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METODOS DE SIEMBRA Y CULTIVO

INTRODUCCION:

Para efectuar el estudio de los microorganismos, se han diseñado diversos


métodos que permiten cultivarlos bajo condicione artificiales, en los que es
posible cultivarlos bajo condiciones experimentales y manejar un solo tipo de
microorganismo. Una de las técnicas más usadas en el laboratorio de
microbiología consiste en transferir una muestra microbiológica de un ambiente
determinado a un medio de cultivo, lo que permite obtener cultivos microbianos.
A l efectuar este procedimiento, es necesario considerar que en el área de
trabajo, existen muchos otros microorganismos; debido a esto, es necesario
tomar precauciones para impedir que éstos penetren y contaminen los cultivos
en estudio. Por otra parte, para considerar no sólo el aspecto nutricional, sino
también las condiciones ambientales de su hábitat natural, por lo que en el
medio de cultivo se debe ajustar el pH y concentración de sales y durante la
incubación condiciones tales como la temperatura, aireación la luminosidad.
La aplicación de estos procedimientos ha permitido propagar a los
microorganismos en cultivos mixtos, así como su aislamiento y la obtención de
cultivos puros, facilitando de este modo, el estudio, caracterización, aplicación y
control de los mismos. La forma de sembrarlos y cultivarlos depende del tipo de
microorganismo y propósito específico del estudio.
OBJETIVOS:

• Aprender los principales métodos de siembra de microbiología


• Aprender los principales métodos de cultivo existentes
• Aplicar la técnica adecuada para preparar el área de trabajo y evitar
contaminaciones.

• Seleccionar y aplicar las técnicas de siembra adecuadas para alcanzar


propósitos específicos.

FUNDAMENTO TEORICO:

Cultivar un microorganismo significa promover intencionalmente el desarrollo


de éste en medios de cultivo y condiciones de laboratorio controladas. La
población de microorganismos desarrollada en un medio se denomina cultivo.
Cuando éste contiene una sola especie de microorganismo, se denomina
cultivo puro oaxénico, cuando contiene más de una especie de
microorganismos se denomina cultivo mixto. Un cultivo tipo contiene una
especie conocida de microorganismos y es conservada en el laboratorio para
realizar diversos ensayos y estudios.
Un cultivo axénico consiste en una sola especie microbiana, proveniente de
una sola célula. Los cultivos axénicos son muy raros en la naturaleza. En los
medios naturales -por ejemplo, en el suelo, agua, o en el cuerpo humano-
existen cultivos mixtos. En un cultivo mixto, viven muchas y diferentes especies
de forma conjunta. Un cultivo axénico se obtiene artificialmente en el
laboratorio. A la hora de obtener un cultivo axénico se han de tomar
precauciones especiales, ya que los microorganismos están por todas partes,
en la naturaleza, en el laboratorio y en los instrumentos y recipientes usados en
los experimentos. Estos microorganismos no deseados o contaminantes deben
ser eliminados de un cultivo para que éste pueda ser axénico. El segundo paso
para obtener un cultivo axénico es inocular o introducir, una sola célula de un
microorganismo en un medio sólido o liquido, esterilizado previamente. De esta
manera, aislamos un solo microorganismo del resto y se podrá multiplicar en
condiciones favorables. Unclon está constituido por una población de células
descendientes de un solo microorganismo. Una colonia es un clon lo
suficientemente grande como para ser visible sobre la superficie de un medio
sólido.
Un cultivo microbiano que ha estado creciendo por cierto tiempo en el mismo
tubo o matraz, debe ser transferido a un medio de cultivo nuevo, de otra
manera el crecimiento y sobrevivencia no pueden continuar. En esta
transferencia se deben considerar dos aspectos básicos referentes a: no
introducir microorganismos indeseables (contaminantes) y concentración o
carga microbiana de la muestra (inóculo) a sembrar.
Para impedir la contaminación de los cultivos, es necesario tener plena
conciencia de la ubicuidad de los microorganismos, lo que determina que el
aíre y todas las superficies estén densamente pobladas por microorganismos,
de este modo en la transferencia de una muestra microbiológica a otro
recipiente, se deben tener una serie de cuidados que eliminen los riesgos de
contaminación. Estos incluyen el área de trabajo, el lavado de las manos, la
esterilización de todos los utensilios y medios de cultivo a emplear y realizar la
transferencia del microorganismo en una zona estéril, la que se obtiene
trabajando cerca de la flama del mechero. Al conjunto de procedimientos
realizados para prevenir o evitar la contaminación se le llama técnica aséptica;
el seguimiento cuidadoso y detallado de la misma evita accidentes tales como:
• La contaminación y pérdida del cultivo en estudio
• La salida y dispersión de microorganismos del cultivo, lo que ocasionaría
la contaminación de utensilios, productos y del personal. Este último
aspecto es particularmente importante cuando se trabaja con cultivos de
microorganismos patógenos.
Con relación a la concentración del inóculo, un error frecuente del principiante
consiste en tomar muestras grandes, lo que es innecesario. Una colonia de
bacterias del tamaño de la cabeza de un alfiler contiene varios millones de
microorganismos, es obvio que con una cantidad pequeñísima (casi invisible)
que se adhiera al asa, será más que suficiente para efectuar una transferencia
exitosa.
Dispositivos empleados en la transferencia de muestras microbianas: hisopo,
pipeta (para uso microbiológico son terminales y la parte superior o boquilla
debe estar protegida con filtro de algodón), pipeta pasteur, cable de Kolle o
portasa con alambre de platino dispuesto en forma de: aguja, asa, espátula y/o
gancho.
En la transferencia de microorganismos se emplean agujas, asas de
inoculación, hisopos, pipetas o pipetas pasteur que deberán esterilizarse
previamente. La utilización de estos dispositivos, así como de los diferentes
medios de cultivo tienen aplicaciones específicas. Por ejemplo: los medios
líquidos se preparan en tubos o matraces que se cubren con tapones de
algodón o tapones especiales. Un cultivo líquido puede ser transferido
mediante un asa microbiológica, un hisopo, pipeta o pipeta pasteur; el inóculo
se deposita dentro del caldo o medio líquido. En este tipo de cultivos los
microorganismos presentan un desarrollo particular que se manifiesta en la
superficie o a través de todo el líquido. Una de las ventajas que presenta este
tipo de cultivo se refiere a la posibilidad de agitarlos acelerando la velocidad de
microorganismos anaerobios, por otra parte, en este tipo de cultivos, las
poblaciones se encuentran suspendidas y e fácil homogenizarlas, lo que
permite estandarizar la concentración del inóculo. La desventaja que
presentan, e que en ellos e difícil detectar contaminación a simple vista.
Los medios semisólidos e preparan en tubos, se inoculan con aguja de siembra
(asa recta) o pipeta pasteur; en este último caso es necesario calentar el medio
y cuando se encuentra en estado líquido y a una temperatura de
aproximadamente 42ºC se agrega el inóculo, se homogeniza y se deja
solidificar. Estos medios se emplean para estudiar la movilidad de los
microorganismos y para favorecer la separación de microorganismos con
diferentes requerimientos de oxígeno.
Los medios sólidos e preparan en tubos o matraces dependiendo de la
cantidad o de las necesidades, después de esterilizarlos, estos se inclinan o
vierten en cajas de petri. La siembra se realiza con el asa, inoculando la
superficie del agar con mucha suavidad; en estos medios, los microorganismos
al multiplicarse forman agregados que se hacen visibles a simple vista; a estos
agregados se les denominan colonias, las que presentan características que
varían con el tipo de microorganismo cultivado y el medio de cultivo empleado.
En cualquier medio de cultivo es de primordial importancia ajustar el pH, ya que
aún cuando la mayoría de los microorganismos crecen mejor en pH neutro,
algunos requieren de pH alcalino o ácido, por lo que al proporcionar un pH
adecuado se favorecerá el crecimiento del microorganismo de interés y la
obtención del cultivo. Con este mismo propósito durante la incubación se deben
proporcionar las condiciones adecuadas para el microorganismo en estudio. El
crecimiento óptimo de los microorganismos se presenta a temperaturas que la
mayoría de las veces están relacionadas con la de su hábitat natural.
Algunos microorganismos crecen por debajo de 15ºC, otros requieren
temperaturas más elevadas (30 a 45ºC) y algunos hasta 80ºC. Para alcanzar y
mantener estas temperaturas se puede usar una incubadora microbiológica o
un baño de agua a temperatura constante, en tanto que para lo
microorganismos que presentan su crecimiento óptimo a temperaturas entre 20
y 25ºC se pueden incubar en la gaveta o cajón del laboratorio, a temperatura
ambiente.
En general las incubadoras microbiológicas satisfacen las necesidades en
cuanto a los rangos de temperatura requeridas por los microorganismos. La
desventaja que tienen es que estos aparatos funcionan con aíre seco, lo que
determina la deshidratación de los medios de cultivo. Por lo tanto, el
crecimiento de cualquier cultivo experimental que se realice en incubadora no
debe prolongare por más de nueve días. Con relación a las necesidades
gaseosas, no todos los microorganismo crecen en presencia de oxígeno
atmosférico; los que sólo crecen en presencia de aíre se llaman aerobios
obligados; los que sólo crecen en ausencia de oxígeno se denominan
anaerobios obligados o estrictos, un tercer grupo se adapta a las dos
condiciones y se le conoce como facultativos. Existe una cuarta categoría que
comprende bacterias que requieren oxígeno, pero sólo lo utilizan cuando éste
existe en concentraciones reducidas; a estos se les llama microaerofílicos. El
desarrollo de estos diferentes grupos e favorece mediante la agitación de los
cultivos o mediante la exclusión de oxígeno para lo que se emplean sustancias
reductoras o equipos especiales.
Las bacterias son organismos procarióticos, se encuentran ampliamente
distribuidas en la naturaleza, habitan en el agua, el suelo, en la superficie o en
el interior de plantas y animales incluyendo al hombre. Pueden vivir en forma
libre o en simbiosis con otros organismos, ya sea como parásitos, comensales
o mutualistas. Fisiológicamente este grupo presenta características muy
variables, hay bacterias móviles e inmóviles fotosintéticas y quimiotróficas,
autótrofas y heterótrofas; se desarrollan en un rango muy amplio de
temperatura, pH y condiciones gaseosas.
En el estudio de cultivos bacterianos algunos de los criterios que se emplean
para caracterizarlas incluyen: tamaño, morfología celular, forma de agrupación,
reacción a la tinción de Gram, formación de esporas, movilidad, presencia de
inclusiones de reserva y características culturales en medios líquidos y sólidos
en los que presentan patrones de desarrollo en cuanto a la forma, tamaño,
elevación y color de las colonias.
Técnicas de siembra:

El método de siembra por estría en placa:


Es el método más fácil y el más usado para obtener cultivos axénicos. Para
ello, con un asa de siembra se toma una muestra de la población mixta y a
continuación se hacen estrías sobre la superficie de un medio sólido preparado
en una placa Petri (a las placas Petri también se les denomina simplemente
placas). Conforme se van haciendo estrías en zigzag con el asa, cada vez se
van depositando en la superficie del medio menos microorganismos. A
continuación, se flamea el asa, se toca en la región donde se han realizado las
últimas estrías y se continúa la siembra con la misma técnica, en la superficie
de medio sin sembrar aún. Repitiendo este proceso varias veces se logra
separar células individuales. A continuación, las placas se incuban en un lugar
adecuado, permitiendo que las células aisladas experimenten un número
suficiente de divisiones para formar colonias visibles. Aunque cada colonia
posiblemente representa un clon derivado de una sola célula, no podemos
asegurarlo. Quizás, dos células quedaron depositadas tan juntas que han
originado una única colonia mixta. Por tanto, para asegurarnos de que hemos
obtenido un cultivo axénico, conviene repetir el procedimiento a partir de una
colonia bien aislada en la primera placa. Las colonias que se desarrollen la
segunda vez, serán, casi con toda seguridad, cultivos axénicos.
Los métodos de vertido en placa y extensión en placa
En estos métodos, las suspensiones de células microbianas se diluyenantes de
su siembra en placa. Se siguen estas técnicas cuando la muestra contiene
tantos microorganismos, que la dilución no se puede realizar en una sola etapa.
Por ejemplo, una suspensión con mil millones de células por mililitro debe ser
diluida 107 veces para obtener una suspensión con un centenar de células por
mililitro, Por tanto, se realizan diluciones seriadas (en varias etapas),
normalmente de diez en diez, pero a veces de cien en cien. Para realizar
diluciones de diez en diez, se añade 1 ml de la suspensión bacteriana a 9 ml (le
medio estéril o solución salina, igualmente estéril. Se agita vigorosamente para
diluir las células y el proceso se repite cuantas veces sea necesario. A
continuación, se puede proceder de dos maneras diferentes.
En el método de vertido en placa, las muestras diluidas se mezclan con agar
fundido y se vierten en placa. Algunas colonias quedarán embebidas en el agar
y otras crecerán en la superficie. Las colonias superficiales se extenderán y
serán más grandes. En el segundo método (extensión en placa), las muestras
diluidas se siembran directamente en la superficie de la placa de agar,
extendiéndolas con avuda de un asa de Diralsky de cristal estéril. La
suspensión se absorbe en el agar, dejando las células microbianas sobre la
superficie. En ambas técnicas las placas se incuban hasta la aparición de las
colonias. Como en el método de siembra por estría, no existe la seguridad de
que las colonias que aparecen en las placas sembradas por extensión o en el
agar solidificado sembrado por el método del vertido en placas sean cultivos
axénicos hasta que se repita el proceso. Las dos técnicas de siembra por
dilución presentan la ventaja de que permiten obtener un mayor número de
colonias aisladas que el método de siembra por estría, por tanto se eligen
cuando se ha de seleccionar una cepa a partir de una mezcla con varios tipos
de microorganismos.

MATERIALES:

materiales reactivos
• placas petri
• tubo de ensayo
• pipetas
• asa
• aguja de kolle

PROCEDIMEINTO:

A) SIEMBRA EN TUBOS:

1. Siembra en tubos

a. Siembra de un tubo de ensayo a otro

El tubo con el material para la siembra y el tubo con el medio de


cultivo se toman ambos con la mano izquierda en forma inclinada,
detal manera que los extremos de ambos tubos estén a un mismo
nivel.

Con la mano derecha se toman con el asa de kolle y se esterilizan


en posición vertical en el mechero, con la misma mano se extrae
los dos tapones con el dedo meñique y el siguiente apoyándolos a
la palma al mismo tiempo, se flamea el extremo de los dos tubos;
con el asa se toma un poco de material de siembra, luego de
enfriarla y con cuidado se le traslada al tubo con el medio de
cultivo.

Forma de retirar el algodón del tubo


Esterilización del asa

• Cuando la siembra es de un caldo de cultivo, el asa con el


material, se introduce en un líquido por la pared inferior del tubo y
se extrae por la pared superior.
Ojo: El caldo del cultivo no debe mojar el tapón de algodón

• Para sembrar un agar inclinado al asa con el material se le da


movimientos de zig-zag en la superficie del agar de abajo hacia
arriba.

Siembra en superficie
• Para sembrar en una columna de a agar vertical (por picadura),
se utiliza una aguja, la cual se esteriliza bajo mechero, y con el
material de siembra se introduce hasta el fondo y se lo retira
(debe de ser en el medio de tubo sin rozar las paredes)

Siembra por picadura

• La siembra de en una caldo se puede realizar con una pipeta de


Pasteur o una pipeta graduada. Luego de la siembra las pipetas
se las coloca en un líquido desinfectante.

• Las siembras también pueden realizarse con tampones

a. Siembra a un tubo con medio de cultivo desde una placa petri

La placa petri con el material de siembra se coloca frente a uno con


la tapa hacia arriba. Se esteriliza el asa, se abre la placa bajo el
mechero, se toma con el asa un poco de material, se retira el asa,
se cierra la placa y con la mano izquierda se toma el tubo con el
medio de cultivo. La siembra se realiza como en los casos
anteriores.
2. Siembra en placa petri

a. Técnica de la placa estriada en sectores (en superficie)

La placa petri con agar se divide en sectores (4 cuadrantes). La


siembra se realiza con un asa (con material se siembra), sobre el
agar realizando movimientos de zig-zag desde un extremo de la
placa hacia en centro de ella. Es necesario que las estrías no
toquen los sectores vecinos. Esterilizar el asa al terminar la siembra
luego de cerrar la placa y colocar la placa con la tapa hacia abajo.
b. Técnica de siembra con un extensor (en superficie)

Con la mano izquierda levantar la tapa de la placa petri bajo


mechero, sosteniéndolo con el dedo índice y el pulgar. Con una
asa o pipeta se vierte el material de siembra a la superficie del
agar, y con el extensor se cubre toda la superficie con el material
haciendo movimientos giratorios. Al final se extrae el extensor, se
cierra la placa y se coloca el extensor en una solución
desinfectante. Colocar la placa con la tapa hacia abajo.

c. Técnica de vaciado en placa por incorporación


Rotular las placas. Colocar el material de siembra con una pipeta
en cada placa (1 ml.). Agregar el agar; realizar movimientos de
vaivén para distribuir bien el material. Colocar las placas con la
tapa hacia arriba hasta que enfríe el agar. Invertirlas en el momento
de llevarlas a incubar.

5. RECOMENDACIONES:

• Antes de utilizar los materiales (pipetas, tubos, asas, etc.) éstos


deben de ser esterilizados correctamente en el laboratorio tomando
siempre las precauciones.

• Cada vez que se termina una siembra siempre hay que esterilizar
el asa de kolle (flameándola con el mechero) para obtener los
resultados esperados en el experiemnto.

• En el caso de los tubos de ensayo, flamear la boca de éstos antes


de colocar el tapón. Marcar los tubos con la identificación del
cultivo, la fecha y el nombre para no confundir las placas.

6. CONCLUSION:
• Se pudo conocer los métodos de siembra y cultivo más utilizados
en el laboratorio de microbiología y dándonos ha conocer
correctamente el método que hemos utilizado en la practica.

8. BIBLIOGRAFIA

Libro:

• R. DÍAS, C. GAMAZO, I. LOPEZ GOÑI Manual práctico de


microbiología

Referencias en WEB:

• www.goolge.com
• http://es.wikipedia.org/wiki/mediosdecultivo
• www.monografias.com

RECOEMNDACIONES:
CONCLUSION:

Por medio de esta práctica se logró utilizar las técnicas aprendidas durante el
transcurso del curso. Se logró aprender a realizar algunos de los métodos que
existen para cultivar bacterias y de esta manera observar sus características
tanto macroscópicas como microscópicas e interpretación de las mismas, con
lo que se observó que para cada bacteria existen características diferentes que
son las que las identifican y diferencian de otras bacterias, por lo que de esta
manera se le puede llegar a identificar con su correcta siembra y observación
para análisis posteriores o simplemente para la identificación de una bacteria
en algún medio u organismo.

BIBLIOGRAFIA:

• Romero Cabello, R. Microbiología y Parasitologìa Humana: Bases


etiológicas de las enfermedades infecciosas.
• Editorial Panamericana, México 2001. 2ºed. Pp.257-429
• http://www.uam.es/personal_pdi/ciencias/jolope/GUIONPRACTICAS050
6.doc
• http://es.wikipedia.org/wiki/
• http://www.ucm.es/info/mfar/pdfs/GuiaMicro2.pdf