METODOS DE SIEMBRA Y CULTIVO

INTRODUCCION: Para efectuar el estudio de los microorganismos, se han diseñado diversos métodos que permiten cultivarlos bajo condicione artificiales, en los que es posible cultivarlos bajo condiciones experimentales y manejar un solo tipo de microorganismo. Una de las técnicas más usadas en el laboratorio de microbiología consiste en transferir una muestra microbiológica de un ambiente determinado a un medio de cultivo, lo que permite obtener cultivos microbianos. A l efectuar este procedimiento, es necesario considerar que en el área de trabajo, existen muchos otros microorganismos; debido a esto, es necesario tomar precauciones para impedir que éstos penetren y contaminen los cultivos en estudio. Por otra parte, para considerar no sólo el aspecto nutricional, sino también las condiciones ambientales de su hábitat natural, por lo que en el medio de cultivo se debe ajustar el pH y concentración de sales y durante la incubación condiciones tales como la temperatura, aireación la luminosidad. La aplicación de estos procedimientos ha permitido propagar a los microorganismos en cultivos mixtos, así como su aislamiento y la obtención de cultivos puros, facilitando de este modo, el estudio, caracterización, aplicación y control de los mismos. La forma de sembrarlos y cultivarlos depende del tipo de microorganismo y propósito específico del estudio. OBJETIVOS: • •

Aprender los principales métodos de siembra de microbiología Aprender los principales métodos de cultivo existentes Aplicar la técnica adecuada para preparar el área de trabajo y evitar contaminaciones. Seleccionar y aplicar las técnicas de siembra adecuadas para alcanzar propósitos específicos.

FUNDAMENTO TEORICO: Cultivar un microorganismo significa promover intencionalmente el desarrollo de éste en medios de cultivo y condiciones de laboratorio controladas. La población de microorganismos desarrollada en un medio se denomina cultivo. Cuando éste contiene una sola especie de microorganismo, se denomina cultivo puro oaxénico, cuando contiene más de una especie de microorganismos se denomina cultivo mixto. Un cultivo tipo contiene una especie conocida de microorganismos y es conservada en el laboratorio para realizar diversos ensayos y estudios. Un cultivo axénico consiste en una sola especie microbiana, proveniente de una sola célula. Los cultivos axénicos son muy raros en la naturaleza. En los medios naturales -por ejemplo, en el suelo, agua, o en el cuerpo humanoexisten cultivos mixtos. En un cultivo mixto, viven muchas y diferentes especies

Por ejemplo: los medios . el lavado de las manos. hisopos. pipeta pasteur. aislamos un solo microorganismo del resto y se podrá multiplicar en condiciones favorables. será más que suficiente para efectuar una transferencia exitosa. espátula y/o gancho. Con relación a la concentración del inóculo. es obvio que con una cantidad pequeñísima (casi invisible) que se adhiera al asa. Estos microorganismos no deseados o contaminantes deben ser eliminados de un cultivo para que éste pueda ser axénico. en la naturaleza. El segundo paso para obtener un cultivo axénico es inocular o introducir. Para impedir la contaminación de los cultivos. Estos incluyen el área de trabajo. pipeta (para uso microbiológico son terminales y la parte superior o boquilla debe estar protegida con filtro de algodón). esterilizado previamente. Un cultivo axénico se obtiene artificialmente en el laboratorio. la esterilización de todos los utensilios y medios de cultivo a emplear y realizar la transferencia del microorganismo en una zona estéril. es necesario tener plena conciencia de la ubicuidad de los microorganismos. una sola célula de un microorganismo en un medio sólido o liquido. Unclon está constituido por una población de células descendientes de un solo microorganismo. lo que es innecesario. De esta manera. En la transferencia de microorganismos se emplean agujas. Una colonia es un clon lo suficientemente grande como para ser visible sobre la superficie de un medio sólido. el seguimiento cuidadoso y detallado de la misma evita accidentes tales como: • • La contaminación y pérdida del cultivo en estudio La salida y dispersión de microorganismos del cultivo. pipetas o pipetas pasteur que deberán esterilizarse previamente. Un cultivo microbiano que ha estado creciendo por cierto tiempo en el mismo tubo o matraz. de este modo en la transferencia de una muestra microbiológica a otro recipiente. productos y del personal.de forma conjunta. asa. en el laboratorio y en los instrumentos y recipientes usados en los experimentos. lo que ocasionaría la contaminación de utensilios. A la hora de obtener un cultivo axénico se han de tomar precauciones especiales. así como de los diferentes medios de cultivo tienen aplicaciones específicas. lo que determina que el aíre y todas las superficies estén densamente pobladas por microorganismos. Una colonia de bacterias del tamaño de la cabeza de un alfiler contiene varios millones de microorganismos. cable de Kolle o portasa con alambre de platino dispuesto en forma de: aguja. asas de inoculación. un error frecuente del principiante consiste en tomar muestras grandes. La utilización de estos dispositivos. la que se obtiene trabajando cerca de la flama del mechero. debe ser transferido a un medio de cultivo nuevo. En esta transferencia se deben considerar dos aspectos básicos referentes a: no introducir microorganismos indeseables (contaminantes) y concentración o carga microbiana de la muestra (inóculo) a sembrar. Al conjunto de procedimientos realizados para prevenir o evitar la contaminación se le llama técnica aséptica. Este último aspecto es particularmente importante cuando se trabaja con cultivos de microorganismos patógenos. Dispositivos empleados en la transferencia de muestras microbianas: hisopo. de otra manera el crecimiento y sobrevivencia no pueden continuar. ya que los microorganismos están por todas partes. se deben tener una serie de cuidados que eliminen los riesgos de contaminación.

los que sólo crecen en ausencia de oxígeno se denominan anaerobios obligados o estrictos. los microorganismos al multiplicarse forman agregados que se hacen visibles a simple vista. en este tipo de cultivos. un hisopo. Algunos microorganismos crecen por debajo de 15ºC. el inóculo se deposita dentro del caldo o medio líquido. un tercer grupo se adapta a las dos . el crecimiento de cualquier cultivo experimental que se realice en incubadora no debe prolongare por más de nueve días. Para alcanzar y mantener estas temperaturas se puede usar una incubadora microbiológica o un baño de agua a temperatura constante. La siembra se realiza con el asa. a temperatura ambiente. lo que permite estandarizar la concentración del inóculo. En este tipo de cultivos los microorganismos presentan un desarrollo particular que se manifiesta en la superficie o a través de todo el líquido. En general las incubadoras microbiológicas satisfacen las necesidades en cuanto a los rangos de temperatura requeridas por los microorganismos. algunos requieren de pH alcalino o ácido. por lo que al proporcionar un pH adecuado se favorecerá el crecimiento del microorganismo de interés y la obtención del cultivo. en este último caso es necesario calentar el medio y cuando se encuentra en estado líquido y a una temperatura de aproximadamente 42ºC se agrega el inóculo. En cualquier medio de cultivo es de primordial importancia ajustar el pH. lo que determina la deshidratación de los medios de cultivo. ya que aún cuando la mayoría de los microorganismos crecen mejor en pH neutro. se homogeniza y se deja solidificar. las poblaciones se encuentran suspendidas y e fácil homogenizarlas. otros requieren temperaturas más elevadas (30 a 45ºC) y algunos hasta 80ºC. Un cultivo líquido puede ser transferido mediante un asa microbiológica. en tanto que para lo microorganismos que presentan su crecimiento óptimo a temperaturas entre 20 y 25ºC se pueden incubar en la gaveta o cajón del laboratorio. Los medios sólidos e preparan en tubos o matraces dependiendo de la cantidad o de las necesidades. Una de las ventajas que presenta este tipo de cultivo se refiere a la posibilidad de agitarlos acelerando la velocidad de microorganismos anaerobios. Con relación a las necesidades gaseosas. Estos medios se emplean para estudiar la movilidad de los microorganismos y para favorecer la separación de microorganismos con diferentes requerimientos de oxígeno. inoculando la superficie del agar con mucha suavidad. e que en ellos e difícil detectar contaminación a simple vista. después de esterilizarlos. no todos los microorganismo crecen en presencia de oxígeno atmosférico. a estos agregados se les denominan colonias. se inoculan con aguja de siembra (asa recta) o pipeta pasteur. La desventaja que presentan. Los medios semisólidos e preparan en tubos.líquidos se preparan en tubos o matraces que se cubren con tapones de algodón o tapones especiales. estos se inclinan o vierten en cajas de petri. en estos medios. El crecimiento óptimo de los microorganismos se presenta a temperaturas que la mayoría de las veces están relacionadas con la de su hábitat natural. por otra parte. los que sólo crecen en presencia de aíre se llaman aerobios obligados. Por lo tanto. las que presentan características que varían con el tipo de microorganismo cultivado y el medio de cultivo empleado. La desventaja que tienen es que estos aparatos funcionan con aíre seco. Con este mismo propósito durante la incubación se deben proporcionar las condiciones adecuadas para el microorganismo en estudio. pipeta o pipeta pasteur.

se encuentran ampliamente distribuidas en la naturaleza. tamaño. serán. Por tanto. Por tanto. En el estudio de cultivos bacterianos algunos de los criterios que se emplean para caracterizarlas incluyen: tamaño. Para ello. casi con toda seguridad. Por ejemplo. pero a veces de cien en cien. pero sólo lo utilizan cuando éste existe en concentraciones reducidas. que la dilución no se puede realizar en una sola etapa. dos células quedaron depositadas tan juntas que han originado una única colonia mixta. Aunque cada colonia posiblemente representa un clon derivado de una sola célula. El desarrollo de estos diferentes grupos e favorece mediante la agitación de los cultivos o mediante la exclusión de oxígeno para lo que se emplean sustancias reductoras o equipos especiales. no podemos asegurarlo. se desarrollan en un rango muy amplio de temperatura. Las colonias que se desarrollen la segunda vez.condiciones y se le conoce como facultativos. permitiendo que las células aisladas experimenten un número suficiente de divisiones para formar colonias visibles. Los métodos de vertido en placa y extensión en placa En estos métodos. las placas se incuban en un lugar adecuado. en la superficie de medio sin sembrar aún. Las bacterias son organismos procarióticos. cultivos axénicos. Para realizar diluciones de diez en diez. a estos se les llama microaerofílicos. el suelo. A continuación. en la superficie o en el interior de plantas y animales incluyendo al hombre. Fisiológicamente este grupo presenta características muy variables. hay bacterias móviles e inmóviles fotosintéticas y quimiotróficas. formación de esporas. Se siguen estas técnicas cuando la muestra contiene tantos microorganismos. conviene repetir el procedimiento a partir de una colonia bien aislada en la primera placa. reacción a la tinción de Gram. se flamea el asa. forma de agrupación. Existe una cuarta categoría que comprende bacterias que requieren oxígeno. se realizan diluciones seriadas (en varias etapas). pH y condiciones gaseosas. con un asa de siembra se toma una muestra de la población mixta y a continuación se hacen estrías sobre la superficie de un medio sólido preparado en una placa Petri (a las placas Petri también se les denomina simplemente placas). A continuación. Quizás. Repitiendo este proceso varias veces se logra separar células individuales. presencia de inclusiones de reserva y características culturales en medios líquidos y sólidos en los que presentan patrones de desarrollo en cuanto a la forma. habitan en el agua. movilidad. las suspensiones de células microbianas se diluyenantes de su siembra en placa. normalmente de diez en diez. Conforme se van haciendo estrías en zigzag con el asa. elevación y color de las colonias. morfología celular. una suspensión con mil millones de células por mililitro debe ser diluida 107 veces para obtener una suspensión con un centenar de células por mililitro. se toca en la región donde se han realizado las últimas estrías y se continúa la siembra con la misma técnica. Técnicas de siembra: El método de siembra por estría en placa: Es el método más fácil y el más usado para obtener cultivos axénicos. se añade 1 ml de la suspensión bacteriana a 9 ml (le . comensales o mutualistas. Pueden vivir en forma libre o en simbiosis con otros organismos. autótrofas y heterótrofas. para asegurarnos de que hemos obtenido un cultivo axénico. cada vez se van depositando en la superficie del medio menos microorganismos. ya sea como parásitos.

Como en el método de siembra por estría. Las colonias superficiales se extenderán y serán más grandes. por tanto se eligen cuando se ha de seleccionar una cepa a partir de una mezcla con varios tipos de microorganismos. las muestras diluidas se mezclan con agar fundido y se vierten en placa. En el segundo método (extensión en placa). Las dos técnicas de siembra por dilución presentan la ventaja de que permiten obtener un mayor número de colonias aisladas que el método de siembra por estría. En el método de vertido en placa. MATERIALES: materiales reactivos . La suspensión se absorbe en el agar. las muestras diluidas se siembran directamente en la superficie de la placa de agar. extendiéndolas con avuda de un asa de Diralsky de cristal estéril. A continuación. no existe la seguridad de que las colonias que aparecen en las placas sembradas por extensión o en el agar solidificado sembrado por el método del vertido en placas sean cultivos axénicos hasta que se repita el proceso. igualmente estéril. dejando las células microbianas sobre la superficie. Algunas colonias quedarán embebidas en el agar y otras crecerán en la superficie. Se agita vigorosamente para diluir las células y el proceso se repite cuantas veces sea necesario.medio estéril o solución salina. En ambas técnicas las placas se incuban hasta la aparición de las colonias. se puede proceder de dos maneras diferentes.

Siembra de un tubo de ensayo a otro El tubo con el material para la siembra y el tubo con el medio de cultivo se toman ambos con la mano izquierda en forma inclinada. se flamea el extremo de los dos tubos. Con la mano derecha se toman con el asa de kolle y se esterilizan en posición vertical en el mechero. Siembra en tubos a. luego de enfriarla y con cuidado se le traslada al tubo con el medio de cultivo.• • • • • placas petri tubo de ensayo pipetas asa aguja de kolle PROCEDIMEINTO: A) SIEMBRA EN TUBOS: 1. con el asa se toma un poco de material de siembra. Forma de retirar el algodón del tubo . detal manera que los extremos de ambos tubos estén a un mismo nivel. con la misma mano se extrae los dos tapones con el dedo meñique y el siguiente apoyándolos a la palma al mismo tiempo.

Ojo: El caldo del cultivo no debe mojar el tapón de algodón • Para sembrar un agar inclinado al asa con el material se le da movimientos de zig-zag en la superficie del agar de abajo hacia arriba. el asa con el material. Siembra en superficie . se introduce en un líquido por la pared inferior del tubo y se extrae por la pared superior.Esterilización del asa • Cuando la siembra es de un caldo de cultivo.

y con el material de siembra se introduce hasta el fondo y se lo retira (debe de ser en el medio de tubo sin rozar las paredes) Siembra por picadura • La siembra de en una caldo se puede realizar con una pipeta de Pasteur o una pipeta graduada. La siembra se realiza como en los casos anteriores. se utiliza una aguja. Se esteriliza el asa. se retira el asa. Siembra a un tubo con medio de cultivo desde una placa petri La placa petri con el material de siembra se coloca frente a uno con la tapa hacia arriba. se toma con el asa un poco de material. . Luego de la siembra las pipetas se las coloca en un líquido desinfectante. Las siembras también pueden realizarse con tampones • a. la cual se esteriliza bajo mechero. se abre la placa bajo el mechero.• Para sembrar en una columna de a agar vertical (por picadura). se cierra la placa y con la mano izquierda se toma el tubo con el medio de cultivo.

La siembra se realiza con un asa (con material se siembra). Técnica de la placa estriada en sectores (en superficie) La placa petri con agar se divide en sectores (4 cuadrantes). Siembra en placa petri a.2. sobre el agar realizando movimientos de zig-zag desde un extremo de la placa hacia en centro de ella. Es necesario que las estrías no toquen los sectores vecinos. . Esterilizar el asa al terminar la siembra luego de cerrar la placa y colocar la placa con la tapa hacia abajo.

Al final se extrae el extensor.b. y con el extensor se cubre toda la superficie con el material haciendo movimientos giratorios. se cierra la placa y se coloca el extensor en una solución desinfectante. sosteniéndolo con el dedo índice y el pulgar. Colocar la placa con la tapa hacia abajo. Técnica de siembra con un extensor (en superficie) Con la mano izquierda levantar la tapa de la placa petri bajo mechero. Técnica de vaciado en placa por incorporación . Con una asa o pipeta se vierte el material de siembra a la superficie del agar. c.

5. etc. Colocar el material de siembra con una pipeta en cada placa (1 ml. Colocar las placas con la tapa hacia arriba hasta que enfríe el agar. En el caso de los tubos de ensayo. la fecha y el nombre para no confundir las placas. Invertirlas en el momento de llevarlas a incubar. CONCLUSION: . RECOMENDACIONES: • Antes de utilizar los materiales (pipetas.). Agregar el agar. asas. Marcar los tubos con la identificación del cultivo.) éstos deben de ser esterilizados correctamente en el laboratorio tomando siempre las precauciones. realizar movimientos de vaivén para distribuir bien el material. Cada vez que se termina una siembra siempre hay que esterilizar el asa de kolle (flameándola con el mechero) para obtener los resultados esperados en el experiemnto. tubos.Rotular las placas. flamear la boca de éstos antes de colocar el tapón. • • 6.

LOPEZ GOÑI microbiología Manual práctico de Referencias en WEB: • • • www. GAMAZO. 8.wikipedia.com RECOEMNDACIONES: . I.com http://es.goolge.org/wiki/mediosdecultivo www.• Se pudo conocer los métodos de siembra y cultivo más utilizados en el laboratorio de microbiología y dándonos ha conocer correctamente el método que hemos utilizado en la practica. DÍAS. BIBLIOGRAFIA Libro: • R.monografias. C.

wikipedia. por lo que de esta manera se le puede llegar a identificar con su correcta siembra y observación para análisis posteriores o simplemente para la identificación de una bacteria en algún medio u organismo. 2ºed.es/personal_pdi/ciencias/jolope/GUIONPRACTICAS050 6. con lo que se observó que para cada bacteria existen características diferentes que son las que las identifican y diferencian de otras bacterias. BIBLIOGRAFIA: • • • • • Romero Cabello. Microbiología y Parasitologìa Humana: Bases etiológicas de las enfermedades infecciosas. Editorial Panamericana.257-429 http://www.pdf . Pp.org/wiki/ http://www. México 2001.CONCLUSION: Por medio de esta práctica se logró utilizar las técnicas aprendidas durante el transcurso del curso.uam. R.ucm.es/info/mfar/pdfs/GuiaMicro2.doc http://es. Se logró aprender a realizar algunos de los métodos que existen para cultivar bacterias y de esta manera observar sus características tanto macroscópicas como microscópicas e interpretación de las mismas.

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