Pontificia Universidad Catlica de Valparaso

Facultad de Ciencias
Instituto de Biologa

EXTRACCIN Y CUANTIFICACIN DE PROTENAS SOLUBLES

Los tejidos son ricos en protenas que cumplen diferentes funciones y por lo
tanto, con diferentes caractersticas , y segn stas es posible solubilizarlas, separarlas
y purificarlas mediante diversos mtodos.
El primer paso en la extraccin de la mayora de las protenas y estructuras
subcelulares es la rotura de los tejidos o de las clulas para obtener un lisado celular en
el que la protena, el complejo multiproteico o la estructura subcelular se encuentre en
condiciones que permitan su aislamiento. Esto se consigue empleando procedimientos
mecnicos suaves conocidos generalmente como homogenizacin. Estos mtodos
producen la rotura de las membranas celulares, suavemente, con lo que se libera el
contenido celular, dentro de los que se encuentran: shock osmtico, mortero (friccin) y
sonicacin.
Las protenas obtenidas deben ser solubilizadas en buffer para ayudar a
extraerlas de las clulas y adems mantenerlas para su posterior utilizacin.
El objetivo de
este prctico es realizar un protocolo para la homogenizacin
de tejido y
obtencin
de protenas totales, para su posterior cuantificacin y
caracterizacin
Objetivos
Establecer criterios para la elaboracin de un protocolo
Conocer la funcin de los componentes de los buffer
Aplicar los conocimientos de los componentes para la elaboracin de los buffer
Actividades
Realizacin de un protocolo para la homogenizacin de tejido y solubilizacin de
protenas
Preparacin de buffer a utilizar y determinar la funcin de sus componentes
Homogenizacin de tejido
Materiales:
Mortero de porcelana
Tubos Falcon 15 y 50 ml.
Tubos eppendorff.
Esptula.
Inhibidor de proteasas (PMSF)
Buffer Lisis (para 20 ml)
18 ml. de Tris HCl (20 mM)

Tris
Triton.
Vortex
Centrifuga

 2 ml. de NaCl (1 M)
10 l Tritn x-100
Cada un ml. de la preparacin anterior:
10 l de EDTA (0,5M).
50 l de PMSF (100 mM)
Procedimiento:
1)
2)
3)
4)
5)
6)
7)

Pese y prepare el buffer de lisis en la cantidad necesaria y molaridad indicada

Poner su muestra en un mortero y homogenizar
Mezclar con el buffer en un tubo falcn en una relacin 1:5
Homogenizar con vortex de forma horizontal
Centrifugar a 11000 rpm por 30 minutos
Rescatar sobrenadante.
Conservar a -20C

CUANTIFICACIN DE PROTENAS
MTODO DE BRADFORD
Se han descrito muchos mtodos diferentes para la determinacin cuantitativa
de protenas. Estos mtodos difieren entre s en cuanto a su sensibilidad, exactitud,
precisin, interferentes, estabilidad y sencillez. La seleccin del mtodo a utilizar se
realiza considerando las caractersticas de las muestras que se desean analizar, las
cuales pueden ser desde extractos crudos de tejidos animales o vegetales, fluidos
biolgicos de inters en bioqumica clnica (suero, plasma u orina), muestras obtenidas
desde la purificacin de protenas, fracciones cromatogrficas hasta muestras de una
protena pura. En general, los mtodos utilizados para la determinacin cuantitativa de
protenas consisten en la determinacin absorciomtrica directa o ensayos de tipo
colorimtrico, turbidimtrico o fluoromtrico
La mayora de las protenas presentan un mximo de absorbancia a 280 nm
aproximadamente, debido principalmente a la presencia de residuos de triptfano y
tirosina, y en mucha menor proporcin fenilalanina. Los residuos de histidina, cistena y
cistina, tambin presentan bandas de absorbancia en el ultravioleta cercano, pero se
encuentran a menores longitudes de onda y son de menor intensidad.
Mtodo de Bradford
Este mtodo utiliza la propiedad del colorante azul de Coomasie G-250 de
unirse a las protenas. El colorante libre presenta un mximo de absorcin a 465 nm
mientras que cuando est unido a protenas ste se encuentra a 595 nm. El ensayo
estndar posee una sensibilidad desde 0,1 a 1,4 mg/ml. Esta unin se debe a la
estabilizacin de la forma aninica del colorante mediante interacciones hidrofbicas e
inicas, causando un cambio visible de color.
Interferencias: Detergentes y lcalis reducen el color. Se recomienda medir en
el tiempo asignado, debido a que el color no es estable en el tiempo, ya que la protena y
el complejo colorante-protena comienza a precipitar debido al medio cido. Este efecto
es especialmente significativo a las concentraciones de protenas mayores. Por otra

parte, el complejo protena colorante tiende a unirse a las cubetas tindolas, por lo cual
se recomienda un lavado final con etanol.
Este ensayo requiere adems la realizacin de una curva de calibracin para la
determinacin de la concentracin de protenas de una muestra, utilizndose
comnmente BSA como protena patrn.
OBJETIVOS

Realizar una curva de calibrado utilizando BSA como protena patrn.

Calcular la concentracin de protenas de una muestra problema mediante el
mtodo de Bradford.
Determinar la concentracin de protena total en una muestra considerando los
factores de dilucin.

ACTIVIDAD PRCTICA
Construccin de la curva de calibrado con BSA
Se preparan 100 l de cada dilucin de acuerdo a la siguiente tabla.
El stock de BSA utilizado est a 1 g/l.
Tub
o
6
5
4
3
2
1

BSA
l
25
30
35
40
45
50

H2O
l
75
70
65
60
55
50

----

100

Concentracin BSA
g/ l
0.25
0.30
0.35
0.40
0.45
0.50
0
(Blanco)

Se transfieren las soluciones a cubetas espectrofotomtricas.

Se agregan 1000 l de reactivo de Bradford a cada cubeta.
Se sellan las cubetas con parafilm, se homogeniza la solucin y se deja reaccionar por 3
minutos.
Se mide la absorbancia de cada cubeta a 595 nm. En un espectofotmetro.
Se construye una regresin lineal graficando Absorbancia v/s Concentracin de
BSA.
Determinacin de la concentracin de protena total en la muestra:
Se pueden realizar diluciones de la muestra problema (Extracto proteico)
Tub
o
1
2
3
4

Extracto
proteico
100
75
50
25

H2O
l
0
25
50
75

5
6

10
0

90
100

Se agregan 1000 l de reactivo de Bradford.

Se sellan las cubetas con parafilm, se homogeniza la solucin y se deja reaccionar por 3
minutos.
Se mide la absorbancia de cada cubeta a 595 nm.
Se calcula la concentracin total de protena, interpolando la absorbancia de la muestra
en la curva estndar.
Donde:

y= absorbancia
x= concentracin de protena.

y = mx + n

Complete la siguiente tabla:

Tub
o

Muestra
Problem
a l

H2O
l

1
2
3
4
5
6

100
75
50
25
10
0

0
25
50
75
90
100

Reactiv
o de
Bradfor
d l
1000
1000
1000
1000
1000
1000

Absorbanci
a

Concentraci
n

Factor
de
diluci
n

Concentraci
n de
protenas
real.

Preparacin del Reactivo de Bradford

50 mg de Azul de Comassie G 250 se disuelven en 25 ml de etanol al 95%
Se agrega 50 ml de cido orto-fosfrico al 85%
Se lleva la solucin a un matraz de aforo de 500 ml y se afora con agua destilada.
Se filtra la solucin a travs del papel filtro Whatman N1
REFERENCIAS
H. Lodish, A. Berk, L. Zipursky, P. Matsudaira, D. Baltimore , J. Darnerll, 2002.
Biologa Celular y Molecular. Editorial Mdica Panamericana. Madrid-Espaa.
B. Albert, D. Bray, J. Lewis, 2000. Biologa Molecular de la Clula. Ediciones Omega
S.A., Barcelona.
Farmacologa Molecular: Receptores, transduccin de seales y activacin de
genes, 2000. Marcelo Kazanietz. Ed. Universidad Nacional de Quilmes Argentina.
J. Kurjan y B. Taylor, 1993. Signal Transduction. Academic Press Inc. N.Y.
Abbas Abul K., A. H. Lichtman & Pober J. Inmunologa Celular y Molecular. 4
Edicin, 2002. Ed. McGraw-Hill-Interamericana, Madrid, Espaa