Purificación de proteínas

Purificación de proteínas
Datos sobre la proteína

• Fuente de origen: natural o recombinante

• monómero u oligómero (mono- o hetero-)
• Peso molecular
• Punto isoeléctrico
• Hidrofobicidad
• Estabilidad a distintos pH y temperaturas
• Actividad
• Presencia de fusiones
 Cuantificación espectrofotométrica de proteínas
Método de Lowry - Reacción Química
Se basa en dos reacciones: 1) Biuret: en condiciones alcalinas, el cobre
reacciona con los enlaces peptídicos produciendo Cu+ el cual reacciona con el
reactivo de Folin; 2) Folin-Ciocalteau: el reactivo se reduce por la oxidación de
aminoácidos arómaticos (tirosina y triptofano) dando color azul. (max=745-750
nm).
 Cuantificación espectrofotométrica de proteínas
Método de Lowry - Reacción Química
Se basa en dos reacciones: 1) Biuret: en condiciones alcalinas, el cobre
reacciona con los enlaces peptídicos produciendo Cu+ el cual reacciona con el
reactivo de Folin; 2) Folin-Ciocalteau: el reactivo se reduce por la oxidación de
aminoácidos arómaticos (tirosina y triptofano) dando color azul. (max=745-750
nm).

Método de Bradford - Fijación no Covalente de Colorante

El colorante puede existir en diferentes formas iónicas en una solución ácida.
La forma aniónica (azul) del Coomassie Blue G250 (lmax=590 nm), se fija a las
proteínas por interacciones electrostáticas con los grupos catiónicos (arginina
y lisina). El mismo colorante tiene una forma catiónica roja (  max=470 nm) y
otra verde ( máx=650 nm).
abs

Curva de calibración Y = b + mX
yn

xn C
 Cuantificación espectrofotométrica de proteínas
Método de Lowry - Reacción Química
Se basa en dos reacciones: 1) Biuret: en condiciones alcalinas, el cobre
reacciona con los enlaces peptídicos produciendo Cu+ el cual reacciona con el
reactivo de Folin; 2) Folin-Ciocalteau: el reactivo se reduce por la oxidación de
aminoácidos arómaticos (tirosina y triptofano) dando color azul. (max=745-750
nm).

Método de Bradford - Fijación no Covalente de Colorante

El colorante puede existir en diferentes formas iónicas en una solución ácida.
La forma aniónica (azul) del Coomassie Blue G250 (lmax=590 nm), se fija a las
proteínas por interacciones electrostáticas con los grupos catiónicos (arginina
y lisina). El mismo colorante tiene una forma catiónica roja (  max=470 nm) y
otra verde ( máx=650 nm).
abs

Curva de calibración Y = a + bX
yn

xn C
Absorción de UV
La absorción de radiación en el UV cercano (280nm) depende del contenido
de triptofanos y tirosinas de las proteínas.

A=.d.C
Formula para calcular el 280 de proteína pura:

= 5690*W + 1280*Y (cm-1M-1)

Abs

280  (nm)
Contaminación con DNA Prot(mg/ml)= 1.55 x A280 - 0.76 x A260
 Extracción de la proteína de la fuente

1) Lisis osmótica: Uso de solución hipotónicas más

fuerzas mecánicas. Para bacterias y células vegetales:
lisozimas u otras enzimas.

2) Molienda: Morteros, batidoras y uso de sustancias

abrasivas

3) Ultrasonido: sonicador, eleva mucho la temperatura

de la muestra
 Métodos de extracción
Lisis celular. Válido para células sin pared celular como
las células de tejidos animales, pero no es suficiente para
células vegetales o bacterias.
Consiste en suspender las células en una solución
hipotónica (más diluida que el interior celular). Debido a la
diferencia osmótica el agua difunde al interior de la célula,
causando su hinchamiento y ruptura.
 Métodos de extracción
Destrucción mecánica. Entre estos métodos se
encuentran la homogenización (hacer pasar las células
entre un tubo y un pistón de vidrio que ajustan casi
totalmente); moler en un mortero con arena o alúmina;
molino con perlas de vidrio, la prensa de French (que hace
pasar las células a gran velocidad a través de un pequeño
orificio), la sonicación (someter las células a vibraciones de
ultrasonido).

Presión

Sonicación
Congelación-descongelación. las células se someten
a un cambio brusco de temperatura, congelando primero a
-196 ºC (con nitrógeno líquido) y pasándolas rápidamente a
temperatura ambiente (25 ºC).
Durante el proceso de ruptura, se utilizan tampones de
extracción para solubilizar las proteínas. Pueden utilizarse
como tales disoluciones acuosas de tampones específicos
para proteínas solubles o bien que contengan además
detergentes si se pretende purificar proteínas asociadas a
membranas, si bien en este caso hay que cuidar que la
enzima no se desnaturalice.
Los cristales rompen la integridad celular

Poco eficiente
 Métodos de purificación

Basado en las siguientes propiedades proteicas:

• Tamaño
• Solubilidad
• Carga
• Adsorción
• Afinidad
 Métodos de purificación
Característica Procedimiento
Tamaño  Centrifugación diferencial
 Electroforesis en gel
 Cromatografía de exclusión molecular
 Diálisis

Solubidad  Precipitación con Sales

 Precipitación con Solventes orgánicos
 Precipitación por pH y temperatura

Polaridad  Cromatografía de absorción

 Cromatografía en fase reversa
 Cromatografía de interacción hidrofóbica

Carga  Cromatografía de intercambio iónico

 Electroforésis
 Isoelectroenfoque

Selectividad  Cromatografía de afinidad

 Tamaño
Separación: centrifugación diferencial
500 xg 10, 000 xg 100, 000 xg
Centrifugación diferencial
Centrifugación diferencial
 Tamaño
Clasificación de procesos de membrana
Membranas
 Tamaño
Microfiltración
Baja presión para separar partículas de
alto peso molecular, coloides en
suspensión o bien sólidos disueltos.
 Ultrafiltracion
Para concentrar o purificar compuestos de medio
o alto peso molecular como las proteínas
lácteas, carbohidratos y enzimas
Ultrafiltracion
 Nanofiltración
Para concentrar o purificar compuestos de bajo
peso molecular como azúcares, minerales,
minerales disueltos
 Ósmosis inversa
Se aplica una presión osmótica, el agua fluirá en
sentido inverso; el agua fluye desde la columna
con elevado contenido de sólidos disueltos hacia
la columna con bajo contenido de sólidos disueltos:
Tratamiento de aguas residuales, concentrado de cítricos.
Diálisis
Tamaño
Diálisis
DIÁLISIS
 Solubilidad
Interacciones dependen de:

• pH
• Fuerza iónica
• Disolvente
• Temperatura
 Solubilidad-pH
La carga neta de las proteína depende del
contenido de aminoácidos ácidos y de
aminoácidos básicos
El valor del pH donde la carga neta de la
proteína es cero  pI (punto isoelectrico)

Solubilidad es mínina
Ej: contenido de aa ácidos pI bajo (4-5)
 Punto Isoeléctrico
• Las moléculas que tienen Puntos isoeléctricos de
cargas iguales se repelen algunas proteínas.
entre sí, y forman una
dispersión estable. Proteína PI

• La eliminación de la carga Pepsina 1.0

elimina la fuerza de Albúmina 4.7
atracción entre las
moléculas de proteína y Lactoglobulina 5.1
permite que interactúen Hemoglobina 6.7
entre sí y precipiten. Quimiotripsina 8.3
Ribonucleasa 9.5
• El punto isoeléctrico es
diferente para cada Citocromo C 10.7
proteína. Depende de la Lisozima 11.0
relación de grupos
Insulina 5.4
ionizables dentro de ésta.
(Vaclavik et al., 2014) (Peña-Díaz et al., 2004)
 Punto Isoeléctrico de algunas proteínas
Nombre PI Nombre PI
Insulina (bovina) 5.72 Catepsina colagenolitica humana 5.1
pip-db.org . Aston University; 2014 [cited 11th August 2016]. Available

Insulina cerdo 6.0 Hexoquinasa (levaduras) 4.7

Tropomiosina 5.6 DNA polimerasa (Mosca de la fruta) 5.8
Ribonucleasa (páncreas de cerdo) 8.7 Lipoproteína LDL fracción II humana 4.9
DNA desoxiribonucleasa (S. aureus) 2.5 Carnitina acetiltransferasa (comnejo) 6.1
Ribonucleasa alcalina (rana) 9.4 Carnitina acetiltransferasa humana 6.1
Lisozima (clara de huevo) >11 Insulina (bovino) 5.72
Lisozyma murimidasa 6.4 Insulina inmunoreactiva (perro) 4.8
Mioglobina (corazón de equino) 6.47 Elastasa humana 9
Mioglobina (Bos Taurus) 6.74 Elastasa lisosomal humana 11
Mioglobina pinguino 8.5 Adenosin aminohidrolasa humana 4.83
Hemoglobina A (humana) 6.95 Arilesterasa (cerdo) 5.8
Hemoglobina S 7.25 Adenosin deaminasa humana 4.83
Albúmina sérica (humana) 4.7 Quimiotripsinogeno A 9.2
Inmunoglobulina G (humana) 7.86 Tripsinógeno 8.7
from: http://www.pip-db.org

Glutamato deshidrogenasa humana 4.83 Queratina 7.5 - 8.5

Glutamato deshidrogenasa ( avena) 6.5 Quimiotripsina 8.76
Alfa Caseína (leche de caballo) 4.4-6.3 Quimotripsina (páncreas de bovino) 8.38
Beta caseina 4.4-5.9 Ribonucleasa 8.7
Kapa caseina 3.5-5.5 Ribulosa difosfato carboxilasa 5.5
Receptor de elastina 1 humana 4.4-4.7
Mioquinasa (rata) 7.5
Adenilato quinasa humana 9.5
Solubilidad-pH
 Temperatura de desnaturalización de algunas proteínas
PI Nombre Temperatura de desnaturalización (°C)
Tripsinogeno 56
Quimotripsinógeno 57
Elastasa 57
Pepsinógeno 60
9.6 Ribonucleasa 62 Temperatura
6.0 Carboxipeptidasa 63 donde la
6.1 Alcohol deshidrogenasa 64
4.8 Seroalbumina bovina 65 relación de
6.8 Hemoglobina 67 concentración
11 Lisozima 72 de los estados
5.4 Insulina 76
4.5 Ovoalbumina 76 nativa y
Inhibidor de tripsina 77 desnaturalizada
7 Mioglobina
α - Lactalbúmina
79
83
es 1
Citocromo C 83
β - Lactogloblina 83
Avidina 85
Glicina de soja 92
Proteina 11S de habas 94
Proteina 11S de girasol 95
Globulina de Avena 108
Referencia: FENNEMA, Owen R. Introducción a la ciencia de los alimentos (1982). Barcelona , España. Reverte. Página consultada 426
 Temperatura de Punto
Proteína desnaturalización isoeléctrico
Función

Incrementa la coagulación de la sangre, la

Fibronectina 65°C 5.39 cicatrización y la fagocitosis.

Tubulina 48°C 4.49 Conforman el citoesqueleto de las células

Componente mas abundante de la piel y los

Colágeno 40°C 4.7 huesos

α-
62°C 4.8 Favorece la síntesis de lactosa
Lactoalbumina

Albumina de Capacidad antioxidante y protege a las grasas de

64°C 4.78
suero bovino la oxidación

Permite a las células el aporte de glucosa para los

Insulina 70°C 5.22 procesos de síntesis con gasto de energía

regula el equilibrio de energía a través de sus

Leptina 98°C 5.88 acciones en el cerebro sobre el apetito y el gasto
energético

Ayuda en el desarrollo de partículas poliméricas

α-Zeina 90°C 6.2 de origen natural

β- Tiene la capacidad de interactuar con Retinol y

Lactoglobulina 70°C 5.2 ácidos grasos en rumiantes.
 Efecto de la T, [GuCl] y pH en la
desnaturalización de diferentes proteínas
Fracción
desdoblada

a) Ribonucleasa con pH de
3.5 en función de la T°

b) Lisozima en función de
[GuCl]

c) Nucleasa A en función del

pH

(Walstra,2003)
Desnaturalización de proteínas por
temperatura

Efecto del tratamiento

térmico sobre las
proteínas del
lactosuero, haciendo
uso del análisis
espectrofotométrico
en el rango UV.

Deyli Díaz Lezama, 2010

Desnaturalización de proteínas de arroz por
temperatura.

Z.Y. Ju, N.S. Hettiarachchy(2001)

Sales y proteínas
 Sales y su disociación
Sal: compuesto químico formado
mediante una reacción de
neutralización entre un ácido y una
base, con la formación de moléculas
de agua
(Fernández, 2008)

Disociación
La sal se separa en iones, los
cationes son atraídos al oxigeno
con carga parcial negativa y los
aniones atraídos a los
hidrógenos con carga parcial
positiva de las moléculas de
agua

(Brown, et al. 2013)

 EfectoInteraccio
de las sales en las proteínas
nes
electrostá
ticas
inespecífi
cas  Bajas concentraciones de sal
 Estabilizan estructura de proteínas

Afectan la estabilidad por dos

Interaccio
mecanismos nes ion
 Altas concentraciones de sal (>1M)
específico  Desnaturalización de proteínas
s
 Interacciones electrostáticas inespecíficas

Bajas [Sal] Iones interaccionan con

proteínas mediante
(<1M) interacciones electrostáticas

Neutralización de los grupos R

cargados por los iones de la sal

Aumento de la estabilidad de
la proteína

Incremento de
solubilidad

“SALTING IN”

(Walstra,2003)
 Interacciones ión específicas
La efectividad de las sales S
para modificar la estabilidad de las e
proteínas depende del tipo de sal y
generalmente sigue las f
series de Hofmeister Ina
crv
eo
mr • Moléculas de agua mayormente
ene atraídas por iones salinos
toc
e
[S
Perd n • Se pierden interacciones proteína-agua
A
idaL] • Aumentan interacciones proteína-
de i
solun
proteína
bilidt
ad e
r • Formación de agregados de proteínas
a “SALTING OUT”
c
c
i
o (Walstra,2003)
 Solubilidad-Fuera iónica

• Fuerza iónica = ½ S MiZi2

• Mi = Molaridad del ión
• Zi = Carga del ión
Na+ Cl-
• 1M NaCl = ½ S (1 X 12) + (1 X 12)= 1
Ca2+ Cl-
• 1M CaCl2 = ½ S (1 X 22) + (2 X 12) = 3
NH4+ SO42-
• 1M (NH4)2SO4 = ½ S (2 X 12) + (1 X 22) = 3
Solubilidad por sales
 Salting in

• Solubilidad a baja fuerza ionica (0.001 – 0.02 M)

aumenta con la [ sales]  Salting in
Al aumentar la [sales]
proteina se rodea de contraiones
más soluble por > interacción proteína-solvente

Las proteínas en H2O tienden a formar

COMPLEJOS electrostáticos  precipitan
 Salting out

• La solubilidad a alta fuerza iónica

(mayor a 0.02 M) disminuye con la
[sales]  Salting out
Sales capturan el H2O > interacción prot-prot

La alta [sal] remueve la esfera de

solvatación de la proteína
 “Salting Out”

Separo el
Solución sobrenadante
Original en un tubo
(Homogenado) nuevo y llevo a
cabo el análisis
que deseo.

Se precipita de forma selectiva a la proteína roja y

transfiero el sobrenadante a un nuevo tubo en el cual
aumento lo [Sal] para dejar en el sobrenadante la proteína
deseada.
Voet D., Voet J. G., & Pratt C. W; Fundamentals of Biochemistry; 1 st Ed; John Wiley & Sons, Inc; U.S.A; 1999; p. 99
 Precipitación diferencial por (NH4)2SO4
Solubilidad de las proteínas depende de la concentración de sales
Solubilidad

Sa
-in

Salting-out: es la precipitación de
ltin
ting

proteínas en presencia de exceso de sal

-ou
Sa l

(hay menos H2O disponible)

Conc. sal

Como las proteínas difieren mucho en

su solubilidad a alta sal, el salting-out
es muy útil en la purificación de una
proteína

Se elige la concentración de (NH4)2SO4

adecuada para precipitar todo y dejar
una proteína soluble, o al revés, ya que
no desnaturaliza las proteínas
 Efecto de la concentración de sales en la
solubilidad de proteínas
• “Salting-in” incrementa
la solubilidad a bajas
concentraciones de sal.
• A medida que la
concentración de sal
aumenta las proteínas
precipitan: “Salting-out”
• Solubilidad de
carboxihemoglobina en
presencia de (NH4)2SO4
se ve disminuida al
aumentar la
concentración de la sal

(a) Dependencia de la solubilidad en función de la concentración de

sal. (b) Solubilidad de carboxihemoglobina de caballo en presencia de
diferentes sales.

(Doung-Ly, et al., 2014)

Constante dieléctrica
Solventes orgánicos
 Polaridad y Constante Dieléctrica
Polaridad: Distribución de cargas en una molécula en función
de la electronegatividad de sus átomos.
Agua Etanol
Electronegatividad Electronegatividad
O=3.5 O=3.5
H=2.1 C=2.5
H=2.1

Constante dieléctrica (Ɛ): Es la medición cuantitativa de la

polaridad de un solvente.
Mayor polaridad Constante dieléctrica

Menor polaridad Constante dieléctrica (Lehninger, 2009)

Constantes dieléctricas de algunos solventes

Solventes Constante dieléctrica

Agua 78.5
Metanol 33.5
Etanol 24.3
Acetona 19.1
Isopropanol 18.0
n-propanol 20.1

(Tejeda, 2011)
 Influencia de la constante dieléctrica del solvente
en proteínas

Ley de Coulomb:
F: fuerza de atracción entre partículas
de la proteína
q: carga de partículas
ϵ: constante dieléctrica solvente
r: distancia entre partículas

Proteína en solución acuosa + Solvente Proteínas

orgánico agregadas

(Badui, 2006
Enzima gliceraldehído fosfato deshidrogenasa

Metanol Etanol 2-propanol

1-propanol 1-butanol 1-pentanol

(Scopes R. 1994)