Introducción

En microbiología el microscopio se utiliza de forma rutinaria, proporciona

información para la identificación de los microorganismos. En la valoración de las
muestras es transcendente el poder de la resolución del microscopio y para
aprovechar esta ventaja de los microscopios se han desarrollado técnicas
tintoriales que destacan las características morfológicas de los microorganismos.
Existe una gran variedad de tinciones que pueden ser aplicadas dentro del campo
de la microbiología. Un colorante se define como una sustancia capaz de dar color
a células, tejidos entre otros. De acuerdo a su origen se pueden definir colorantes
naturales (extraídos de plantas animales) y colorantes artificiales (minerales
procesados y manipulados en laboratorio).
Químicamente el colorante está constituido de un componente cromóforo y
auxocromo. El cromóforo es todo grupo aislado, convilente e insaturado que tiene
una absorción característica en la región ultravioleta o visible, dicho de otra forma,
es la capacidad que tiene la molécula para que sus electrones absorban energía o
luz visible, existen y se emiten diversos colorantes de acuerdo con la longitud
emitida como resultado del cambio en el nivel energético. Los ciuxocromos son
grupos funcionales o radicales que constituyen una molécula y poseen carga
parcial positiva; tienen la función de intensificar la formación de color mediante la
acción de grupos de átomos monosaturados, su función es aumentar la
intensidad.
Aunque los microorganismos vivos se pueden observar directamente en fresco al
microscopio óptico, la mayoría de la veces es necesario teñirlos para una mayor
identificación. Así los colorantes tienen las siguientes funciones:
1. Permiten hacer visibles a los objetos microscópicos y transparentes.
2. Revelan su forma.
3. Muestran la presencia de estructuras internas y extremas.
Las tinciones se pueden clasificar como simples cuando toda la muestra se tiñe
del mismo color y se utiliza un solo colorante (azul de lactofenol o tinta china);
tinción diferencial, cuando se visualiza mas de un color se utiliza mas de un
colorante (Gram o Ziehl-Neelsen); tinción especifica cuando se utilizan anticuerpos
marcados con una molécula fluorescente para identificar una estructura celular
particular (Inmunocitoquimico). Algunas técnicas tintoriales como Gram o Ziehl-
Neelsen requieren ante su proceso la fijación de las muestras, con la finalidad de
preservar la arquitectura estructural y química de las células. Existen dos tipos de
fijadores: físicos y químicos. Entre los procesos de fijación físicos se contempla la
decantación, calor seco, calor húmedo y ultrasonido, mientras que en los procesos
de fijación química se pueden clasificar como oxidantes (Oxido crómico, ácido
acético, acido pícrico, acetona y dicromato de potasio) y agentes químicos
reductores (formaldehído, glutaraldehído, etanol, metanol, etc.). Quizá el método
físico con mayor utilización es el calor seco, que consiste en exponer directamente
el portaobjetos a la flama del mechero. Sin embargo, la sobreexposición o
exposición en una zona incorrecta de la flama repercutirá en el efecto de secado,
es muy común provocar alteraciones morfológicas y destrucción celular. Este
método preserva el extentido por poco tiempo, por lo que se recomienda utilizar un
método químico que ofrezca mejores resultados para la fijación.

Tinción de Gram
Se considera como una tinción diferencial ya que requiere el uso de al menos tres
reactivos químicos que se aplican en secuencia de fijación de calor , y clasifica a
la bacterias en dos grandes grupos: bacterias Gram positivas y Gram negativas.
Esta técnica fue desarrollada por el científico danés Hans Christian Gram en 1884;
hoy en día es una de las tinciones mas utilizadas universalmente debido a lo
económico, sencillo y eficaz que resulta.
Los principios de la tinción de Gram están basado en las características de la
pared celular de las bacterias, las Gram negativas están constituidas por una capa
fina peptidoglicano y una membrana celular externa, mientras que las Gram
positivas poseen una pared celular gruesa constituida por peptidoglicano, pero no
cuenta con una membrana celular externa, de esta manera la composición
química y el contenido de peptidoglicano en la pared celular de las bacterias Gram
positivas y Gram negativas explica y determina las características tintoriales.
(Imagen 1)

Imagen 1
Esquema de las diferencias estructurales entre bacterias Gram positivas y Gram
negativas
La tinción de Gram se basa en colocar como colorante primario, cristal violeta, el
cual tiene una afinidad con el peptidoglicano de la pared bacteriana.
Posteriormente se coloca Lugol, el cual sirve como mordiente e impide la salida
del cristal violeta por la formación de un complejo cristal violeta-Iodo que satura los
espacios del peptidoglicano de la pared bacteriana y cierra los poros de la misma,
también destruye la membrana externa de las Gram negativas debido a que esta
es soluble a la acción de solvente orgánicos, como la mezcla de alcohol-acetona.
Las bacterias Gram positivas, al contener una gran cantidad de peptidoglicano,
retienen con mayor fuerza este complejo, mientras que las Gram negativas no lo
pueden retener por tener una menor cantidad. Por ultimo se coloca safranina, la
cual funciona como colorante secundario o de contra tinción y sirve para teñir a las
bacterias que no pudieron retener el complejo. Existen bacterias de un mismo
genero que pueden observarse en la misma muestra como Gram negativas y
Gram positivas, a este evento se le llama tinción de Gram variable secundaria a
alteración de nutrientes, temperatura, pH o concentración de electrolitos. No todas
las bacterias se pueden teñir con esta técnica ya que carecen de pared celular
(micoplasma) o su pared celular tiene una composición química diferente
(microbacterias que cuentan con una gran cantidad de ácidos micólico). Las
muestras útiles para su uso son líquidos estériles, biopsias para cultivo abscesos,
crecimiento de colonias aisladas en medios de cultivo. Las Gram positivas se
observan de color azul obscuro a morado, mientras que las gran negativas se
observan de color rosa a rojo.

a) b)
(Imagen 2) Fotomicrografia donde se observan ambos tipos de bacterias a) gran
positiva bacillos anthracis. b) Gram negativa Pseudomonas aeruginosa.

Morfología bacteriana
Microscopia
Tamaño: El tamaño de las bacterias oscila entre 0.5 y 3Nm, pudiendo llegar a
algunos tipos de bacterias a 10 Nm. La mayoría solo son visibles al microscopio
óptico o electrónico. Para observarlas con el microscopio óptico se usa el aumento
100X, sumergiendo el lente en una gota de aceite de inmersión en el preparado a
observar.
Forma: La forma de las bacterias esta determinada por la rigidez de su pared
celular. Básicamente se diferencian según su forma, algunas formas pueden ser
en cocos (ovaladas o esféricas), bacilos (cilíndrica o de bastones, rectos o
cuervas) y espirilos (espiral); dentro de estas ultimas se encuentran: treponema,
borrelia y leptospira (imagen 3). Los espirilos varían en el numero de vueltas des
pocas (Borrelia) a muchas (Treponemas). Las bacterias pueden mantenerse
unidas con otras después de la división celular, pero conservando siempre la
independencia celular. Si el plano de división es única, podemos encontrar
diplococos o cocos en cadena (microorganismos del género streptococus). Si los
planos de división son muchos, los cocos pueden agruparse en racimos
(Staphylococus). Los bacilos pueden ser muy cortos (cocobacilos) o muy largos.
Sus extremos pueden ser redondos o rectos; pueden estar aislados, en cadenas o
en filamentos (Corynebacterium). Los bacilos curvos pueden tener forma de coma
(Vibrio cholerae)

Imagen 3 morfología de las bacterias

Macroscópica
La mayoría de las bacterias se multiplican rápidamente y son visibles como
colonias cuando se les siembra en medios de cultivo sólidos. Una colonia esta
constituida por los descendientes de una o pocas células. Las características de la
colonia también dependen de la movilidad de la bacteria, el tamaño puede variar.
La forma de colonia puede ser circular (Staphylococcus), irregular o filamentosa
(bacilus). Los bordes pueden ser ondulados (característica de los bacilos largos
como Bacillos anthrarsis), en sierra o dentados (yersinia pestis) o lisos, entre
otros.

Objetivos
 Realizar una tinción de Gram de bacterias.
 Observar la morfología bacteriana y aprender a distinguir los distintos tipos
de agrupaciones que existen
 Practicar con el microscopio en todos los aumentos y llevar a cabo el
correcto empleo del aceite de inmersión

Material Reactivos
3 pipetas desechables de 3 ml Solución de cristal violeta
1 asa bacteriológica Solución de Lugol
1 mechero bunsen Solución de safranina
5 cubreobjetos Alcohol
5 portaobjetos Agua destilada
1 pizeta con agua destilada Aceite de inmersión
1 pizeta con alcohol
1 puente de tinción
1 microscopio
1 par de guantes de látex

Metodología
Se coloco en el centro del portaobjetos una gota de agua destilada, donde
posteriormente en condiciones asépticas se tomo el asa bacteriológica y se tomo
una pequeña cantidad de cultivo bacteriano y se removió en la gota de agua hasta
formar una suspensión homogénea. Enseguida se fijo el material pasándolo de 4 o
5 veces por la llama del mechero y se coloco el portaobjetos en el puente de
tinción donde se llevo a cabo el proceso siguiente:
I. Se coloco en la muestra la solución de cristal violeta, dejándolo actuar
durante 1 minuto y se lavo enseguida con agua destilada.
II. Se agrego la solución de Lugol, dejándolo reaccionar por un minuto y
nuevamente se lavó con agua destilada.
III. Se agregó la solución de alcohol, dejándolo reaccionar por solo 10
segundos y enseguida se lavo con agua destilada.
IV. Finalmente se adiciono el colorante de safranina dejándolo reaccionar por
un minuto y se lavo con agua destilada, dejándolo escurrir y secándolo
suavemente con un papel clínex para posterior colocar los portaobjetos de
manera vertical.
Cuando finalizo el proceso anterior finalizo se coloco el portaobjetos en el
microscopio y se observo a los difentes aumentos que tiene el microscopio.

Resultados
Se pudo observar la morfología de las bacterias en el cual se hallaron bacterias
del género cocos, así como también se encontraron bacterias Gram negativas.

Conclusiones
Se demostró la eficiencia de la técnica de Gram y el procedimiento se debe llevar
a cabo para obtener los mejores resultados. Esta técnica de tinción fue muy
sencilla de realizar, solo se debe tomar precaución al utilizar los reactivos,
evitando utilizar las soluciones sin protección en las manos.