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Inmovilización biocatalitica

 Inmovilización es el proceso de adherir un


biocatalizador (enzimas aisladas o células
enteras) a un soporte solido. Cual puede ser
orgánico o inorgánico, tales como derivados de
celulosa, materiales cerámicos, oxidos
metalicos,etc.
Principales ventajas de los
sistemas de biocatalizadores
inmóviles
 Una separación más fácil de los
biocatalizadores del producto.
 Una mayor estabilidad de los
biocatalizadores.
 Configuraciones de reactor más flexibles.
 No hay necesidad de remplazar
continuamente el biocatalizador.
Técnicas de inmovilización
 Adsorción
 Aprisionamiento, Unión Cruzada
 Formación de enlace covalente
Inmovilización

 Células o enzimas físicamente confinadas en


cierta región definida en el espacio,
reteniendo sus propiedades y actividades
catalíticas.
 Combina la actividad elevada y especifica de
las biomoleculas, con estabilidad química y
mecánica del soporte.
Ventajas y desventajas

 Uso continuo  Actividad afectada por


 Reutilización proceso inmovilización
 Control de  Velocidad de reacción
concentración limitada por velocidad
 Protección
difusión
 Heterogeneidad en el
sistema
 Biocatalizador es mas
caro que enzima nativa
Inmovilización Irreversible

 Implica el enlace del biocatalizador a un


soporte de manera permanente.

 Enlace covalente
 Enlace cruzado
 Atrapamiento
Formación de enlaces
covalentes
 Se emplean cuando se requiere estrictamente
la ausencia de enzimas en el producto.
 Primero se necesita activar el soporte.
 Segundo se enlaza covalentemente la enzima
con el soporte.
 Tercero se cuantifica la concentración de
proteína libre y de proteína unida.
Formación de enlaces
cruzados
 No es necesario el uso de soporte, el enlace
se da entre enzimas.
 Primero se debe tener preparada la enzima
en solución.
 Segundo se añade un agente de bajo peso
molecular.
 Tercero se forman enlaces covalentes entre
los grupos funcionales que forman
agregados.
Atrapamiento

 Oclusión de enzimas dentro de red


polimérica, que permite paso de sustrato y
productos.
 Puede ser por atrapamiento en gel, por fibras
o por microencapsulado.
 Se utiliza poco debido al limite de
transferencia de masa.
Inmovilización Reversible

 Enzimas puedes ser desprendidas del soporte


bajo condiciones no extremas.

 Por adsorción
 Adsorción no especifica
 Adsorción hidrofobica
 Quelación
 Enlaces disulfuro
Por adsorción

 Emplea soportes con adsorbente activo, que


retienen enzimas por interacciones iónicas o
fuerzas débiles.
 Primero se pone en contacto la enzima en
solución acuosa con el soporte adsorbente.
 Segundo se lava el soporte y elimina enzima
no inmovilizada.
Adsorción no especifica

 Método mas simple, basado en enlace iónico


e interacciones débiles.
 Puentes de hidrogeno, fuerzas de var der
Waals, interacciones hidrofobicas; enlaces
iónicos con sales.
Adsorción hidrofobica

 Se manipulan las variables pH, concentración


de sales y temperatura.
 La resistencia de las interacciones radica en la
hidrofobicidad .
Quelación o enlace metálico

 Se utilizan principalmente sales de titanio y


circonio.
 Sales metálicas o hidróxido son precipitados
en el soporte por calentamiento o
neutralización.
 El soporte es regenerado lavándolo con un
fuerte quelante (EDTA).
Formación de enlaces
disulfuro
 Los enlaces químicos y la interacción entre
enzima y soporte son complejos.
 La estabilidad depende de interacciones
electroestáticas, interacciones estéricas,
cambios en el estado de hidratación y
reacomodos en la estructura de la proteína.
Sistemas de células
inmovilizadas
 Ventajas
 Provee una mayor concentración de células
 Provee un reuso de células y la eliminación de los costos de
procesos de recuperación de células y reciclo de células.
 Elimina el problema de lavado para grandes factores de
dilución.
 La combinación de altas concentraciones de células y altas
velocidades de flujo permite productividades altas
 La inmovilización provee unas condiciones ambientales
favorables para las células, y esto se traduce en una mayor
perfomance del biocatalizador (rendimientos de productos
más altos, y velocidades mas altas).
 Para algunas células, es importante protegerlas de grandes
esfuerzos de corte.
Sistemas de células
inmovilizadas
 Desventajas
 El producto de interés debe ser excretado por las
células.
 Los procesos difusionales toman una gran
importancia.
 El control de las condiciones ambientales es
complicado debido a la heterogeneidad del
sistema.
Inmovilización activa de
células
 Atrapamiento físico con matrices porosas.
 Encapsulación.
 Adsorción de las células en la superficie de
soportes inertes.
 Unión covalente.
 Cross-linking
Inmovilización pasiva de
células
 Biofilm:
Elección del método de
inmovilización
LIMITACIONES DIFUSIONALES EN
SISTEMAS DE ENZIMAS INMOVILIZADAS

Sb=concentración del sustrato en el bulk (g/cm3)


Kl= coeficiente de transferencia de masa del lado del líquido en
(cm/s).
Resumen:
Limita la velocidad de difusión

Limita la reacción química

COMPARABLES
EFECTOS DIFUSIONALES EN LAS ENZIMAS UNIDAS A LA
SUPERFICIE DE MATERIALES DE SOPORTE NO POROSOS

velocidad de reacción = velocidad de


transferencia de masa
Ss no se puede medir experimentalmente

Para enzimas inmovilizadas en un catalizador no poroso. La curva A resulta


del conocimiento de los parámetros cinéticos intrínsecos y la carga de la
superficie de la enzima. La curva B es la ecuación de transferencia de masa.
La intersección de estas dos líneas es la velocidad de reacción.
Cuando controla la reacción química

Pseudoprimer
órden

Cuando el sistema está controlado por la


reacción
Asumiendo que:

• Cinética de Michaelis- Menten


• Soporte inerte

Luego, aplicando condiciones de contorno


S= Ss para cuando r=R
dS/dr=0 cuando r=0
S=1 y r=1
dS/dr=0 cuando r=0

vel. reacción qca


Vel. difusión

En el estado estacionario:
 Factor de efectividad

velocidad de reacción con limitaciones difusionales


velocidad de reacción sin limitaciones difusionales
Para una velocidad de reacción de órden cero

Para un gran rango del valor del modulo de


thiele

Para una reacción de orden uno

Variables más importantes son Vm y R ya que la concentración del


sustrato, Km y De están ya fijadas
CÉLULAS INMOVILIZADAS

Films biológicos

crecimiento de multicapas de células en la superficie


de un soporte sólido
LIMITACIONES DIFUSIONALES EN UN SISTEMA DE
CELULAS INMOVILIZADAS:

r max= velocidad máxima de bioconversión (mg de Sustrato /h)


De= difusividad efectiva

es el espesor de la película

So= Concentración inicial del sustrato en el


bulk
Es deseable mantener el Da<1 para
eliminar la eliminaciones
difusionales cuando la productividad
de la población de células no mejora
con otros métodos.
V crecimiento film <<<< V consumo de sustrato
S e asume estado estacionario
la máxima velocidad de flujo del sustrato en
ausencia de limitaciones difusionales esta dada
por la siguiente ecuación:

As= área superficial del biofilm disponible para el flujo de sustrato


Ns= flujo de sustrato
L = espesor del biofilm
Ω= Módulo de Thiele modificado
Formación de pellets

La ecuación adimensional de transporte


de sustrato
condiciones de contorno

Solución
Bioreactores de células y enzimas inmovilizadas

Operación Batch Reactor de flujo pistón

Operación Continua
Se considera un balance de masa del sustrato
limitante referido a un elemento diferencial

-F dSo = Ns a A dz

Ns= - De( dS/ dy) ]y=L = η( rm So/ Ks+ So)


L

Ks ln (Soi/so)+ (Soi-So)= η rm L a AH/F

ln (Soi/so)= η rm L a AH/F Ks
Reactores enzimáticos que
emplean enzimas inmovilizadas
APLICACIONES DE ENZIMAS
INMOVILIZADAS
 Aplicaciones analíticas: biosensores
 Aplicaciones medicas: tratamientos con
enzimas inmovilizadas
 Aplicaciones industriales: industria qca,
farmaceutica, alimentaria y de tratamiento
de residuos
Biosensores
 Usados en medicina,
control de calidad de
alimentos, control
medioambiental.

 Ventajas
 Instrumentación barata
y sencilla
 Análisis muy sensible
 Permite el uso de
muestras con color o
turbias que no se
podrían medir con
métodos
espectroscópicos
Aplicaciones de Biosensores
 Diagnostico clínico: Se pueden detectar
niveles séricos de glucosa, lactato y ac
úrico mediante electrodos enzimáticos
disponibles comercialmente.
Actualmente, se busca detección de
fármacos, células y virus patógenos
 Control de calidad: pueden determinar el
grado de contaminación microbiana,
medir el azúcar presente en bebidas, etc
 Control de la polución: Analizadores de
contaminadores de agua, detectan la
presencia de residuos tóxicos, pesticidas,
herbicidas o microorganismos
Aplicaciones medicas
 Existen muchas
enfermedades
causadas por una
alteración o carencia
de una determinada
enzima. El
tratamiento con estas
enzimas inmovilizadas
permitiría una acción
más prolongada.
Aplicaciones Industria

 Industria Farmacéutica
 Obtención de antibióticos ß-lactámicos.
 Industria Alimentaria
 Hidrolisis de proteínas
 Hidrolisis de hidratos de carbono
 Mejora de características organolepticas
 Obtencion de edulcorantes y aditivos
 Otras
Lactasa (β-galactosidasa)
Permite la conversión de la lactosa en sus monosacaridos
componentes glucosa y galactosa.

La eliminación de este azúcar en la leche se puede conseguir


tratandola con ß-galactosidasa de levaduras inmovilizada en fibras
de acetato de celulosa
Tratamiento de aguas
residuales
 Método para la reducción de nitratos a nitritos
en aguas residuales empleando enzimas
inmovilizadas
 El benceno es otro compuesto muy tóxico que
puede ser degradado mediante células de
Pseudomonas putidaatrapadas en geles de
poliacrilamida.