Aislamiento del producto

Luego de la formación del producto de

interés procederemos a su aislamiento.

En este caso particular consideramos como

producto:

Proteína
CAROLINA VITA
 Aislamiento de una proteína
 Se requiere conocimiento de la proteína
– De que tipo de célula proviene
– De que parte de la célula
– Qué hace esa proteína
 Particularmente útil si se conoce :
– Tamaño
– Composición
 Aislamiento de una proteína
Selección de la fuente proteica

 Ej: de tejidos de animalales como pollos,

cerdos, vacas, ratas son los elegidos
Distribución de la proteina (mayor concentración)
 Ej: microorganismos
1. bacterias: E. coli
2. Levaduras: Saccharomyces cerevisiae
  Tecnicas de clonado molecular
 Métodos de solubilización

 Es el primer paso obligado de la purificación



la proteína debe estar en

solución
 Estabilizacón de la proteina
Existencia de agentes que provocan un daño
irreversible 
 pH
 T
 Proteasas
 Interfase agua–aire
 Adsorción a la pared de los recipientes
 Crecimiento de microorganismos  
 En el caso de proteína intracelular  muy
baja concentracion y acompanada de
millares de proteinas y otras
macromoleculas
 En el caso de proteínas extracelulares
pueden estar en baja concentración y
también acompañada o ser el principal
producto extracelular
 Estrategia
 Remover del organismo la proteína pura
en la menor cantidad de pasos con la
menor pérdida de actividad posible
 Objetivo
 Purificación de una proteína de interés
Para ello se cuenta con métodos de
purificación
 Los métodos se utilizan en etapas
 Serie de pasos independientes que utilizan
las caracteristicas fisicoquimicas de las
proteínas para separarlas de otras
proteínas o de otras sustancias
 Metodos de purificación
Basado en las siguientes propiedades proteicas:

 Tamaño
 Solubilidad
 Carga
 Adsorción
 Afinidad
Característica Procedimientos
 
Tamaño  Dialisis – ultrafiltración
 Electroforesis en gel
 Cromatografia de exclusión molecular
 Ultracentrifufacion
 

Solubidad  Precipitación con Sales

 “ Solventes organicos
 ‘’ por pH

Polaridad  Cromatografia de absorción

 C. En papel
 C. En fase reversa
 C. De interaccion hidrofóbica
Carga  Cromatografia de intercambio iónico
 Electroforesis
 Isoelectroenfoque

Selectividad  Cromatografia de afinidad

 
 Tamaño
Diálisis

Utiliza membrana semipermeable donde

 moleculas de agua y las de solutos
pequeños la atraviesen
 LAS PROTEÍNAS SON RETENIDAS
Diálisis
 Tamaño
Ultrafiltracion
Se utiliza una membrana semipermeable
que retiene las proteínas
La presión o fuerza centrífuga se usa para
separar por filtración el medio acuoso y
las moléculas de tamaño pequeño
• Uso de celofán o membranas
 Centrifugación
 Método separación y análisis
Centrifugation en gradiente de densidad
Gradientes continuos de sacarosa tubo
de centrifuga
Recuperación del materia:
Se perfora el tubo o bien se congela y se
corta en capas
 Centrifugación

Los componentes de la mezcla se separan

por:
 Peso
 Tamaño
 Densidad
 Forma
 Coeficiente de sedimentación
S= M (1-V)
Nf
M: peso molecular
V: Volumen espécifico
: densidad de la solución
N : numero de avogadro
F: coeficiente de fricción

Las proteínas migran de forma proporcional

a este coeficiente
 Solubilidad
 Muy utilizados en los primeros pasos de la
purificación
 Mantiene nativa a la proteina
 Redisolucion sin perdida de actividad
 Solubilidad
 Proteina composicion de aa  le otorga un
comportamiento diferente
La solubilidaad de la proteína depende:

 Interacción intraproteina
 Interaccíon proteína-proteína
 Interacción proteína- disolvente
 Solubilidad
Interacciones mencionadas dependen de:

 pH
 Fuerza iónica
 Disolvente
 Temperatura
 Solubilidad-pH
La carga neta de las proteína depende del
contenido de aa ácidos y de aa básicos
El valor del pH donde la carga neta de la
proteína es cero  pI (punto isoelectrico)

Solubilidad es mínina
Ej: contenido de aa ácidos pI bajo (4-5)
Solubilidad-pH
Solubilidad-Fuera iónica

 Salting in

 Salting out
 Salting in
 Solubilidad a baja fuerza ionica (0.001 – 0.02 M)
aumenta con la [ sales]  Salting in
Al aumentar la [sales]
proteina se rodea de contraiones
más soluble por > interacción proteína-solvente

Las proteínas en H2O tienden a formar

COMPLEJOS electrostáticos  precipitan
 Salting out

 La solubilidad a alta fuerza iónica (mayor a

0.02 M) disminuye con la [sales] 
Salting out
Sales capturan el H2O > interacción prot-prot

La alta [sal] remueve la esfera de

solvatación de la proteína
 Solubilidad-Disolventes
 Adición de disolventes neutros miscibles
en agua (ACETONA, ETANOL)
 Se usan en distintas proporciones
  Bajan el poder de solvatación de las
soluciones acuosas
 Solubilidad- Temperatura

 0-40 oC >T > solubilidad.

 40-50oC  inestabilidad
DESNATURALIZAN ( solubilidad)