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Introduccin

En la naturaleza, los microorganismos se encuentran formando poblaciones mixtas con otros tipos de
microorganismos. Los cultivos de estas mezclas se llaman por ello cultivos mixtos. Sin embargo, el
conocimiento de los microorganismos se consigue mediante el estudio de cepas aisladas, cultivadas en el
laboratorio en cultivos puros (o axnicos). En ocasiones el estudio molecular conduce a la
caracterizacin de los microorganismos, an en poblaciones mixtas. Sin embargo la identificacin
bacteriana y la caracterizacin completa solo es posible tras el aislamiento de la bacteria y la obtencin de
cultivos puros. Por ello el primer problema al estudiar una bacteria es su aislamiento del resto de los
microorganismos presentes (enn una muestra patolgica, de agua, de suelo, de alimentos, etc.). Una vez
que se ha logrado el aislamiento es posible obtener la bacteria de inters en cultivo puro .

Aislamiento

Es la separacin de un determinado microorganismo del resto de microorganismos que


le acompaan. El mtodo ms usual es la siembra por estra sobre un medio de cultivo slido adecuado
dispuesto
en
una
placa
de
petri.
Para ello se toma una pequea cantidad de muestra con un asa de platino y se reparte sobre la superficie
del medio de cultivo. Sobre el medio quedan separadas e inmovilizadas las clulas bacterianas. Tras la
incubacin en condiciones adecuadas, cada clula viableorigina una colonia visible resultado de
sucesivas divisiones celulares. Cada colonia bacteriana tiene unas caractersticas determinadas en cuanto
a su forma, borde, elevacin, tamao , consistencia, etc.. Los tipos de bacterias presentes en la muestra
original es visible como tipos diferentes de colonias. A partir de colonias separadas suficientemente es
posible obtener un cultivo puro de cada uno de los tipos de bacterias presentes en la muestra original.
El xito del aislamiento, de la separacin sobre el medio de cultivo, depende de la superficie sobre la que
se ha distribuido la muestra. Es muy importante realizar el mayor nmero de estras posible. En las
primeras estras aparecern colonias confluentes o una masa continua de microorganismos. En las estras
finales debern aparecer colonias separadas unas de otras. El aislamiento requiere un reducido inculo de
partida. La sucesiva disminucin del tamao de la poblacin sobre el asa (por descarga sobre el medio de
cultivo) al recorrer el medio de cultivo, debe asegurar que finalmente algunas clulas queden
suficientemente separadas (aisladas unas de otras) sobre la superficie.
Criterios para la diferenciacin de colonias El aspecto de las colonias, su coloracin, tamao, etc.
permiten diferenciar diferentes bacterias, aunque son propiedades generales muy influenciadas por las
condiciones de cultivo, por lo que a continuacin se realiza una descripcin muy general. Las colonias
pueden ser opacas, translucidas o transparentes. Algunas producen pigmentos fluorescentes cuando se
iluminan con luz ultravioleta. Otras aparecen con superficie pulverulenta, otras son lisas, o rugosas, o
poseen anillos concntricos. En ocasiones el olor es tambin caracterstico.

Colonia de Serratia: aspecto mucoso, comienza a pigmentar en la parte central.

Puede observase una animacin de la siembra en estrias en esta direccin


Este video de You Tube muestra ejemplos de parmetros tiles para caracterizar las colonias de
bacterias

Obtencin de cultivos puros

Se trata de obtener el cultivo de un solo tipo microbiano en un medio de cultivo, por ejemplo en un tubo
inclinado de agar nutritivo. Para ello, se obtiene una pequea cantidad de masa bacteriana de una colonia
separada en el aislamiento. Con ella se inocula un nuevo medio de cultivo haciendo estras muy juntas. La
incubacin en condiciones adecuadas proporcionar un cultivo puro. Puede repetirse el proceso con cada
tipo de colonia. Se obtendr una coleccin de cultivos puros, separados, de los microorganismos que
coexistan en la muestra original.
Es aconsejable hacer un segundo aislamiento antes de proceder a la obtencin del cultivo puro. Si todas
las colonias de la segunda placa resultan idnticas, puede usarse una de ellas para establecer el cultivo
puro. Obtenido el cultivo puro es conveniente comprobar su pureza mediante una tincin de Gram. Los
cultivos puros de microorganismos son mantenidos en el laboratorio por resiembras (pase de un medio
de cultivo a otro) sucesivas. Una de las copias puede ser liofilizada para su conservacin.

Tecnicas y metodos de
aislamiento y seleccin
de microorganismos
Publicado en septiembre 26, 2012

TCNICAS BSICAS PARA EL CULTIVO DE MICROORGANISMOS:


SIEMBRA Y ESTUDIO DE BACTERIAS
INTRODUCCIN
Para efectuar el estudio de los microorganismos, se han diseado diversos
mtodos que permiten cultivarlos bajocondicione artificiales, en los que es
posible cultivarlos bajo condiciones experimentales y manejar un solo tipo
demicroorganismo. Una de las tcnicas ms usadas en el laboratorio de
microbiologa consiste en transferir unamuestra microbiolgica de un
ambiente determinado a un medio de cultivo, lo que permite obtener
cultivosmicrobianos.
considerar

que

en

l
el

efectuar
rea

este

de

procedimiento,

trabajo,

existen

es

necesario

muchos

otros

microorganismos; debido a esto, es necesario tomar precauciones para


impedir que stos penetren ycontaminen los cultivos en estudio. Por otra
parte, para considerar no slo el aspecto nutricional, sino tambin
lascondiciones ambientales de su hbitat natural, por lo que en el medio de
cultivo se debe ajustar el pH yconcentracin de sales y durante la
incubacin

condiciones

tales

como

la

temperatura,

aireacin,

la

luminosidad. La aplicacin de estos procedimientos ha permitido propagar a

los microorganismos en cultivos mixtos, as comosu aislamiento y la


obtencin de cultivos puros, facilitando de este modo, el estudio,
caracterizacin, aplicacin y control de los mismos. La forma de sembrarlos
y cultivarlos depende del tipo de microorganismo y propsitoespecfico del
estudio.
Cultivar

un

microorganismo

significa

promover

intencionalmente

el

desarrollo de ste en medios de cultivo ycondiciones de laboratorio


controladas. La poblacin de microorganismos desarrollada en un medio se
denominacultivo.

Cuando

ste

contiene

una

sola

especie

de

microorganismo, se denomina cultivo puro o axnico, cuandocontiene ms


de una especie de microorganismos se denomina cultivo mixto.
.Un cultivo tipo contiene una especie conocida de microorganismos y es
conservada

en

el

laboratorio

para

realizar

diversos

ensayos

y estudios.Un cultivo axnico consiste en una sola especie microbiana,


proveniente de una sola clula. Los cultivos axnicosson muy raros en la
naturaleza. En los medios naturales -por ejemplo, en el suelo, agua, o en el
cuerpo humano-existen cultivos mixtos. En un cultivo mixto, viven muchas
y diferentes especies de forma conjunta.
Un cultivoaxnico se obtiene artificialmente en el laboratorio. A la hora de
obtener un cultivo axnico se han de tomar precauciones especiales, ya
que los microorganismos estn por todas partes, en la naturaleza, en el
laboratorio yen los instrumentos y recipientes usados en los experimentos.
Estos microorganismos no deseados ocontaminantes deben ser eliminados
de un cultivo para que ste pueda ser axnico. El segundo paso
paraobtener un cultivo axnico es inocular o introducir, una sola clula de
un microorganismo en un medio slido o liquido, esterilizado previamente.
De esta manera, aislamos un solo microorganismo del resto y se
podrmultiplicar en condiciones favorables. Un clon est constituido por
una poblacin de clulas descendientes de unsolo microorganismo. Una
colonia es un clon lo suficientemente grande como para ser visible sobre la
superficiede un medio slido.Un cultivo microbiano que ha estado creciendo
por cierto tiempo en el mismo tubo o matraz, debe ser transferidoa un
medio de cultivo nuevo, de otra manera el crecimiento y sobrevivencia no

pueden continuar. En estatransferencia se deben considerar dos aspectos


bsicos

referentes

a:

no

introducir

microorganismos

indeseables(contaminantes) y concentracin o carga microbiana de la


muestra (inculo) a sembrar.
Dispositivos

empleados

en

la

transferencia

de

muestras

microbianas:
Los utensilios utilizados para la transferencia de muestras son los
siguientes:
Hisopo, pipeta (para uso microbiolgico sonterminales y la parte superior o
boquilla debe estar protegida con filtro de algodn), pipeta pasteur, cable
de Kolle o portasa con alambre de platino dispuesto en forma de: aguja,
asa, esptula y/o gancho.
En la transferencia de microorganismos se emplean agujas, asas de
inoculacin, hisopos, pipetas o pipetaspasteur que debern esterilizarse
previamente. La utilizacin de estos dispositivos, as como de los diferentes
medios de cultivo tienen aplicaciones especficas. Por ejemplo:
Los medios lquidos se preparan en tubos o matraces que se cubren con
tapones de algodn o tapones especiales. Un cultivo lquido puede ser
transferido mediante un asa microbiolgica, un hisopo, pipeta o pipeta
pasteur; el inculo se deposita dentro del caldo o medio lquido. En este tipo
de cultivos los microorganismos presentan un desarrollo particular que se
manifiesta en la superficie o a travs de todo el lquido. Una de las ventajas
que presenta este tipo de cultivo se refiere a laposibilidad de agitarlos
acelerando la velocidad de microorganismos anaerobios, por otra parte, en
este tipo de cultivos, las poblaciones se encuentran suspendidas y e fcil
homogenizarlas, lo que permite estandarizar laconcentracin del inculo. La
desventaja que presentan, es que en ellos e difcil detectar contaminacin a
simple vista.
Los medios semislidos se preparan en tubos, se inoculan con aguja de
siembra (asa recta) o pipeta pasteur; en este ltimo caso es necesario
calentar el medio y cuando se encuentra en estado lquido y a una
temperatura

de

aproximadamente

42C

se

agrega

el

inculo,

se

homogeniza y se deja solidificar. Estos medios se emplean para estudiar la


movilidad de los microorganismos y para favorecer la separacin de
microorganismos con diferentes requerimientos de oxgeno.
Los medios slidos se preparan en tubos o matraces dependiendo de la
cantidad o de las necesidades, despusde esterilizarlos, estos se inclinan o
vierten en cajas de petri. La siembra se realiza con el asa, inoculando
lasuperficie

del

agar

con

mucha

suavidad;

en

estos

medios,

los

microorganismos al multiplicarse forman agregados que se hacen visibles a


simple vista; a estos agregados se les denominan colonias, las que
presentancaractersticas

que

varan

con

el

tipo

de

microorganismo

cultivado y el medio de cultivo empleado. En cualquier medio de cultivo es


de primordial importancia ajustar el pH, ya que an cuando la mayora de
losmicroorganismos crecen mejor en pH neutro, algunos requieren de pH
alcalino o cido, por lo que al proporcionar un pH adecuado se favorecer el
crecimiento del microorganismo de inters y la obtencin del cultivo. Con
este mismo propsito durante la incubacin se deben proporcionar las
condiciones adecuadas para el microorganismoen estudio. El crecimiento
ptimo de los microorganismos se presenta a temperaturas que la mayora
de las veces estn relacionadas con la de su hbitat natural. Algunos
microorganismos crecen por debajo de 15C, otros requieren temperaturas
ms elevadas (30 a 45C) y algunos hasta 80C. Para alcanzar y mantener
estas temperaturas se puede usar una incubadora microbiolgica o un bao
de agua a temperatura constante, en tanto que para lo microorganismos
que presentan su crecimientoptimo a temperaturas entre 20 y 25C se
pueden

incubar

en

temperaturaambiente.

la
En

gaveta

general

las

cajn

del

incubadoras

laboratorio,

microbiolgicas

satisfacen las necesidades en cuanto a los rangos de temperatura


requeridas por los microorganismos. La desventaja que tienen es que estos
aparatos funcionan con are seco, lo que determina la deshidratacin de los
medios de cultivo. Por lo tanto, el crecimiento de cualquier cultivo
experimental que se realice en incubadora no debe prolongare por ms de
nueve das.
Con relacin a las necesidades gaseosas, no todos los microorganismo
crecen en presencia de oxgeno atmosfrico; los que slo crecen en
presencia de are se llamanaerobios obligados; los que slo crecen en

ausencia de oxgeno sedenominananaerobios obligados o estrictos, un


tercer

grupo

se

adapta

las

dos

condiciones

se

le

conocecomo facultativos. Existe una cuarta categora que comprende


bacterias que requieren oxgeno, pero slo loutilizan cuando ste existe en
concentraciones reducidas; a estos se les llama microaeroflicos.
El desarrollo de estos diferentes grupos se favorece mediante la agitacin
de los cultivos o mediante la exclusin de oxgeno para lo que se emplean
sustancias reductoras o equipos especiales.Las bacterias son organismos
procariticos, se encuentran ampliamente distribuidas en la naturaleza,
habitan enel agua, el suelo, en la superficie o en el interior de plantas y
animales incluyendo al hombre. Pueden vivir en forma libre o en simbiosis
con

otros

organismos,

ya

sea

como

parsitos,

comensales

mutualistas.Fisiolgicamente este grupo presenta caractersticas muy


variables, hay bacterias mviles e inmvilesfotosintticas y quimiotrficas,
auttrofas y hetertrofas; se desarrollan en un rango muy amplio de
temperatura, pH y condiciones gaseosas. En el estudio de cultivos
bacterianos algunos de los criterios que se emplean para caracterizarlas
incluyen: tamao, morfologa celular, forma de agrupacin, reaccin a la
tincin de Gram, formacin de esporas, movilidad, presencia de inclusiones
de reserva y caractersticas culturales en medios lquidos y slidos en los
que presentan patrones de desarrollo en cuanto a la forma, tamao,
elevacin y color de las colonias.
Tcnicas de siembra
Mtodo de siembra por estra en placa
Es el mtodo ms fcil y el ms usado para obtener cultivos axnicos. Para
ello, con un asa de siembra se tomauna muestra de la poblacin mixta y a
continuacin

se

hacen

estras

sobre

la

superficie

de

un

medio

slidopreparado en una placa Petri (a las placas Petri tambin se les


denomina simplemente placas). Conforme se van haciendo estras en
zigzag con el asa, cada vez se van depositando en la superficie del medio
menosmicroorganismos. A continuacin, se flamea el asa, se toca en la
regin donde se han realizado las ltimasestras y se contina la siembra
con la misma tcnica, en la superficie de medio sin sembrar an. Repitiendo
esteproceso

varias

veces

se

logra

separar

clulas

individuales.

continuacin, las placas se incuban en un lugar adecuado, permitiendo que

las clulas aisladas experimenten un nmero suficiente de divisiones para


formar colonias visibles. Aunque cada colonia posiblemente representa un
clon derivado de una sola clula, no podemos asegurarlo. Quizs, dos
clulas quedaron depositadas tan juntas que han originado una nica
colonia mixta. Por tanto, para asegurarnos de que hemos obtenido un
cultivo axnico, conviene repetir el procedimiento a partir deuna colonia
bien aislada en la primera placa. Las colonias que se desarrollen la segunda
vez, sern, casi con todaseguridad, cultivos axnicos.
Mtodos de vertido en placa y extensin en placa
En estos mtodos, las suspensiones de clulas microbianas se diluyen
antes de su siembra en placa. Se siguenestas tcnicas cuando la muestra
contiene tantos microorganismos, que la dilucin no se puede realizar en
una sola etapa. Por ejemplo, una suspensin con mil millones de clulas por
mililitro debe ser diluida 10
veces paraobtener una suspensin con un centenar de clulas por mililitro,
Por tanto, se realizan diluciones seriadas (envarias etapas), normalmente
de diez en diez, pero a veces de cien en cien.
Para realizar diluciones de diez endiez, se aade 1 ml de la suspensin
bacteriana a 9 ml (de medio estril o solucin salina, igualmente estril. Se
agita vigorosamente para diluir las clulas y el proceso se repite cuantas
veces sea necesario. A continuacin, sepuede proceder de dos maneras
diferentes.
En el mtodo de vertido en placa, las muestras diluidas se mezclan con
agar fundido y se vierten en placa. Algunas colonias quedarn embebidas
en el agar y otras crecern en la superficie. Las colonias superficiales se
extendern y sern ms grandes.
En el segundo mtodo (extensin en placa), las muestras diluidas se
siembrandirectamente en la superficie de la placa de agar, extendindolas
con avuda de un asa de Diralsky de cristal estril. La suspensin se absorbe
en el agar, dejando las clulas microbianas sobre la superficie. En ambas
tcnicas las placas se incuban hasta la aparicin de las colonias. Como en el

mtodo de siembra por estra, no existe la seguridad de que las colonias


que aparecen en las placas sembradas por extensin o en el agar
solidificado sembrado por el mtodo del vertido en placas sean cultivos
axnicos hasta que se repita el proceso. Las dos tcnicas de siembra por
dilucin presentan la ventaja de que permiten obtener un mayor nmero
decolonias aisladas que el mtodo de siembra por estra, por tanto se
eligen cuando se ha de seleccionar una cepa a partir de una mezcla con
varios tipos de microorganismos. Para obtener un cultivo axnico mediante
este mtodo:
(a) Hacer diluciones seriadas de la suspensin bacteriana hasta obtener
una muestra con slo unos pocoscientos de bacterias(b) verter la muestra en un tubo con agar a sobrefusin, mezclar y verter el
contenido en una placa Petri.
(c) Despus de la incubacin, se desarrollan colonias en el agar (ms
pequeas) y en su superficie (ms grandes).
Mtodo de aislamiento por siembra por estra en placa: Para obtener un
cultivo axnico:
(a) esterilizar un asa de siembra por flameado en la llama de un mechero.
(b) introducirla en la suspensin bacteriana para recoger una muestra.
(c) sembrar haciendo estras sobre la superficie de un medio slido en una
placa Petri, y
(d) volver a esterilizar el asa, tocar en la zona de la placa ya sembrada y
hacer un segundo grupo de estras enuna regin nueva de la placa. Repetir
el proceso una tercera y una cuarta vez, hasta conseguir que los grupos de
clulas se diluyan y se separen clulas aisladas.
(e) Despus de la incubacin, se desarrollan colonias aisladas. Para estar
seguro de que el cultivo es puro, repetir el proceso entero; para ello tomar
una colonia aislada y sembrar por estras una segunda placa.

3.2.4 El crecimiento de los cultivos axnicos


Una vez que se obtiene un cultivo puro, normalmente se ha de propagar (se
le hace crecer de nuevo). Seguramente, el investigador desear obtener
ms clulas para poder trabajar con ellas. Para cultivar microorganismos en
el laboratorio, se ha de preparar un medio de cultivo, lquido o slido, con
todos los nutrientes necesarios para su crecimiento. Los medios slidos se
hacen generalmente, aadiendo agar a los lquidos (
LA IMPORTANCIA DE SER CULTIVO PURO
Todos los microbilogos saben que han de trabajar con cultivos axnicos
(puros) para que sus experimentos sean significativos. Pero incluso los
microbilogos ms experimentados han cometido errores alguna vez. Esto
le sucedi a Ralph Wolfe, uno de los microbilogos americanos ms
distinguidos.
En 1960 Wolfe obtuvo un cultivo puro de la bacteria Methanobacillus
omelianskii. Este microorganismo es anaerobio estricto, capaz de producir
metano

(gas

natural).

Wolfe

quera

conocer

de

qu

manera M.

omelianski produca gas metano a partir de etanol y anhdrido carbnico. El


procedimiento estaba claro; tena que lisar la bacteria y aislar las enzimas
que catalizan la reaccin, en un tubo de ensayo. Esto, aunque suena
bastante simple, haba sido intentado previamente por otros investigadores
y todos haban fracasado. Wolfe lo intent durante todo un ao y tampoco
tuvo xito. De repente lo consigui: una solucin de enzima. sintetizaba
metano en un tubo de ensayo! Se trataba de un descubrimiento
espectacular, hasta que un colega se pregunt si el cultivo era axnico.
Wolfe decidi volver a aislar el culfivo, pero en vez de aadir etanol
yanhdrido carbnico al mismo, aadi hidrgeno y anhdrido carbnico. En
el nuevo medio se desarrollaron colonias, pero cuando se transfirieron al
medio con etanol y anhdrido carbnico no crecieron. ¿Qu haba
sucedido? Un colega, M.J. Wolin, se dio cuenta de lo que estaba sucediendo.
Aunque M. omelianskii originaba colonias uniformes y aisladas en el medio
original, se trataba de una mezcla de dos bacterias. Una, designada cepa S,

converta el etanol en hidrgeno gas. La otra, designada cepa M, converta


el hidrgeno gas y el anhdrido carbnico en metano. Ninguna de las dos
poda crecer sola con etanol y anhdrido carbnico. Todos los experimentos
de Wolfe se haban realizado con un cultivo mixto y tuvieron que repetirse
para averiguar qu enzimas pertenecan a la cepa S y cules a la cepa M.
Qu leccin puede aprenderse de la historia de Wolfe? Primero, que los
problemas tcnicos (tales como obtener un cultivo axnico), aunque son tan
bsicos que se explican en los textos introductorios, son reales e
importunan a los ms prestigiosos investigadores. Segundo, que incluso un
buen microbilogo puede equivocarse. Algunas especies pueden crecer
juntas (para formar un consorcio) y parecer un cultivo axnico cuando
realmente no lo son.