MICROBIOLOGIA GENERAL Y DE ALIMENTOS 1

METODO DE SIEMBRA Y CULTIVO

I. OBJETIVOS:
Aprender los principales mtodos de siembra de microorganismos
y as sembrar muestras en diferentes medios de cultivos.
Aprender que la finalidad de este laboratorio, es el aislamiento de
los grmenes.

II. INTRODUCCIN:
Siembra: Sembrar o inocular es introducir artificialmente una porcin de
muestra (inculo) en un medio adecuado, con el fin de iniciar un cultivo
microbiano. Luego de sembrado, el medio de cultivo se incuba a una
temperatura adecuada para el crecimiento.
La siembra puede realizarse en medio lquido, slido o semislido,
utilizando punta, asa, pipeta estril.
Cultivo en medio lquido: Habitualmente se realiza en tubos o en
matraces. El crecimiento se puede manifestar por enturbiamiento, por
formacin de velo o pelcula, o procedimiento.
Cultivo en medio slido: Puede ser en tubos o placas.
Tubos con agar inclinado: Para sembrarlos, se mueve el asa o la punta
suavemente sobre la superficie del agar con un movimiento en zigzag
desde el fondo hasta la parte superior, cuidando de no daar el agar.
Tubos sin inclinar: se siembran introduciendo una punta en el centro del
agar. Tambin se llama siembra por picadura.
Siembra en placas: puede ser en superficie o incorporada.
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III. AISLAMIENTO
Aislar: es separa un tipo de microorganismo a partir de una poblacin que
los contiene de varios tipos. En hbitat naturales, raramente encontramos a los
microorganismos en cultivo puro (un solo tipo de microorganismo), por lo tanto
es necesario hacer algn procedimiento de aislamiento para separa e identificar
los distintos tipos de microorganismos presentes.
El aislamiento se puede lograr directamente a partir de una muestra cuando
el o los microorganismos estn en una proporcin adecuada. Cuando el
microorganismo que se desea aislar e identificar se encuentra en baja proporcin
en la muestra, o interesa un solo tipo de microorganismo, se lleva a cabo un
procedimiento llamado bsqueda que involucra una primera etapa de aumento
del nmero de microorganismos del tipo que se desea aislar en relacin al resto
de la poblacin. Luego se asla por el mtodo de estras o por dilucin y se
identifica.
Para aislar se utiliza alguno de los siguientes procedimientos:
Aislamiento por estras
Aislamiento por dilucin
A. Aislamiento en placa por estras:
Existen distintas tcnicas, el objeto es obtener colonias aisladas.
Tcnica a: consisten en cargar el asa con la muestra y hacer estras paralelas en
la cuarta parte de la superficie de la placa; se quema el asa, se enfra, se gira la
placa 90 y se vuelve a estriar tocando 3 o 4 veces el rea sembrada inicialmente
y cubriendo otro cuarto de placa. por ltimo, sin quemar el asa, se estra el resto
de la superficie sin sembrar.

Tcnica b.- Con el asa cargada se hacen 3 o 4 estras; se quema el asa, se hacen
3 o 4 estras perpendiculares a las anteriores, se quema el asa y se repite el
procedimiento hasta agotar la superficie de la placa.
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B. Aislamiento por dilucin en medio slido:

Se emplean tanto el mtodo de siembra incorporada como el de
siembra en superficie. Suele ser necesario diluir la muestra. Para ello se puede
preparar las diluciones decimales en condiciones aspticas usando suero
fisiolgico o algn otro diluyente.
La siembra incorporada se realiza tal como se describi
anteriormente. Tambin se pueden preparar las diluciones directamente en
tubos de agar fundido y termostatizado (20ml) se agita por rotacin entre las
manos y se vierte en placas de Petri estriles.

C. Aislamiento de microorganismos anaerobios:

Para aislar microorganismo anaerobios que son rpidamente
destruidos por exposicin al oxgeno, las placas pueden ser preparadas en la
forma usual , y luego de sembradas, incubadas en recipientes cerrados en
atmsfera sin oxgeno.
Tambin se puede sembrara diluciones en tubos con agar fundido y
termostatizado que luego se tapan con una capa de vaselina parafina, para
evitar el acceso de aire.
Con anaerobios ms sensibles al oxgeno, se trabaja en cmaras
anaerbicas, o tambin usando la tcnica del roll-tube, que es un tubo en el
que el agar se deposita en las paredes al hacerlo girara mientras se enfra; se
trabaja gaseando el tubo continuamente con gas libre de O2 mientras el tubo
est destapado.
Cultivo Puro:
A partir de colonias aisladas en medio no selectivo se realiza un examen
microscpico que debe mostrar clulas razonablemente semejantes respecto al
Gram y a la morfologa.
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Las colonias deben describirse por examen macroscpico en funcin del

tamao, la forma, el borde, la elevacin, la transparencia y el color. Esto resulta
a veces muy utilicen la identificacin.
En el caso de medios selectivos las colonias aisladas deben aislarse nuevamente
en medio no selectivo por el mtodo de estras. Esto se conoce como
reaislamiento.
IV. MATERIAL Y METODO
Materiales:
Tubos de ensayo
Placas petri (agar)
Pipetas
Asa y agujas de koller
Esptula
Vaso precipitado
Pipeta
Equipo:
Mechero Bunsen
Bao maria

V. PROCEDIMIENTO
A. SIEMBRA EN TUBOS:
1. Siembra de un tubo de ensayo a otro.- El tubo con el material para la
siembra y el tubo con el medio de cultivo se toman ambos con la mano
izquierda en forma inclinada, de tal forma que los extremos de ambos
tubos estn a un mismo nivel.
Con la mano derecha se toma el asa y se la esteriliza en posicin vertical
en el mechero, con la misma mano se extrae los dos tapones con el dedo
meique y el siguiente aprobndolos a la flama al mismo tiempo, se
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flamea el extremo de los tubos, con el asa se toma un poco de material de

siembra, luego de enfriarla y con cuidado se le traslada al tubo con el
medio de cultivo.
a) Cuando la siembra es en un caldo de cultivo, el asa con el material se
introduce en un lquido por la pared inferior del tubo y se extrae por
la pared superior. Atencin El caldo de cultivo no debe mojar el
tapn de algodn!
b) Para sembrar en un agar inclinado, al asa con el material se le
movimientos de zigzag en la superficie del agar de abajo hacia arriba.
c) Para sembrar enana columna de agar vertical (por picadura), se
utiliza una aguja la cual se esteriliza bajo mechero, y con el material
de siembra se introduce hasta el fondo de la columna. Despus de la
siembra el asa o aguja se extrae del tubo, se flamea el extremo del
tubo, se coloca el tapn y se esteriliza el asa o aguja en el mechero en
posicin vertical.
d) La siembra en un caldo de cultivo se puede realizar con una pipeta
de Pasteur o una pipeta graduada.
e) Las siembras tambin se pueden realizar con tampones.

2. Siembras a un tubo con medio de cultivo desde una placa Petri:

La placa Petri con el material de siembra se coloca frente a uno con al tapa
hacia arriba. Se esteriliza el asa, se abre la placa bajo el mechero, se toma
con el asa un poco del material, se retira el asa, se cierra la placa y con la
mano izquierda se toma el tubo con el medio del cultivo. La siembra se
realiza en los casos del punto 1.
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B. SIEMBRA EN PLACA PETRI:

1. Tcnica de la placa estriada en sectores (en superficie).- La placa Petri
con agar se divide en sectores. La siembra se realiza con un asa (con
material de siembra), sobre el agar realizando movimientos en zigzag
desde un extremo de la placa hacia el centro de sta. Es necesario que las
estras no toquen los sectores vecinos. Esterilizar el asa al terminar la
siembra luego de cerrar la placa y colocar la placa con la tapa hacia
abajo.
2. Tcnica de siembra con un extensor (en superficie).- Con la mano
izquierda la tapa de la placa Petri bajo mechero sostenindolo con el
dedo ndice y el pulgar. Con una asa o pipeta se vierte el material de
siembra a la superficie del agar, y con el extensor se cubre toda la
superficie con el material haciendo movimientos giratorios. Al final se
extrae el extensor, se cierra la placa y se coloca el extensor en una
solucin desinfectante. Colocar la placa con la tapa hacia abajo.
3. Tcnica de vaciado en la placa por incorporacin.- Rotular las placas.
Colocar el material de siembra con una pipeta en cada placa (1ml).
Agregar el agar. Realizar movimientos de vaivn para distribuir el
material. Invertirlas en el momento de llevarlas a incubar.
VI. DESARROLLO:
A) SIEMBRA EN TUBOS:
Antes de realizar cualquier tipo de siembra es necesario
esterilizar toda el rea en que vamos a trabajar.
Tambin debemos tener en cuenta que el material que se va a
utilizar debe estar previamente esterilizada.
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1. SIEMBRA DE UN TUBO DE ENSAYO A OTRO:

Con la mano derecha y en forma vertical se

esteriliza el asa de kolle
Cuando el asa de kolle este fro y con la misma mano se
extrae los 2 tapones con el dedo meique y apoyndolos
a la palma y al mismo tiempo se flamea el
extremo de los 2 tubos.
Con el asa se toma un poco de material de siembra y
con cuidado se traslada al tubo con el medio de cultivo
a) La siembra en un caldo de cultivo:
El cuello del tubo debe ser flameado antes y despus
de hacer el sembrado.
Con el asa previamente a la llama, se toma una
pequea cantidad de la muestra y se lleva al fondo
del tubo.

b) La siembra en un agar inclinado:

Debemos esterilizar el asa de siembra
llevndolo a la llama del mechero.
Esta es una siembra por estra en agar
inclinado, cuyo mtodo es en zig zag.
Se extrae la muestra del tubo y se siembra
en otro tubo que tiene el agar inclinado.
Despus se flamea, se tapa el tubo y
finalmente se esteriliza el asa.
Esta tcnica tiene la caracterstica que el
agar es un medio slido y adems se encuentra inclinado.
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c) La siembra en una columna de agar vertical (por picadura)

Una de las caractersticas de esta siembra es que el asa
tiene la forma de aguja.
El procedimiento adecuado es: esterilizar el asa, tomar la
muestra, proceder a la siembra sumergiendo el asa en
forma vertical para que no se rompa el agar. luego
esterilizar el asa, finalmente flamear y tapar el tubo.

Extraccin de la muestra

Siembra de muestra

d) La siembra en un caldo de cultivo con una pipeta graduada o de pasteur:

La pipeta utilizada normalmente es de 0.1 ml.
El procedimiento realizado fue: en primer lugar flamear el tubo
de ensayo, luego extraer la muestra, despus se procede a la
siembra, finalmente se flamea y se tapa.

Extraccin de la muestra Flamear con muestra Tapar

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e) La siembra tambin se puede realizar con tampones

La siembra tambin se puede realizar con tubos con
tampones.

2) SIEMBRA A UN TUBO CON MEDIO DE CULTIVO DESDE UNA

PLACA PETRI.
En primer lugar se busca la colonia tpica
ms caracterstica para realizar la siembra.

Debemos esterilizar el asa de siembra

llevndolo a la llama del mechero
Luego se extrae una porcin de la
colonia aislada de la placa petri
con el asa aislada.
Se flamea el tubo
que contiene el
caldo, se procede a la siembra, se esteriliza el
asa y finalmente se tapa el tubo.

B) SIEMBRA EN PLACA PETRI:

1. Tcnica de estriado en sectores en placa petri (superficie)
Esta siembra se realiza de tubo a placa.
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Para realizar esta siembra es

conveniente dividir la placa en 4
sectores, esta siembra se realiza en zig
zag de adentro hacia afuera
La tcnica es primero se esteriliza el
asa, se extrae la muestra, se flamea, se
procede a la siembra y finalmente se
esteriliza el asa y se voltea la placa
petri previamente tapada.
2. Tcnica de siembra con un extensor (superficie)
Esta tcnica se caracteriza porque la
siembra se realiza con un extensor
Previamente flameada la placa petri,
absorber 0.1 ml de la muestra con la
pipeta
Llevar a la placa y agregar al medio.
Finalmente expandir con el extensor,
flamear, tapar y voltear la placa petri.

3. Tcnica de vaciado en placa por incorporacin

Al tener ya las placas previamente esterilizadas, se
licua el medio para convertirlo en lquido, luego hay
que esperar para que el medio llegue a 40 , se utiliza
normalmente 1 ml de este.
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Colocamos el material de siembra en una pipeta

Agregamos el 1ml de la siembra en las placas petri

Del agar previamente licuado se toma una muestra y se verte en la

placa que contiene la siembra
Con la siembra y el agar dentro de la placa petri procedemos a mover
esta en vaivn con el fin de distribuir bien el material
Invertir la placa

VII. CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES:

En medio slido cada clula viable dar origen a una colonia y por lo
tanto la siembra en placas se puede utilizar, no solo para cultivar
microorganismos, sino adems para contar y aislar.
Cuando se quieren tener colonias aisladas a partir de un material
determinando, es necesario diluir la muestra en tubos con suero
Fisiolgico estril.
Dependiendo del carcter del material para la siembra para los fines de
investigacin del medio de cultivo utilizado existen varios mtodos de
siembra.
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Las colonias deben describirse por examen macroscpico en funcin del

tamao, la forma, el borde, la elevacin, la trasparencia y el color. esto
resulta a veces muy til en l identificacin.
Tener cuidado al momento de observar las colonias ya crecidas, tener
cuidado de no voltear las placas ni inhalar cerca de la placas. Todos ellos
cumplen con un fin; aislar microorganismos, por eso se requiere trabajar
rpido, pero sin movimientos bruscos y durante el proceso de siembra no
est permitido conversar.
Las siembras que se realicen deben realizarse en lugares especiales y estar
aisladas de otros agentes que impidan su desarrollo.
Antes de realizar el trabajo el lugar debe estar bien esterilizada para
poder utilizarlo y realizar la siembra.

VIII. BIBLIOGRAFA:
E. MERCK. manual de microbiologa DARMASTACH (R.F. de ALMANIA)
GARCA GARIBAY. QUINTEROS RAMREZ. LPEZ MUNGUIA/
BIOTECNOLOGA ALIMENTARIA/ Editorial - Limusa S.A./Edicin -
Primera/ Espaa - 1998/ Pg.170 - 171.
PEARSON, D. 1986. Tcnicas de laboratorio para el anlisis de alimentos.
Editorial Acribia. Espaa
AGURTO, T. 1989. Manual de tcnicas de Microbiologa. Editorial La Pluma
Fuente S.A. Per.
http://www.merck.com.ar/MQA/SITE/wmsp.nsf/vstRefConPorTit/Microbiolog
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