizaron mediante hibridación Southern los
fenotipo y el genotipo.
genomas de 60 plantas transgénicas de arroz
japónica independientes, positivas para GUS y
resistentes a la higromicina, que habían sido
transformadas con EHA101 (pIG121Hm) o LBA4404
(pTOK233) [47]. El número de copias de genes
integrados oscilaba entre una y seis, pero la mayoría
de los transformantes contenían una o dos copias de
genes integrados. En varias plantas, los números de
copias de hpt y gus eran diferentes, probablemente
como resultado de la reorganización del ADN
durante la transformación [47].
Entre los regenerantesresistentes a la
higromicinaencontraron ocasionalmente plantas
transformadas con LBA4404 (pTOK233) que
resultaron negativas en un ensayo histoquímico de la
actividad G U S . Algunosotros
transformantes mostraron una expresión dispersa de
GUS. Entre el 10% y el 20% de los transformantes de
arroz presentaban normalmente estas características
indeseables. Analizamos estos trans- formantes
mediante hibridación Southern. Todas las plantas
contenían copias intactas del genhpt. No se
encontraron copias intactas del gen para GUS en 13
de las 20 plantas que dieron negativo para GUS. Así
pues, parte del gen se había perdido durante la
transformación. Las otras siete plantas negativas y las
30 plantas con expresión dispersa de GUS tenían una
o más copias del gen intacto de GUS. Estos
fenómenos estaban probablemente relacionados con
el "silenciamiento génico", que se ha observado en
varios sistemas de transformación [29, 32, 82].
También se observó una expresión dispersa de GUS
en hojas de plantas de arroz transformadas por el
método biolístico [66].
La herencia y la expresión estables de genes
foráneos son de vital importancia en la aplicación
del arroz transgénico a la agricultura, pero no se han
estudiado ampliamente. En muchos casos sólo se
examinó la progenie de R1 . Hiei y Komari [47]
analizaron la herencia de los transgenes hasta las
generaciones4 R para dieciocho plantas de arroz
transgénico primario que habían sido producidas por
métodos mediados por Agrobacterium. Se confirmó
la transmisión mendeliana de los dos genes
marcadores, gus y hpt, y se identificó descendencia
homocigota para los dos genes en las líneas R2 . Se
obtuvieron plantas R3 a partir de la descendencia
homocigota R2 y, por consiguiente, se produjeron
plantas R4 . Los dos genes se expresaron en las
líneas3 Rand
R4 generaciones y ninguna de las plantas de estas gen-
218
una técnica rutinaria en la transformación de plantas
En unos pocos casos, sin embargo, se identificaron
superiores mediada por A. tumefaciens, sobre todo
plantas con expresión dispersa de GUS, que a menudo
porque no se dispone de vectores adecuados. En
se asociaba con un nivel relativamente bajo de
resistencia a la higromicina, en una línea R1 y en dos
líneas R3 independientes tras una fuerte expresión en
generaciones anteriores [47]. Estos rasgos se
heredaron en generaciones sucesivas. También se
observó una expresión dispersa de GUS en algunas
líneas R1 [48]. También se observó la expresión
inestable de un gen trans- en descendientes
homocigotos en plantas de Arabidopsis que habían
sido transformadas por
A. tumefaciens, y se asoció con la metilación de los
transgenes [62]. Dado que se observó una reactivación
de la expresión de GUS tras el tratamiento de
embriones maduros con 5-azacitidina, la expresión
inestable de GUS en arroz transgénico estaba
probablemente relacionada con la metilación de
transgenes [66].

Un sistema de cotransformación para la

generación de arroz transgénico sin
marcadores

Los genes marcadores seleccionables casi siempre se

incluyen en los sistemas de transformación, pero no
suelen ser necesarios una vez que se han producido las
plantas transgénicas. Los genes marcadores en plantas
transgénicas establecidas no sólo son innecesarios, sino
que también pueden crear problemas. Por ejemplo, se
debe utilizar un gen marcador seleccionable diferente
cuando se introducen genes extraños adicionales en
una planta transgénica, pero el número de genes
marcadores disponibles es limitado. La seguridad de
cada gen marcador es otro problema potencial en la
ingeniería genética de plantas. Yoder y Goldsbrough
[112] revisaron ampliamente estas cuestiones.
Obviamente, la demanda de plantas transgénicas libres
de marcadores es alta.
Para hacer frente a este problema, se han
desarrollado varias técnicas de eliminación de genes
marcadores, basadas, por ejemplo, en sistemas de
recombinación de sitios específicos derivados de fagos
[78] [112]. Los sistemas de cotransformación parecen
ser los más sencillos y se han utilizado ampliamente en
la transformación directa [90]. En estos sistemas, un
gen marcador y los genes de interés están codificados
por moléculas de ADN separadas, y las moléculas se
introducen en los genomas de las plantas como
fragmentos no ligados. En consecuencia, los genes no
seleccionables pueden segregar del gen marcador en
la pro- genia.
La cotransformación por A. tumefaciens se ha
examinado en varios laboratorios [112], pero no es
 219

1996, Komari et al. [70] construyeron vectores

superbinarios que portaban dos ADN-T separados
para la transformación conjunta. El primer ADN-T
contenía un gen marcador seleccionable resistente a
fármacos, y se podían introducir varios fragmentos
de ADN en el segundo A D N - T m e d i a n t e un
procedimiento sencillo. Se produjo un gran número
de transformantes de arroz mediante el uso deA.
tumefa- ciens LBA4404 portador de los vectores. La
frecuencia de cotransformación con los ADN-T fue
superior al 47%. Además, la progenie que contenía el
ADN-T no seleccionable y que también estaba libre
del marcador seleccionable se obtuvo a partir de más
de la mitad de los co-transformantes. También se
probó la entrega de dos ADN-T a plantas procedentes
de mezclas de A. tumefaciens, pero la frecuencia de
cotransformación fue relativamente baja. La eficacia
de la cotransformación y la frecuencia de integración
no ligada de los dos ADN-T fueron razonablemente
altas. Dado que se integraron múltiples fragmentos
de ADN en un locus en muchos de los casos de
cotransformación cuando se aplicaron métodos de
transformación directa [22, 88, 95], los vectores
superbinarios parecen proporcionar un sistema de
cotransformación para la producción de
transformantes libres de marcadores de forma más
eficiente que los sistemas de transformación directa.

Conclusión

El suministro de ADN extraño a plantas de arroz a

través de A. tume- faciens es una técnica rutinaria en
un número creciente de laboratorios. Esta técnica
permitirá la mejora genética de diversas variedades
de arroz, así como el estudio de muchos aspectos de
la biología molecular del arroz. Estudios recientes
sobre la transformación del arroz y el maíz por A.
tumefaciens han apoyado firmemente la hipótesis de
que el ADN-T se transfiere de Agrobacterium a
dicotiledóneas y monocotiledóneas mediante un
mecanismo molecular idéntico. Por lo tanto, la
naturaleza monocotiledónea de las plantas ya no
impide la aplicación de las técnicas mediadas por
Agrobacterium para la transferencia de genes a
ciertos cultivos ceráceos importantes. Es muy
probable que los factores clave de la transformación
del arroz analizados en este capítulo también lo sean
en la transformación de otras especies de cereales
importantes. Parece probable que las técnicas de
transferencia de genes mediadas por Agrobacterium
se extiendan a otras especies recalcitrantes tan
pronto como se optimicen los parámetros
metodológicos.
220
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