Practica No.

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Siembra y Aislamiento de microorganismos

Introducción

El aislamiento y obtención de cultivos puros posiblemente hayan sido las bases más importantes
en el desarrollo de la Microbiología. Los primeros trabajos en Microbiología se hicieron en unas
condiciones experimentales que no permitían tener la certeza de que se hubieran obtenido
cultivos puros. Por ejemplo, en los clásicos trabajos de Pasteur lo importante era distinguir una
actividad biológica y una actividad química. Más adelante, los microbiólogos observaron que,
aparentemente, los microorganismos tenían una gran capacidad de variación en cuanto a su
aspecto morfológico y características fisiológicas, dando lugar a la teoría del pleomorfismo.
Contrariamente apareció la teoría de que los microorganismos presentan una constancia en su
morfología y metabolismo; el monomorfismo.

La teoría del pleomorfismo fue un obstáculo para el desarrollo de la microbiología y no fue hasta
1870 que no se extendió la idea de que para estudiar la forma y función de los microorganismos
era necesario obtener cultivos puros. Robert Koch a partir de sus estudios en Microbiología
médica y de las ideas de su profesor Edwin Klebs, concluyó que un organismo específico tiene
unos efectos específicos, estableciendo las pases para que la Microbiología se desarrollara como
una ciencia independiente.

Un cultivo puro es aquel que contiene una sola clase de microorganismo. En la práctica los cultivos
puros son útiles por diferentes razones: mantienen los organismos viables, permiten hacer cultivos
para someterlos a diferentes análisis e intercambiarlos con otros laboratorios. Para obtenerlo es
necesario recurrir a las técnicas de aislamiento. Las técnicas para obtener cultivos puros fueron
inicialmente desarrolladas por De Bary y Brefeld para el estudio de hongos y consiguieron aislar
células y cultivar hongos sobre medios sólidos. Pero estas técnicas no eran adecuadas para el
cultivo de bacterias.

El proceso de aislamiento consiste en realizar siembras para disponer de la descendencia de un

individuo (célula) sobre la superficie de un medio sólido y separada del resto de individuos
presentes en el cultivo mixto. Esta célula, en las condiciones de crecimiento adecuadas dará lugar
a una descendencia que resultará macroscópicamente visible y que se llama colonia. Cada colonia
contiene millones o miles de millones de células idénticas y con el mismo origen y propiedades. Se
puede demostrar que prácticamente cada colonia procede de una sola célula o de un grupo de
células del mismo tipo si el microorganismo forma agregados. Por ello lo más correcto es hablar de
unidades formadoras de colonias (UFC) al referirnos al origen de una colonia. El cultivo
descendiente de una misma colonia es un cultivo puro.

En los primeros tiempos de la Microbiología se utilizaban como sustratos sólidos para inmovilizar
los microorganismos patatas o pan, con el inconveniente de la opacidad de estos sustratos. En el
laboratorio de Robert Koch se desarrollaron técnicas para solidificar un medio líquido con
composición conocida añadiendo una sustancia sin opacidad y con la posibilidad de modificar la
composición del medio líquido según los requerimientos nutricionales del microorganismo a aislar.
La gelatina fue el primer agente solidificante utilizado por Koch, sin embargo, presentaba el
inconveniente de que algunos microorganismos son capaces de utilizarla para su crecimiento.
Entonces la gelatina fue sustituida por el agar; introducido por Fanny Eilshemius (1881). El agar es
un polisacárido que se obtiene de algunas algas rojas y para pasar de sólido a líquido se debe
calentar por encima de los 100°C y una vez fundido es mantiene líquido hasta enfriarse a 44°C.

Contaminación de cultivos.

Para impedir la contaminación de los culti vos, es necesario tener plena conciencia
de la ubicuidad de los m i c r o o r g a n i s m o s , l o q u e d e t e r m i n a q u e e l a í r e y t o d a s
l a s s u p e r fi c i e s e s t é n d e n s a m e n t e p o b l a d a s p o r microorganismos, de este
modo en la transferencia de una muestra microbiológica a otro recipiente, se deben
tener una serie de cuidados que eliminen los riesgos de contaminación. Estos
incluyen el área de trabajo, el l a v a d o d e l a s m a n o s , l a e s t e r i l i z a c i ó n d e t o d o s
l o s u t e n s i l i o s y m e d i o s d e c u l ti v o a e m p l e a r y r e a l i z a r l a transferencia del
microorganismo en una zona estéril, la que se obtiene trabajando cerca de la flama del mechero.

Al conjunto de procedimientos realizados para prevenir o evitar la contaminación se le llama

técnica aséptica; el seguimiento cuidadoso y detallado de la misma evita accidentes tales como:
a) La contaminación y pérdida del cultivo en estudio
b) La salida y dispersión de microorganismos del cultivo, lo que ocasionaría la contaminación
de utensilios, productos y del personal. Este últi mo aspecto es parti cularmente
importante cuando se trabaja con cultivos de microorganismos patógenos. Con
relación a la concentración del inoculo, un error frecuente del principiante
consiste en tomar muestras grandes, lo que es innecesario. Una colonia de
bacterias del tamaño de la cabeza de un alfi ler conti ene varios millones de
microorganismos, es obvio que con una cantidad pequeñísima (casi invisible) que se
adhiera al asa, será más que suficiente para efectuar una transferencia exitosa.

Dispositivos empleados en la transferencia de muestras microbianas:

Hisopo, pipeta (para uso microbiológico son terminales y la parte superior o boquilla debe estar
protegida con filtro de algodón), pipeta Pasteur, cable porta-asa con alambre de platino dispuesto
en forma de: aguja, asa, espátula y/o gancho. En la transferencia de microorganismos se
emplean agujas, asas de inoculación, hisopos, pipetas o pipetas Pasteur que deberán
esterilizarse previamente. La uti lización de estos dispositi vos, así como de los
diferentes medios de culti vo ti ene aplicaciones específi cas. Por ejemplo: los medios
líquidos se preparan en tubos o matraces que se cubren con tapones de algodón o tapones
especiales.

Siembra de materiales estériles

Un cultivo líquido puede ser transferido mediante un asa microbiológica, un hisopo,

pipeta o pipeta Pasteur; el inoculo se deposita dentro del caldo o medio líquido. En
este tipo de cultivos los microorganismos presentan un desarrollo particular que se manifiesta en
la superficie o a través de todo el líquido. Una de las ventajas que presenta este tipo de cultivo se
refiere a la posibilidad de agitarlos acelerando la velocidad de microorganismos anaerobios, por
otra parte, en este tipo de culti vos, las poblaciones se encuentran suspendidas y es fácil
homogeneizarlas, lo que permite estandarizar la concentración del inoculo. La desventaja
que presentan, es que en ellos es difícil detectar contaminación a simple vista.

Los medios semisólidos se preparan en tubos, se inoculan con aguja de siembra (asa recta) o
pipeta Pasteur; en este último caso es necesario calentar el medio y cuando se encuentra en
estado líquido y a una temperatura de aproximadamente 42ºC se agrega el inoculo, se
homogeniza y se deja solidificar. Estos medios se emplean para estudiar la movilidad de los
microorganismos y para favorecer la separación de microorganismos con diferentes
requerimientos de oxígeno.

Los medios sólidos se preparan en tubos o matraces dependiendo de la cantidad o de las

necesidades, después de esterilizarlos, estos se inclinan o vierten en cajas de Petri. La
siembra se realiza con el asa, inoculando la superficie del agar con mucha suavidad; en
estos medios, los microorganismos al multiplicarse forman agregados q u e s e h a c e n v i s i b l e s
a simple vista; a estos agregados se les denominan colonias, las que
p r e s e n t a n características que varían con el tipo de microorganismo cultivado y el medio de
cultivo empleado.

En cualquier medio de culti vo es de primordial importancia ajustar el pH, ya que aun

cuando la mayoría de los microorganismos crecen mejor en pH neutro, algunos requieren de
pH alcalino o ácido, por lo que al proporcionar un pH adecuado se favorecerá el crecimiento del
microorganismo de interés y la obtención del cultivo. Con este mismo propósito durante la
incubación se deben proporcionar las condiciones adecuadas para el microorganismo en estudio.

Inoculo y Siembra

Inóculo es la masa microbiana que se utiliza para sembrar el medio de cultivo. Para evitar
contaminaciones a la hora de inocular el medio de cultivo, habitualmente se trabaja al lado de la
llama del mechero Bunsen.

Para la toma del inóculo a partir de una muestra a examinar a partir de un medio sólido o de un
tubo con líquido, se recomiendan las maniobras siguientes:
1. Colocar frente al mechero la muestra a analizar y el resto del material necesario (tubos,
placas) de manera que sea fácilmente accesible.
2. Tomar el asa de siembra o la pipeta. La pipeta debe estar previamente esterilizada. Se
debe flamear el asa de siembra hasta que el filamento alcance un rojo incandescente y
después enfriar en la proximidad de la llama (unos 10 segundos).
3. Tomar con la otra mano el recipiente (tubo, placa...) que contiene la muestra a analizar:
a) Si la muestra está en un tubo, quitar el tapón y flamear la boca del tubo.
b) Si la muestra está en una placa de Petri, colocar la placa invertida sobre la mesa y
levantar la parte de la placa que contiene el crecimiento bacteriano. Situar en la
proximidad de la llama del mechero.
4. Trabajando en todo momento en la proximidad de la llama, tomar la alícuota o inóculo:
a) Si el medio es líquido agitar ligeramente el tubo e introducir la pipeta o el asa de
siembra en la cual quedará adherida una gota por tensión superficial.
b) Si el medio es sólido, rozar con el asa de siembra una pequeña porción de colonia.
 c) Si la muestra se encuentra en la profundidad del agar, hundir el filamento dentro
del medio hasta tomar una pequeña porción.
5. Transferir el inóculo a otro medio de cultivo estéril, tomando las mismas precauciones en
su manejo (flameando la boca del tubo, trabajando en la proximidad de la llama...).
a) Si la transferencia va a ser a un caldo líquido, descargar el inóculo mediante
agitación del asa de siembra en aquél o la expulsión del volumen pipeteado.
b) Si la transferencia se va a realizar a un tubo de agar inclinado, introducir el asa con
el inóculo y sembrar en zig-zag sobre la superficie del agar o bien sembrar en
picadura en la profundidad del medio.
c) Si la transferencia se va a hacer sobre un medio sólido en placa de Petri, existen
diferentes tipos de siembra: extensión de una gota con asa de vidrio, siembra en
masa y por agotamiento en placa.
6. Una vez realizada la transferencia:
a) En el caso de los tubos, flamear la boca antes de colocar el tapón. Identificar los
tubos e incubar a temperatura adecuada durante el tiempo necesario para que
crezcan los microorganismos.
b) En el caso de la placa de Petri, tapar la placa. Identificar las placas marcándolas en
la base e incubar en posición invertida para evitar que el agua de condensación se
deposite sobre la superficie del agar, lo cual impediría la obtención de colonias
aisladas.

Técnicas de Aislamiento

El método de siembra por estría en placa.

Es el método más fácil y el más usado para obtener cultivos puros. Para ello, con un asa de
siembra se toma una muestra de la población mixta y a conti nuación se hacen estrías
sobre la superfi cie de un medio sólido preparado en una placa Petri (a las placas Petri
también se les denomina simplemente placas). Conforme se van h a c i e n d o e s t r í a s e n
z i g z a g c o n e l a s a , c a d a v e z s e v a n d e p o s i t a n d o e n l a s u p e r fi c i e d e l m e d i o
m e n o s microorganismos. A conti nuación, se fl amea el asa, se toca en la región
donde se han realizado las últi mas estrías y se continúa la siembra con la misma técnica, en
la superficie de medio sin sembrar aún. Repitiendo este proceso varias veces se logra
separar células individuales. A conti nuación, las placas se incuban en un
lugar adecuado, permiti endo que las células aisladas experimenten un número
sufi ciente de divisiones para formar colonias visibles.

Aunque cada colonia posiblemente representa un derivado de una sola célula, no podemos
asegurarlo. Quizás, dos células quedaron depositadas tan juntas que han originado una única
colonia mixta. Por tanto, para asegurarnos de que hemos obtenido un cultivo puro, conviene
repetir el procedimiento a partir de una colonia bien aislada en la primera placa. Las colonias que
se desarrollen la segunda vez, serán, casi con toda seguridad, cultivos puros.

Técnicas de estriado:

a) Estriado simple:
Estriado continuo: Esteriliza el filamento del asa de siembra y toma la parte de la caja de petri que
contiene el medio de cultivo sembrado. Cercas del mechero espera que se enfríe el asa y toma
una colonia de la placa. Regresa la caja a su tapadera, ahora, toma una placa con
agar estéril (donde se vaya a sembrar) y con cuidado de no romper el agar, inocula la muestra en
un extremo de la placa y con el asa en posición ligeramente horizontal realiza las estrías (muy
juntas), oscilando el asa de siembra sobre la superfi cie de una porción pequeña del agar;
mediante un balanceo sucesivo y rápido de la muñeca.
 
b) Estriado en cuadrantes:
la mayor parte del inoculo se descarga en los cuadrantes 1y 2, lo que permite
obtener colonias separadas en 3 y 4; Con un asa de siembra, previamente
esterilizada, se toma una muestra del cultivo de microorganismos y se extiende sobre un área
pequeña de la superficie de la placa con medio, en forma de estrías muy juntas, pero sin hacer
presión para no dañar el medio. Se flamea el asa, se enfría y después de rozar la siembra realizada
previamente, se extiende de nuevo por otra zona de la placa haciendo nuevas estrías. Este
proceso se repite sucesivamente, fl ameando y enfriando el asa al comienzo de las
sucesivas siembras en estría. Se lleva la placa a incubar, a la temperatura adecuada,
siempre en posición invertida. Mediante esta técnica se obtienen colonias aisladas a partir de una
muestra que contenga un elevado número de bacterias.

Los métodos de vertido en placa y extensión en placa

En estos métodos, las suspensiones de células microbianas se diluyen

Antes de su siembra en placa. Se siguen estas técnicas cuando la muestra contiene tantos
microorganismos, que la dilución no se puede realizar en una sola etapa. Por ejemplo, una
suspensión con mil millones de células por mililitro debe ser diluida 10 7 veces para obtener una
suspensión con un centenar de células por mililitro, Por tanto, se realizan diluciones
seriadas (en varias etapas), normalmente de diez en diez, pero a veces de cien en
cien.

Para realizar diluciones de diez en diez, se añade 1 ml de la suspensión bacteriana a 9 ml (le

medio estéril o solución salina, igualmente estéril. Se agita vigorosamente para diluir las células y
el proceso se repite cuantas veces sea necesario. A continuación, se puede proceder de dos
maneras diferentes. En el método de verti do en placa, las muestras diluidas se mezclan
con agar fundido y se vierten en placa. Algunas colonias quedarán embebidas en el agar y
otras crecerán en la superficie. Las colonias superficiales se extenderán y serán más grandes. En el
segundo método (extensión en placa), las muestras diluidas se siembran directamente en la
superfi cie de la placa de agar, extendiéndolas con ayuda de un asa de Diralsky de
cristal estéril. La suspensión se absorbe en el agar, dejando las células microbianas
sobre la superfi cie. En ambas técnicas las placas se incuban hasta la aparición de las colonias.
Como en el método de siembra por estría, no existe la seguridad de que las colonias que
aparecen en las placas sembradas por extensión o en el agar  solidificado sembrado por
el método del vertido en placas sean cultivos puros hasta que se repita el proceso. Las dos
técnicas de siembra por dilución presentan la ventaja de que permiten obtener un
mayor número de colonias aisladas que el método de siembra por estría, por tanto, se eligen
cuando se ha de seleccionar una cepa a partir de una mezcla con varios tipos de microorganismos.
Siembra en medio líquido:

Transferir asépti camente, con el asa de siembra, una pequeña muestra de los
microorganismos, desde el tubo que contiene el material problema al tubo con medio de cultivo
estéril. Sumergir el asa en el líquido y agitar para desprender y diluir la muestra. Incubar el tubo
recién sembrado en estufa, durante 24-48 horas a la temperatura óptima de crecimiento

Siembra en medio semisólido:

La siembra en este ti po de medio, que conti ene una proporción menor de agar que
los medios sólidos y q u e s e e n v a s a e n t u b o s , s e l l e v a a c a b o c o n u n h i l o d e
s i e m b r a esterilizado, con el cual se toma la muestra. El medio queda inoculado al introducir el
hilo en profundidad hasta el fondo del tubo, retirándolo posteriormente por la misma trayectoria
utilizada al realizar 

Siembra en estrías usando cultivo desarrollado en medio liquido

Ejemplos de siembra en superficie y siembra por vertido en placa Petri

Siembra en superficie usando hisopo y asa de platino

 Ejemplos de esquema de siembra en estría sobre medio solido en placa Petri

Objetivo de la Practica

En esta primera parte el alumno se familiarizará con las técnicas básicas de la ciencia de la
Microbiología. Se verá la importancia de las técnicas de aislamiento y del cultivo puro y cuál es el
procedimiento para identificar bacterias. El objetivo concreto de esta primera práctica es aislar e
identificar los microorganismos contenidos en una mezcla. Este proceso contará básicamente de
dos partes:
- Aislamiento de los microorganismos que constituyen el cultivo mixto y obtención de cultivos
puros de cada uno de ellos.
- Caracterización fisiológica e identificación presuntiva de los mismos mediante siembras en
medios selectivos y/o diferenciales.
Metodología

Aislamiento de microorganismos y obtención de cultivos puros a partir de una muestra

problema
Se entrega a cada equipo una caja Petri con cultivo, en el que hay crecimiento de diferentes
especies bacterianas. A partir de esta muestra problema se realizará el aislamiento de los
microorganismos con la obtención de los correspondientes cultivos puros y su posterior
comprobación mediante Tinción de Gram.
Durante toda la práctica se tiene que trabajar al lado de la llama de mechero Bunsen para
mantener las condiciones de esterilidad y evitar posibles contaminaciones externas.

Aislamiento de los microorganismos por estría escocesa

1. Esterilizar el asa flameándola en el mechero hasta conseguir un rojo incandescente.
2. Enfriar el asa en la proximidad de la llama. Tomar una porción de la muestra.
3. Transferir el inóculo a un área reducida de la superficie de la placa, próxima al borde. Extenderlo
formando estrías muy juntas sobre la superficie de una porción pequeña de la placa. Para realizar
las estrías oscilar el asa de siembra sobre la superficie del agar mediante un balanceo sucesivo y
rápido de la muñeca. No hacer más presión sobre el agar que la debida al propio peso del asa y su
mango.
4. Flamear el asa de nuevo y enfriarla. Rozar una vez con el asa de siembra el final de las estrías
realizadas anteriormente y hacer sobre una nueva porción de la placa una segunda tanda de
estrías en otra dirección.
5. Flamear y enfriar el asa. Repetir exactamente la operación descrita en el punto anterior, pero
empezar rozando el final de la segunda tanda de estrías. La nueva serie de estrías no deben tocar
ninguna de las series realizadas inicialmente.
6. Flamear el asa y tapar la placa de Petri. Incubar en posición invertida.

Observación de la morfología colonial y celular de las bacterias aisladas

Observaremos las diferentes morfologías coloniales en la placa sembrada por estría escocesa y en
las placas del banco de diluciones.
Cada bacteria origina la misma morfología colonial en las mismas condiciones de cultivo. Hay
diversos criterios para definir la morfología colonial, aunque son arbitrarios y no tienen valor
sistemático.

Por el tamaño podemos diferenciar en pequeñas (<1mm), medianas (1-2mm) o grandes (>2mm).
También podemos definir en función de la forma colonial (circular, irregular, etc.), de su contorno
(entero, ondulado, etc.), de su color, de su viscosidad o de cualquier característica morfológica que
creamos que nos permite distinguir una colonia de otra. Calcularemos la proporción de cada
microorganismo en la mezcla. Se observará la mezcla a las 24 y a las 48 horas.

Identificaremos las diferentes morfologías coloniales y de cada una haremos una tinción de Gram,
relacionando cada una de ellas con la morfología celular. Haremos el Gram a partir de las colonias
aisladas, poniendo una gota de agua destilada en el portaobjetos y suspendiendo una pequeña
muestra de la colonia.
Obtención de cultivos puros

Una vez identificadas las diferentes morfologías coloniales y celulares pasaremos a obtener los
cultivos puros de cada uno de los microorganismos. El procedimiento a seguir es el siguiente:
- Sembraremos una colonia bien aislada de cada tipo en una placa con medio nutritivo.
- Se incuban 24 h a 37°C.
- Se confirma visualmente que el nuevo cultivo es puro por la morfología colonial.

Reporte Final

Durante el proceso de aislamiento, seleccione las colonias a utilizar dentro del cultivo muestra;
tome fotografías o dibuje lo que ve. Recuerde que este es el segundo de los pasos importantes
para la identificación de microorganismos, por lo que debe tratar de ser muy preciso en sus
descripciones.

Realice una descripción de las colonias de origen (Forma, tamaño aproximado, superficie, borde,
color, consistencia, apariencia, y todos los datos que pueda aportar). Esta misma descripción
deberá realizarla en las colonias que obtenga después del aislamiento. Tome en cuenta que puede
obtener durante el ejercicio colonias con características distintas que provienen de la colonia de
origen.

Una vez aislados, deberá realizar una tinción de Gram para cada una de las colonias obtenidas.
Realice sus observaciones al microscopio y reporte una descripción de los microorganismos que
observa (tamaño, forma, agrupación, color).

Para completar esta práctica, investigue sobre las técnicas de siembra que se mencionan a
continuación:

Siembra por estría en placa (zigzag, desgaste, y otras)

Siembra por extensión

Siembra por vertido en placa

Siembra utilizando diluciones