PRCTICA # 5 TCNICAS BSICAS PARA EL CULTIVO DE MICROORGANISMOS: SIEMBRA Y ESTUDIO DE BACTERIAS

INTRODUCCIN
Para efectuar el estudio de los microorganismos, se han diseado diversos mtodos que permiten cultivarlos bajo condicione artificiales, en los que es posible cultivarlos bajo condiciones experimentales y manejar un solo tipo de microorganismo. Una de las tcnicas ms usadas en el laboratorio de microbiologa consiste en transferir una muestra microbiolgica de un ambiente determinado a un medio de cultivo, lo que permite obtener cultivos microbianos. A l efectuar este procedimiento, es necesario considerar que en el rea de trabajo, existen muchos otros microorganismos; debido a esto, es necesario tomar precauciones para impedir que stos penetren y contaminen los cultivos en estudio. Por otra parte, para considerar no slo el aspecto nutricional, sino tambin las condiciones ambientales de su hbitat natural, por lo que en el medio de cultivo se debe ajustar el pH y concentracin de sales y durante la incubacin condiciones tales como la temperatura, aireacin la luminosidad. La aplicacin de estos procedimientos ha permitido propagar a los microorganismos en cultivos mixtos, as como su aislamiento y la obtencin de cultivos puros, facilitando de este modo, el estudio, caracterizacin, aplicacin y control de los mismos. La forma de sembrarlos y cultivarlos depende del tipo de microorganismo y propsito especfico del estudio.

OBJETIVOS:
Aplicar la tcnica adecuada para preparar el rea de trabajo y evitar contaminaciones. Organizar el material para su fcil manejo e identificacin. Manipular adecuadamente los cultivos puros. Seleccionar y aplicar las tcnicas de siembra adecuadas para alcanzar propsitos especficos. Identificar y describir correctamente las caractersticas culturales y microscpicas de algunas bacterias. Organizar e interpretar los resultados del estudio macroscpico y microscpico de bacterias.

MARCO TERICO:
Cultivar un microorganismo significa promover intencionalmente el desarrollo de ste en medios de cultivo y condiciones de laboratorio controladas. La poblacin de microorganismos desarrollada en un medio se denomina cultivo. Cuando ste contiene una sola especie de microorganismo, se denomina cultivo puro o axnico, cuando contiene ms de una especie de microorganismos se denomina cultivo mixto. Un cultivo tipo contiene una especie conocida de microorganismos y es conservada en el laboratorio para realizar diversos ensayos y estudios. Un cultivo axnico consiste en una sola especie microbiana, proveniente de una sola clula. Los cultivos axnicos son muy raros en la naturaleza. En los medios naturales -por ejemplo, en el suelo, agua, o en el cuerpo humanoexisten cultivos mixtos. En un cultivo mixto, viven muchas y diferentes especies de forma conjunta. Un cultivo axnico se obtiene artificialmente en el laboratorio. A la hora de obtener un cultivo axnico se han de tomar precauciones especiales, ya que los microorganismos estn por todas partes, en la naturaleza, en el laboratorio y en los instrumentos y recipientes usados en los experimentos. Estos microorganismos no deseados o contaminantes deben ser eliminados de un cultivo para que ste pueda ser axnico. El segundo paso para obtener un cultivo axnico es inocular o introducir, una sola clula de un microorganismo en un medio slido o liquido, esterilizado previamente. De esta manera, aislamos un solo microorganismo del resto y se podr multiplicar en condiciones favorables. Un clon est constituido por una poblacin de clulas descendientes de un solo microorganismo. Una colonia es un clon lo suficientemente grande como para ser visible sobre la superficie de un medio slido. Un cultivo microbiano que ha estado creciendo por cierto tiempo en el mismo tubo o matraz, debe ser transferido a un medio de cultivo nuevo, de otra manera el crecimiento y sobrevivencia no pueden continuar. En esta transferencia se deben considerar dos aspectos bsicos referentes a: no introducir microorganismos indeseables (contaminantes) y concentracin o carga microbiana de la muestra (inculo) a sembrar.

Para impedir la contaminacin de los cultivos, es necesario tener plena conciencia de la ubicuidad de los microorganismos, lo que determina que el are y todas las superficies estn densamente pobladas por microorganismos, de este modo en la transferencia de una muestra microbiolgica a otro recipiente, se deben tener una serie de cuidados que eliminen los riesgos de contaminacin. Estos incluyen el rea de trabajo, el lavado de las manos, la esterilizacin de todos los utensilios y medios de cultivo a emplear y realizar la transferencia del microorganismo en una zona estril, la que se obtiene trabajando cerca de la flama del mechero. Al conjunto de procedimientos realizados para prevenir o evitar la contaminacin se le llama tcnica asptica; el seguimiento cuidadoso y detallado de la misma evita accidentes tales como: o o La contaminacin y prdida del cultivo en estudio La salida y dispersin de microorganismos del cultivo, lo que ocasionara la contaminacin de utensilios, productos y del personal. Este ltimo aspecto es particularmente importante cuando se trabaja con cultivos de microorganismos patgenos.

Con relacin a la concentracin del inculo, un error frecuente del principiante consiste en tomar muestras grandes, lo que es innecesario. Una colonia de bacterias del tamao de la cabeza de un alfiler contiene varios millones de microorganismos, es obvio que con una cantidad pequesima (casi invisible) que se adhiera al asa, ser ms que suficiente para efectuar una transferencia exitosa. Dispositivos empleados en la transferencia de muestras microbianas: hisopo, pipeta (para uso microbiolgico son terminales y la parte superior o boquilla debe estar protegida con filtro de algodn), pipeta pasteur, cable de Kolle o portasa con alambre de platino dispuesto en forma de: aguja, asa, esptula y/o gancho. En la transferencia de microorganismos se emplean agujas, asas de inoculacin, hisopos, pipetas o pipetas pasteur que debern esterilizarse previamente. La utilizacin de estos dispositivos, as como de los diferentes medios de cultivo tienen aplicaciones especficas. Por ejemplo: los medios lquidos se preparan en tubos o matraces que se cubren con tapones de algodn o tapones especiales. Un cultivo lquido puede ser transferido mediante un asa microbiolgica, un hisopo, pipeta o pipeta pasteur; el inculo se deposita dentro del caldo o medio lquido. En este tipo de cultivos los microorganismos presentan un desarrollo particular que se manifiesta en la superficie o a travs de todo el lquido. Una de las ventajas que presenta este tipo de cultivo se refiere a la posibilidad de agitarlos acelerando la velocidad de microorganismos anaerobios, por otra parte, en este tipo de cultivos, las poblaciones se encuentran suspendidas y e fcil homogenizarlas, lo que permite estandarizar la concentracin del inculo. La desventaja que presentan, e que en ellos e difcil detectar contaminacin a simple vista. Los medios semislidos e preparan en tubos, se inoculan con aguja de siembra (asa recta) o pipeta pasteur; en este ltimo caso es necesario calentar el medio y cuando se encuentra en estado lquido y a una temperatura de aproximadamente 42C se agrega el inculo, se homogeniza y se deja solidificar. Estos medios se emplean para estudiar la movilidad de los microorganismos y para favorecer la separacin de microorganismos con diferentes requerimientos de oxgeno. Los medios slidos e preparan en tubos o matraces dependiendo de la cantidad o de las necesidades, despus de esterilizarlos, estos se inclinan o vierten en cajas de petri. La siembra se realiza con el asa, inoculando la superficie del agar con mucha suavidad; en estos medios, los microorganismos al multiplicarse forman agregados que se hacen visibles a simple vista; a estos agregados se les denominan colonias, las que presentan caractersticas que varan con el tipo de microorganismo cultivado y el medio de cultivo empleado. En cualquier medio de cultivo es de primordial importancia ajustar el pH, ya que an cuando la mayora de los microorganismos crecen mejor en pH neutro, algunos requieren de pH alcalino o cido, por lo que al proporcionar un pH adecuado se favorecer el crecimiento del microorganismo de inters y la obtencin del cultivo. Con este mismo propsito durante la incubacin se deben proporcionar las condiciones adecuadas para el microorganismo en estudio. El crecimiento ptimo de los microorganismos se presenta a temperaturas que la mayora de las veces estn relacionadas con la de su hbitat natural. Algunos microorganismos crecen por debajo de 15C, otros requieren temperaturas ms elevadas (30 a 45C) y algunos hasta 80C. Para alcanzar y mantener estas temperaturas se puede usar una incubadora microbiolgica o un bao de agua a temperatura constante, en tanto que para lo microorganismos que presentan su crecimiento ptimo a temperaturas entre 20 y 25C se pueden incubar en la gaveta o cajn del laboratorio, a temperatura ambiente. En general las incubadoras microbiolgicas satisfacen las necesidades en cuanto a los rangos de temperatura requeridas por los microorganismos. La desventaja que tienen es que estos aparatos funcionan con are seco, lo que determina la deshidratacin de los medios de cultivo. Por lo tanto, el crecimiento de cualquier cultivo

experimental que se realice en incubadora no debe prolongare por ms de nueve das. Con relacin a las necesidades gaseosas, no todos los microorganismo crecen en presencia de oxgeno atmosfrico; los que slo crecen en presencia de are se llaman aerobios obligados; los que slo crecen en ausencia de oxgeno se denominan anaerobios obligados o estrictos, un tercer grupo se adapta a las dos condiciones y se le conoce como facultativos. Existe una cuarta categora que comprende bacterias que requieren oxgeno, pero slo lo utilizan cuando ste existe en concentraciones reducidas; a estos se les llama microaeroflicos. El desarrollo de estos diferentes grupos e favorece mediante la agitacin de los cultivos o mediante la exclusin de oxgeno para lo que se emplean sustancias reductoras o equipos especiales. Las bacterias son organismos procariticos, se encuentran ampliamente distribuidas en la naturaleza, habitan en el agua, el suelo, en la superficie o en el interior de plantas y animales incluyendo al hombre. Pueden vivir en forma libre o en simbiosis con otros organismos, ya sea como parsitos, comensales o mutualistas. Fisiolgicamente este grupo presenta caractersticas muy variables, hay bacterias mviles e inmviles fotosintticas y quimiotrficas, auttrofas y hetertrofas; se desarrollan en un rango muy amplio de temperatura, pH y condiciones gaseosas. En el estudio de cultivos bacterianos algunos de los criterios que se emplean para caracterizarlas incluyen: tamao, morfologa celular, forma de agrupacin, reaccin a la tincin de Gram, formacin de esporas, movilidad, presencia de inclusiones de reserva y caractersticas culturales en medios lquidos y slidos en los que presentan patrones de desarrollo en cuanto a la forma, tamao, elevacin y color de las colonias. Tcnicas de siembra: El mtodo de siembra por estra en placa Es el mtodo ms fcil y el ms usado para obtener cultivos axnicos. Para ello, con un asa de siembra se toma una muestra de la poblacin mixta y a continuacin se hacen estras sobre la superficie de un medio slido preparado en una placa Petri (a las placas Petri tambin se les denomina simplemente placas). Conforme se van haciendo estras en zigzag con el asa, cada vez se van depositando en la superficie del medio menos microorganismos. A continuacin, se flamea el asa, se toca en la regin donde se han realizado las ltimas estras y se contina la siembra con la misma tcnica, en la superficie de medio sin sembrar an. Repitiendo este proceso varias veces se logra separar clulas individuales. A continuacin, las placas se incuban en un lugar adecuado, permitiendo que las clulas aisladas experimenten un nmero suficiente de divisiones para formar colonias visibles. Aunque cada colonia posiblemente representa un clon derivado de una sola clula, no podemos asegurarlo. Quizs, dos clulas quedaron depositadas tan juntas que han originado una nica colonia mixta. Por tanto, para asegurarnos de que hemos obtenido un cultivo axnico, conviene repetir el procedimiento a partir de una colonia bien aislada en la primera placa. Las colonias que se desarrollen la segunda vez, sern, casi con toda seguridad, cultivos axnicos. Los mtodos de vertido en placa y extensin en placa En estos mtodos, las suspensiones de clulas microbianas se diluyen antes de su siembra en placa. Se siguen estas tcnicas cuando la muestra contiene tantos microorganismos, que la dilucin no se puede realizar en una sola etapa. Por ejemplo, una suspensin con mil millones de clulas por mililitro debe ser diluida 107 veces para obtener una suspensin con un centenar de clulas por mililitro, Por tanto, se realizan diluciones seriadas (en varias etapas), normalmente de diez en diez, pero a veces de cien en cien. Para realizar diluciones de diez en diez, se aade 1 ml de la suspensin bacteriana a 9 ml (le medio estril o solucin salina, igualmente estril. Se agita vigorosamente para diluir las clulas y el proceso se repite cuantas veces sea necesario. A continuacin, se puede proceder de dos maneras diferentes. En el mtodo de vertido en placa, las muestras diluidas se mezclan con agar fundido y se vierten en placa. Algunas colonias quedarn embebidas en el agar y otras crecern en la superficie. Las colonias superficiales se extendern y sern ms grandes. En el segundo mtodo (extensin en placa), las muestras diluidas se siembran directamente en la superficie de la placa de agar, extendindolas con avuda de un asa de Diralsky de cristal estril. La suspensin se absorbe en el agar, dejando las clulas microbianas sobre la superficie. En ambas tcnicas las placas se incuban hasta la aparicin de las colonias. Como en el mtodo de siembra por estra, no existe la seguridad de que las colonias que aparecen en las placas sembradas por extensin o en el agar solidificado sembrado por el mtodo del vertido en placas sean cultivos axnicos hasta que se repita el proceso. Las dos tcnicas de siembra por dilucin presentan la ventaja de que permiten obtener un mayor nmero de colonias aisladas que el mtodo de siembra por estra, por tanto se eligen cuando se ha de seleccionar una cepa a partir de una mezcla con varios tipos de microorganismos. Para obtener un cultivo axnico mediante este mtodo:

(a) Hacer diluciones seriadas de la suspensin bacteriana hasta obtener una muestra con slo unos pocos cientos de bacterias (b) verter la muestra en un tubo con agar a sobrefusin, mezclar y verter el contenido en una placa Petri. (c) Despus de la incubacin, se desarrollan colonias en el agar (ms pequeas) y en su superficie (ms grandes). Mtodo de aislamiento por siembra por estra en placa: Para obtener un cultivo axnico: (a) esterilizar un asa de siembra por flameado en la llama de un mechero (b) introducirla en la suspensin bacteriana para recoger una muestra (c) sembrar haciendo estras sobre la superficie de un medio slido en una placa Petri, y (d) volver a esterilizar el asa, tocar en la zona de la placa ya sembrada y hacer un segundo grupo de estras en una regin nueva de la placa. Repetir el proceso una tercera y una cuarta vez, hasta conseguir que los grupos de clulas se diluyan y se separen clulas aisladas. (e) Despus de la incubacin, se desarrollan colonias aisladas. Para estar seguro de que el cultivo es puro, repetir el proceso entero; para ello tomar una colonia aislada y sembrar por estras una segunda placa.

El crecimiento de los cultivos axnicos Una vez que se obtiene un cultivo puro, normalmente se ha de propagar (se le hace crecer de nuevo). Para cultivar microorganismos en el laboratorio, se ha de preparar un medio de cultivo, lquido o slido, con todos los nutrientes necesarios para su crecimiento. Los medios slidos se hacen generalmente, aadiendo agar a los lquidos. Tipos de medios de cultivo El tipo de medio que utiliza un microbilogo depende del microorganismo que est cultivando y el porqu de dicho cultivo. Los microorganismos presentan una enorme variedad de requerimientos nutricionales. Se utiliza un medio mnimo para determinar los requerimientos nutricionales de un organismo y un medio rico si se desea obtener masa celular de una forma rpida. Los medios se pueden formular para el desarrollo de una especie o para distinguir entre especies o cepas. Por tanto, los medios se clasifican en definidos, complejos o indefinidos, selectivos, diferenciales, selectivos-diferenciales y de enriquecimiento, dependiendo de su composicin y uso. Medios definidos Un medio definido es aquel del cual conocemos su composicin qumica exacta, porque ha sido preparado a partir de compuestos qumicos puros. Echerichia coli es capaz de crecer en un medio qumicamente definido, de

composicin bastante sencilla. Este microorganismo requiere una fuente de carbono orgnica (por ejemplo, glucosa), pero puede obtener el resto de los nutrientes esenciales a partir de sales minerales. En cambio, otros organismos, denominados exigentes, requieren medios qumicamente muy complejos. Por ejemplo, la bacteria Leuconostoc citrovorum es extraordinariamente exigente ya que requiere un medio con muchos ingredientes. Los medios definidos se usan generalmente para realizar estudios genticos, pero sus inconvenientes a menudo sobrepasan sus ventajas. As, se requiere un tiempo considerable para preparar un medio definido y las bacterias crecen ms despacio en ellos. Adems, no conocemos los requerimientos nutricionales de todas las bacterias y, por tanto, no siempre pueden utilizarse. Medios complejos Se desconoce la composicin qumica exacta de un medio complejo. Estos medios se preparan a partir de extractos de productos naturales tales como carne, sangre, casena (la protena de la leche), levaduras o soja. Un medio lquido complejo se denomina caldo. La casena u otras protenas que se aaden a los medios son usualmente hidrolizadas con enzimas o en medio cido, para hacerlas ms solubles y, por tanto, ms fciles de utilizar nutricionalmente. Una hidrlisis parcial rompe las protenas en pptidos. Una hidrlisis total las degrada hasta aminocidos. A las protenas parcialmente hidrolizadas se les denomina peptonas. Entre las peptonas comerciales se encuentra la proteosa-peptona, la triptona y la triptosa. A la casena totalmente hidrolizada se le denomina hidrolizado de casena. Los diversos componentes de un medio complejo se venden como polvos deshidratados. Tambin existen ya cientos de mezclas complejas que se comercializan como medios complejos especficos. Uno de estos medios es el caldo nutritivo, probablemente el medio complejo que ms se utiliza. Cuando este medio se solidifica con agar, se denomina agar nutritivo. Generalmente se prefiere la utilizacin de los medios complejos, ya que son fciles de preparar y permiten un crecimiento rpido de los microorganismos. Medios selectivos Un medio selectivo favorece el crecimiento de ciertos microorganismos, mientras suprime el crecimiento de otros. Los medios selectivos se utilizan para aislar especies particulares a partir de una mezcla compleja. Por ejemplo, se utiliza un medio selectivo, para aislar Salmonella typhi, agente causal de la fiebre tifoidea, a partir de heces donde existen cientos de microorganismos diferentes. Algunos medios son selectivos porque contienen un producto qumico, como la azida sdca, el telurito potsico o el cristal violeta, que inhiben el desarrollo de algunos microorganismos pero no de otros. El agar SPS (denominado de esta forma porque contiene sulfadiacina y sulfato de polimixina) se utiliza para identificar Clostridium botulinum, agente causal de una grave intoxicacin alimentaria. El medio SPS permite el crecimiento de esta bacteria, pero inhibe el de otras especies de Clostridium. otros medios de cultivo selectivos utilizan un valor extremo de pH o una fuente de carbono poco comn. Medios diferenciales Se utiliza un medio diferencial para identificar las colonias de un determinado microorganismo. Por ejemplo, para identificar Streptococcus pyogenes, la bacteria que causa la escarlatina, se utiliza el medio de agar sangre es un agar que contiene hemates. Las colonias de esta bacteria muestran a su alrededor una zona transparente debido a que producen hemlisis (muerte y lisis de los hemates). Escherichia coli y las bacterias relacionadas con ella se identifican en medios con un indicador de pH porque originan productos metablicos cidos, que cambian el color del indicador y por tanto de sus colonias. Medios selectivos-diferenciales Algunos medios son selectivos y diferenciales al mismo tiempo. El agar MacConkey es un ejemplo de medio selectivo-diferencial, utilizado para detectar cepas de Salmonella y Shigella, bacterias entricas (del intestino) que causan disenteras. Cualquier muestra de heces enviada al laboratorio esta plagada de bacterias pertenecientes a muchas especies. El agente selectivo del MacConkey acta como una especie de tamiz grosero que disminuye el campo de identificacin. El cristal violeta y las sales del medio inhiben el crecimiento de la mayora de las bacterias Gram positivas (Salmonella y Shigella son Gram negativas). A partir de aqu, el componente diferencial del medio, en este caso la lactosa, comienza a ser importante. Salmonella y Shigella no fermentan la lactosa, pero la mayor parte de las enterobacteras s lo hacen. Por tanto, las colonias de estas dos bacterias sern rojas, mientras que las restantes no lo sern. Medios de enriquecimiento

Un medio de enriquecimiento se utiliza para aislar un tipo particular de microorganismo a partir de una poblacin mixta de gran tamao. Por ejemplo, las bacterias formadoras de endosporas pueden aislarse hirviendo una muestra de suelo y cultivando los supervivientes. Solamente las endosporas resistirn el tratamiento y podrn crecer. Las bacterias lijadoras de nitrgeno pueden seleccionarse cultivando el inculo de suelo en un medio libre de nitrgeno, donde slo ellas podrn crecer porque obtienen el nitrgeno de la atmsfera. Los eclogos microbianos usan frecuentemente medios de enriquecimiento. Por ejemplo, para encontrar un microorganismo que degrade un determinado compuesto qumico txico, se puede inocular la muestra de suelo en un medio en el cual la nica fuente de carbono sea dicho compuesto. El microorganismo que prospere en l podr ser utilizado en biorremediacin. Condiciones ambientales idneas para el cultivo en el laboratorio Un medio se formula para suministrar todos los nutrientes que un microorganismo necesita para crecer, pero esto no es suficiente. En el laboratorio, tambin es preciso aportar las condiciones ambientales adecuadas. Tanto la temperatura como el pH deben estar dentro del intervalo apropiado; con respecto al oxigeno, segn el caso, ser aportado o eliminado. Temperatura Cada especie bacteriana se caracteriza por un intervalo de temperatura en el cual presenta su crecimiento ptimo. Pero, en general, los microorganismos crecen ms rpidamente cuando se aumenta la temperatura, sin llegar hasta un punto en el cual se daan las protenas. As pues, para favorecer un crecimiento rpido, las bacterias se suelen cultivar a la temperatura ms alta a la cual crecen bien, y que suele ser la de su medio natural. Escherichia coli la bacteria que ms frecuentemente se utiliza en investigacin, se encuentra en el intestino humano y de otros mamferos. Este microorganismo crece ptimamente a 37C, la temperatura del cuerpo humano. Los cultivos se mantienen a temperatura constante en incubadores o en baos de agua, ambos controlados termostticamente. Los incubadores, o estufas, son cmaras con aire adecuados para el crecimiento tanto de cultivos slidos como lquidos, preparados en cualquier recipiente, incluyendo placas Petri, tubos de ensayo, o matraces. Los medios lquidos, distribuidos en tubos o matraces, tambin pueden ser incubados en baos de agua caliente. Estos baos resultan cmodos para incubar los cultivos que tienen que manipularse con frecuencia, en la misma mesa de trabajo. pH El pH ptimo depende de la especie bacteriana, pero cada una de ellas crece en un intervalo de pH relativamente estrecho. Casi todas las bacterias crecen mejor a valores de pH prximos a la neutralidad, en el intervalo de 6,5 a 7,5. Sin embargo, los hongos crecen mejor entre 4,5 y 6,0. Aunque el pH de un medio sea el adecuado cuando se inicia el cultivo, a menudo el crecimiento microbiano lo modifica. Esto sucede porque algunos microorganismos usan selectivamente algn componente cido o bsico del medio; o bien, porque algn producto de su metabolismo es un cido o una base. Para disminuir los cambios de pH en los medios definidos se suelen utilizar tampones. En los medios complejos no suele ser esencial, porque sus materiales naturales actan como tampones dbiles. Los tampones ms eficaces para valores neutros de pH son los fosfatos y el carbonato clcico. Ambos se aaden normalmente como nutrientes (fuente de fsforo y calcio); pero si se desea que acten como tampones se precisarn cantidades mayores. Oxgeno La concentracin de oxgeno del medio es un determinante crtico para el crecimiento bacteriano. Algunos microorganismos, a los cuales se denomina aerobios estrictos, no pueden vivir sin oxgeno porque lo necesitan para obtener energa. Otros microorganismos, llamados anaerobios estrictos, no pueden vivir en presencia de oxgeno, para ellos es un agente txico. Otros tipos de organismos, como los anaerobios facultativos o los anaerobios aerotolerantes, pueden crecer tanto en presencia de oxgeno como en su ausencia. Los anaerobios facultativos utilizan el oxgeno si disponen de l, pero tambin pueden crecer sin l. Los anaerobios aerotolerantes no utilizan el oxgeno, pero tampoco les afecta negativamente. Los organismos microaerfilos requieren ambientes con bajas tensiones de oxgeno; las altas tensiones, como las que existen en el are son txicas para ellos. Por tanto, dependiendo del microorganismo que se vaya a cultivar, se tendr que suministrar, restringir o eliminar el oxgeno. Suministrar oxgeno a las bacterias que lo necesitan para crecer, o que crecen ms rpidamente en su presencia, representa una dificultad tcnica. Los organismos aerobios que crecen en la superficie de las placas de agar, obtienen suficiente cantidad de oxgeno de la atmsfera, aunque el interior de toda colonia es completamente

anaerobio. Cuando los microorganismos crecen en medios lquidos es ms difcil, porque no existe demasiado oxgeno disuelto en el agua y los microorganismos aerobios lo consumen rpidamente. Todos los cultivos lquidos con ms de uno o dos centmetros de profundidad deben oxigenarse. Esto se lleva a cabo haciendo pasar una corriente de aire a travs del cultivo o agitndolo vigorosamente de forma continua. En casi todos los laboratorios de microbiologa existen agitadores, que son plataformas en las cuales se pueden colocar los matraces convenientemente sujetos, para ser sometidos a un movimiento de rotacin o a una agitacin de vaivn, que mezclan el aire con el cultivo. El suministro de oxgeno a los cultivos de cientos de litros, como los que se utilizan para producir antibiticos, es un desafi para la ingeniera. Estos cultivos se remueven vigorosamente mediante grandes propulsores, mientras se fuerza a que pasen a travs de ellos enormes cantidades de aire. La exclusin del oxgeno del ambiente de los anaerobios tambin plantea problemas tcnicos. Muchos microorganismos anaerobios se pueden cultivar en tubos de ensayo expuestos al oxgeno, s el medio contiene un compuesto qumico que reaccione con el mismo, como el tioglicalato, que reacciona con el oxigeno manteniendo la parte inferior del tubo libre de oxgeno. Los anaerobios tambin pueden cultivarse en placas Petri, si estas se incuban dentro de unos contenedores, en los cuales se haya eliminado totalmente el oxgeno y se haya reemplazado por un gas inerte como nitrgeno o argn. Tambin se puede llevar a cabo una eliminacin qumica del oxigeno. Para ello, se comercializan paquetes con unas mezclas (le reactivos que producen hidrgeno cuando se les aade agua; el hidrgeno reacciona con el oxgeno en presencia de un catalizador; la reaccin consume el oxgeno produciendo agua. Un mtodo muy sencillo para disminuir la concentracin de oxigeno (y al mismo tiempo producir anhdrido carbnico, el cual es beneficioso para ciertos microorganismos) es encender una vela dentro de un recipiente y cerrarlo hermticamente; la vela consumir oxgeno hasta que se extinga. Esta tcnica se utilizaba para cultivar anaerobios aerotolerantes, como las bacterias del cido lctico. Tambin ha sido utilizada para microacrfilos, especialmente cuando el dixido de carbono les favorece. Los microorganismos anaerobios estrictos, que mueren incluso con una breve exposicin al aire, pueden cultivarse en jarras de cristal hermticamente cerradas. Cuando se abren estos contenedores para aadir medio o tomar muestras, se utiliza una corriente de nitrgeno para sacar el aire de la vasija. A veces, se requieren tcnicas ms elaboradas. Es frecuente el uso de cmaras libres de oxgeno, en las cuales se trabaja usando unos guantes conectados a las mismas. Algunos laboratorios tienen habitaciones libres de oxgeno, donde los tcnicos trabajan con mscaras de oxgeno. Conservacin de los cultivos axnicos Una vez que se obtiene un cultivo axnico, hay que mantenerlo en el laboratorio para poder trabajar con l o intercambiarlo con otros cientficos. Esto se puede llevar a cabo haciendo resiembras en un medio fresco, mensualmente o con otra periodicidad. Pero un cultivo puro tambin puede mantenerse viable durante aos sin hacerlo crecer peridicamente. A los cultivos que se mantienen en el laboratorio para su estudio y como referencia se les denomina cultivos de coleccin. Muchos laboratorios poseen una coleccin de cepas que se han aislado en el mismo o que han obtenido de las denominadas colecciones de cultivos tipo, que son organizaciones que mantienen un nmero enorme de cultivos microbianos como un servicio a los microbilogos. Existen muchas tcnicas de mantenimiento de los cultivos puros, pero casi todas consisten en una desecacin (eliminacin del agua) o en un almacenamiento a baja temperatura. Los cultivos generalmente se desecan por liofilizacin (congelacin y desecacin). El mtodo consiste en lo siguiente: el cultivo lquido se vierte en un pequeo vial o ampolla de vidrio y se aade leche descremada para proteger las clulas durante el proceso. La mezcla se congela en hielo seco y se expone al vaci para su sublimacin (eliminacin del agua congelada). Durante el proceso de sublimacin las clulas permanecen congeladas. Posteriormente se procede al sellado de los viales, mientras an se mantiene el vaco. Los cultivos liofilizados se almacenan a temperatura ambiente. Para almacenar un cultivo empleando bajas temperaturas, se mezcla con sustancias protectoras, como la leche descremada, el glicerol, o el dimetilsulfxido (DMSO). Los tubos de ensayo se sellan y se almacenan por debajo de los - 50oC, en nitrgeno lquido o en un ultracongelador, capaz de alcanzar tan bajas temperaturas. Observacin de las bacterias: a) Observacin macroscpica: El tamao de las bacterias impide verlas a simple vista. Sin embargo, las colonias que forman sobre medios slidos s son visibles, y en ellas se puede estudiar una serie de caractersticas que nos ayudan a su identificacin. A nivel morfolgico, podemos estudiar la forma de las colonias, su tamao, aspecto del borde (liso, rugoso, ondulado, ramificado, etc.), presencia de brillo, color, etc. Incluso sobre medio lquido las bacterias producen modificaciones de inters para su clasificacin y que tienen que ver esencialmente con las caractersticas de su metabolismo. As se observa si la turbidez es uniforme, si crecen en el fondo, si lo hacen en la zona superficial, si producen pigmentos, etc.

b) Observacin microscpica: Puesto que la inmensa mayora de las bacterias son incoloras, la nica forma de observarlas bien en el microscopio ptico consiste en incrementar su contraste con respecto al medio. Esto se consigue mediante su teido con colorantes o mediante la disposicin de una ptica especial de contraste, generalmente de fases, en el microscopio. Para observar las bacterias teidas, hay que proceder previamente a su fijacin. Inicialmente se prepara un frotis a partir de medio lquido o dispersando en una gota de agua una porcin de clulas crecidas en slido. Posteriormente se deshidrata el frotis por calentamiento suave utilizando el reverso de la mano como control de temperatura tras pasar repetidamente el portaobjetos sobre la llama del mechero. Tras la fijacin por calor se procede a la tincin. CUADRO DE CARCTERSTICAS DE BACTERIAS PATGENAS: GNERO Y ESPECIE Micrococcus luteus Escherichia Coli Pseudomona aeruginosa Staphylococcus aureus MACROSCPICAS Aerobio estricto, coagulasa negativa, forma colonias amarillo brillantes en agar nutritivo Mviles, aerobias, anaerobias facultativas, mesfilas, pH 6-8, indol, lactosa y glucosa positivo Mviles, colonias gris con brillo metlico, aroma semejante a uva fermentada Inmviles, colonias pequeas, circulares, borde continuo, cremosas, anaerobios facultativos, fermentadores de maltosa, lactosa, glucosa, manitol, produccin de cido lctico, catalasa Inmviles, colonias elevadas, lisas, circulares, aerobio y anaerobio facultativo Mviles o inmviles, esporulados, aerobios Aerobio o anaerobio facultativo, mvil, hidroliza la lecitina de huevo y no fermenta el manitol Catalasa +, aerobio inmviles, aerobios, anaerobios facultativos, fermentadores, ureasa y catalasa+, en ocasiones prod gas No se puede cultivar in Vitro, inmvil Inmviles, aerobios, anaerobios facultativos, fermentadores y catalasa+, prod. gas Mviles, colonias brillantes, traslucidas, gris amarillas borde irregular rizoide, anaerobios estrictos, pH 7.2-7.6 T 37C, prod gas y olor desagradable Colonias pequeas, traslucidas, borde filamentoso, centro opaco, blanco grisceo, anaerobios estrictos Forman un pigmento amarillo en MICROSCPICAS cocos Bacilos, capsula o microcpsula, flagelos pertricos Bacilos, un flagelo polar o un mechn de 2 a 3 flagelos, pillis Cocos, racimos o cadenas cortas, 0.7 a 1.2 micras TINTORIALES Gram + Gram Gram Gram +

Streptococcus sp Bacillus anthracis Bacillus cereus Bacillus subtilis Yersinia pestis

Cocos en capsuladas bacilos

racimos,

Gram + Gram+ Gram + Gram + Gram -

Bacilos esporulado Bacilos que esporulan Bacilos con extremos redondeados, flagelos pertricos o anfitricos, pillis, cpsula de poco espesor Bacilo delgado recto, en empalizada o haces Bacilos capsulados Bacilos solos en cadena o pares, flagelos pertricos, prod esporas redondas terminales Bacilos aislados en parejas o cadenas cortas, flagelos pertricos bacilo delgado, extremos

Mycobacterium leprae Kleibsella pneumoniae Clostridium tetani

cido alcohol resistente Gram.+ Gram Gram +

Clostridium botullinum Mycobacterium

Gram +

Acido-alcohol resistente,

tuberculosis Nocardia Salmonella Typhi

Shigella dysenteriae Chlamydia trachomatis Brucella sp Neisseria gonnorrhoeae Streptococcus pyogenes

incubacin, aerobios estrictos Microaeroflicos, anaerobios, fermentadores + Mviles, colonias grandes de 2 a 4mm rugosas o lisas, aerobios, anaerobios facultativos, mesfilos, fermentadores, prod. H2SO4 Inmvil, colonias redondas 2mm, convexas, transparentes, aerobios, anaerobios facultativos, glucosa + indol+ o Inmviles, filtrables Inmviles, aerobio, catalasa, oxidasa y ureasa positivos Inmviles, aerobios, anaerobios facultativos, pH de 6 a 8, oxidasa y glucosa positiva Inmviles, colonias en forma de disco, mucosas, mate, lisas o rugosas con hemlisis alrededor, anaerobios facultativos, producen cido lctico Inmviles, intracelulares obligados

redondeados Bacilos y cocobacilos Bacilos, flagelos pertricos no esporulados bacilos

Gram.+ Gram +; dbilmente acido-alcohol resistentes Gram -

Gram -

cocoides Bacilos cortos; cocobacilos Cocos en pares, capsulados de 0.6 a 1micra Cocos en cadena, 0.5 a 2mm

Gram - ; tincin con giemsa, castaeda o machiavello Gram Gram Gram+

Rickettsia pallidum

Vibrio Cholerae

Corynebacterium diphtheriae

Mvil, aerobio, anaerobio facultativo, sensible a la acidez, catalasa, indol, oxidasa, rojo de metilo, sacarosa y fermentador + Aerobio y microaeroflico, inmviles, catalasa + fermentadores + T 35C pH 7.6

Bacilos o cocobacilos, pared formada por 3 capas a manera de cpsula, cubierta mucilaginosa Bacilo curvo, un flagelo polar Bacilo en forma de basto con uno de sus extremos ms angosto, agrupacin en empalizadas.

Gram - ; tincin con Giemsa, Machiavello o Jimnez Gram -

Gram +; la tincin no es uniforme debido a los grnulos que contiene en su citoplasma, que se tien ms intensamente

MATERIAL:
Pipeta pasteur estril 2 mecheros 4 tubos con caldo Asa y portasa 4 tubos con medio SIM Etiquetas o marcador

Cultivos de las siguientes bacterias: Escherichia coli Streptococcus Faecallis Bacillus Subtillis Pseudomona Aureginosa Staphylococcus Aureus Staphylococcus Epidermis

MTODOLOGA:
o o o o Limpiar y esterilizar el rea de trabajo Prender los mecheros, ajustar la flama hasta que esta presente un cono azul bien marcado. Identificar y organizar el material dentro del rea de trabajo. Marcar los tubos con iniciales de la cepa a sembrar y fecha.

a) Siembra en medio lquido: Transferir aspticamente, con el asa de siembra, una pequea muestra de los microorganismos, desde el tubo

que contiene el material problema al tubo con medio de cultivo estril. Sumergir el asa en el lquido y agitar para desprender y diluir la muestra. Incubar el tubo recin sembrado en estufa, durante 24-48 horas a la temperatura ptima de crecimiento.

b) Siembra en medio semislido: La siembra en este tipo de medio, que contiene una proporcin menor de agar que los medios slidos y que se envasa en tubos, se lleva a cabo con un hilo de siembra esterilizado, con el cual se toma la muestra. El medio queda inoculado al introducir el hilo en profundidad hasta el fondo del tubo, retirndolo posteriormente por la misma trayectoria utilizada al realizar Tcnicas de estriado:

a)

b)

estriado simple: estriado continuo: Esteriliza el filamento del asa de siembra y toma la parte de la caja de petri que contiene el medio de cultivo sembrado. Cercas del mechero espera que se enfre el asa y toma una colonia de la placa. Regresa la caja a su tapadera, ahora, toma una placa con agar estril (donde se vaya a sembrar) y con cuidado de no romper el agar, inocula la muestra en un extremo de la placa y con el asa en posicin ligeramente horizontal realiza las estras (muy juntas), oscilando el asa de siembra sobre la superficie de una porcin pequea del agar; mediante un balanceo sucesivo y rpido de la mueca. estriado en cuadrantes: la mayor parte del inculo e descarga en los cuadrantes 1y 2, lo que permite obtener colonias separadas en 3 y 4; Con un asa de siembra, previamente esterilizada, se toma una muestra del cultivo de microorganismos y se extiende sobre un rea pequea de la superficie de la placa con medio, en forma de estras muy juntas, pero sin hacer presin para no daar el medio. Se flamea el asa, se enfra y despus de rozar la siembra realizada previamente, se extiende de nuevo por otra zona de la placa haciendo nuevas estras. Este proceso se repite sucesivamente, flameando y enfriando el asa al comienzo de las sucesivas siembras en estra. Se lleva la placa a incubar, a la temperatura adecuada, siempre en posicin invertida. Mediante esta tcnica se obtienen colonias aisladas a partir de una muestra que contenga un elevado nmero de bacterias.

Gua de observacin:

o
o o o o o

Observe las caractersticas culturales de las colonias formadas para cada sembrado en los diferentes medios de cultivo. Describa las observaciones en la tabla correspondiente. De cada microorganismo hacer un frote y teir mediante la tcnica de gram. Observe al microscopio describir las caractersticas de las diferentes bacterias en estudio en la tabla correspondiente. Compare el desarrollo de las bacterias inoculadas en los diferentes medios para anaerobios. Con base en los resultados obtenidos, indicar cul bacteria es aerobia, anaerobia, anaerobia facultativa o microaeroflica.

Aspectos ms comunes de las diversas colonias microbianas aisladas sobre medio slido:

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RESULTADOS: Tabla de las caractersticas de cultivos bacterianos: Bacteria E. Faecallis Anaerobi o facultativ o mediana grumoso Papilar mvil Staphylococc us Aureus Anaerobio facultativo nula compacto CULTURALES Bacillus Staphylococcu Subtillis s Epidermis 1) En medio lquido: aerobio anaerobio Escherichia coli Pseudomon a Aureginosa -

Crecimient o superficial Opacidad Sedimento Forma de la lnea de la picadura Medio Forma Elevacin Bordes Textura Color Forma Agrupaci n Gram

mediana nula Compacto viscoso 2) En medio semi-slido -

Papilar mvil

Vellosa mvil

3) Colonias en placa
Mc Conkey Fusiforme Plana Filamentos o Plana rosado Sal Manitol fusiforme convexa Ondulado Membranos o morado Mc Conkey Circular Convexa Ondulado Membranos o rojizo EMB Circular Convexa Ondulado membranos o morado EMB Circular Convexa Ondulada Butirosa Metalico

Cocos Cadenas Gram +

Cocos Racimos Gram +

MICROSCPICAS Bacilos Cocos En pares y Racimos en cadena Gram + Gram +

Bacilos Cadenas Gram -

bacilos Cadenas Gram -

DISCUSIN DE RESULTADOS:

Se realizaron 3 tcnicas para sembrado de cultivo: en medio lquido (con caldo nutritivo), en medio semislido (medio SIM) y en placa (con estriado simple y en cuadrantes), con 6 diferentes bacterias para despus dejar incubar las bacterias. Una vez incubadas las bacterias se observaron sus caractersticas macroscpicas o culturales y sus caractersticas microscpicas; Los resultados de estas observaciones realizadas se pueden ver en la tabla anterior, en la que se puede observar que cada una de ellas vara de a cuerdo a sus caractersticas especficas de crecimiento en los diferentes medios.

CONCLUSIONES: Por medio de esta prctica se logr utilizar las tcnicas aprendidas durante el transcurso del curso. Se logr aprender a realizar algunos de los mtodos que existen para cultivar bacterias y de esta manera observar sus caractersticas tanto macroscpicas como microscpicas e interpretacin de las mismas, con lo que se observ

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que para cada bacteria existen caractersticas diferentes que son las que las identifican y diferencian de otras bacterias, por lo que de esta manera se le puede llegar a identificar con su correcta siembra y observacin para anlisis posteriores o simplemente para la identificacin de una bacteria en algn medio u organismo.

BIBLIOGRAFA: Romero Cabello, R. Microbiologa y Parasitologa Humana: Bases etiolgicas de las enfermedades infecciosas. Editorial Panamericana, Mxico 2001. 2ed. Pp.257-429 http://www.uam.es/personal_pdi/ciencias/jolope/GUIONPRACTICAS0506.doc

http://es.wikipedia.org/wiki/

http://www.ucm.es/info/mfar/pdfs/GuiaMicro2.pdf

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