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Purificacin de Protenas

Dado que una clula contiene miles de


protenas distintas, la tarea de separarlas y
determinar su estructura es en extremo
difcil.
Hay muchas tcnicas para purificar y
caracterizar protenas que van desde
estrategias para determinar caractersticas
fsicas hasta descubrir el nmero y el tipo
de aminocidos constituyentes y
determinar su secuencia completa.
Una protena se puede identificar por
cromatografa segn su carga y polaridad.
La cadena entera se puede degradar por
escisin especfica con enzimas para
obtener fragmentos de pptidos
relacionados.
Luego cada pptido se puede degradar
aminocido por aminocido para descubrir
su secuencia.
En el paso final de la determinacin de
la estructura, la protena intacta se
somete a un anlisis por difraccin por
rayos X para determinar su
conformacin tridimensional.

Sin embargo, antes es necesario


purificar la protena empleando tcnicas
como cromatografa de columna y
electroforesis, y luego cristalizacin.
Aislamiento de
Protenas de
clulas.
Antes de purificar, es preciso extraer las
protenas de las clulas y organelos
subcelulares.
Al primer paso se le denomina
homogeneizacin e implica la ruptura de
las clulas.
Una vez homogeneizadas las clulas, se
somete a centrifugacin diferencial.
Despus de solubilizada la protena se
somete a un primer paso de purificacin
basado en la solubilidad.
PURIFICACION DE
PROTEINAS
Se aplican muchas tcnicas para eliminar
contaminantes y lograr una muestra pura de
la protena de inters.

Al seguirse los pasos de purificacin, se


elabora una tabla de recuperacin y pureza
de la protena para juzgar el xito de cada
etapa.
Purificacin por salting-out.
Uno de los primeros pasos para iniciar el
fraccionamiento proteico consiste en agregar una
sal inica a la mezcla en cuestin (salting out).
Se puede comenzar adicionando cantidades cada
vez mayores de la sal y separando
cuidadosamente las protenas que vayan
precipitando, de forma que se obtendrn protenas
relativamente puras (ver la siguiente figura).
Purificacin por pH
El valor de pH en el cual una protena tiene su
mnima solubilidad se llama punto isoelctrico, y
es muy til cuando se pretende purificar protenas
provenientes de una mezcla.
Lo que se hace es preparar varias soluciones de
pHs diferentes y colocar en ellos la mezcla de
protenas para que aquella cuyo pI sea el mismo
que el pH del amortiguador, precipite all.
Tabla de purificacin de protenas
Los primeros pasos de En la tabla siguiente hay que
purificacin de una observar que tanto el
protena que se volumen como la cantidad
encuentre formando total de protena disminuyen
parte de una mezcla (por qu?) mientras que la
comienzan casi siempre actividad especfica (en el
con salting-out, pues caso de las enzimas) se
esta tcnica cumple muy incrementa (por qu?).
bien su objetivo, que es Para calcular la actividad
el de preparar el especfica hay que hacer la
homogeneizado crudo siguiente operacin:
para los procedimientos
ms eficaces y finos que
siguen. Actividad = Actividad total
Especfica total de protena
TABLA .1 Ejemplo de esquema para purificacin de protenas:
Purificacin de la enzima xantina deshidrogenasa de un hongo.

Fraccin Volumen Total de Actividad Actividad Porcentaje de


(ml) protena total. especfica recuperacin.
(mg)

Extracto crudo 3800 22 800 2 460 0.108 100

Precipitado salino 165 2 800 1 190 0.425 48

Cromatografa por 65 100 720 7.2 29


intercambio inico

Cromatografa por 40 14.5 555 38.3 23


criba molecular

Cromatografa por 6 1.8 275 152.108 11


inmunoafinidad
El porcentaje de recuperacin indica cunto
de la protena de inters se ha conservado
en cada paso. Esta cifra suele ir bajando
durante la purificacin.

El grado de purificacin compara la pureza


de la protena en cada paso y este valor
debe ir en ascenso si la purificacin tiene
xito.
CROMATOGRAFIA EN PAPEL
CROMATOGRAFA
BIDIMENSIONAL
Croma = color
Grafein = escribir
Esta tcnica se comienza a utilizar en
el siglo XX para separar pigmentos
vegetales cuyos colores se
distinguan con facilidad
Se basa en la distribucin de
compuestos en distinto grado entre
diferentes fases (fase mvil y fase
estacionaria)
CROMATOGRAFIA DE
COLUMNA
Se emplea para la separacin de mezclas o
purificacin de sustancias a escala
preparativa.
Como fase estacionaria se usa,
generalmente, gel de slice o almina
dentro de la columna.
La eleccin del disolvente es crucial para
una buena separacin.
Se introduce la muestra por la parte
superior de la columna y se eluye con el
disolvente elegido, recogindose por lo
general en tubos de ensayo
La columna se prepara mezclando el
soporte con disolvente y se rellena la
columna poniendo en el fondo de sta un
poco de algodn, para evitar que la slica o
la almina se salgan de la columna.
CROMATOGRAFIA DE
COLUMNA
Tipos de cromatografa de
columna

Cromatografa de afinidad
Cromatografa de exclusin molecular
Cromatografa de intercambio inico
Cromatografa de afinidad
La cromatografa de afinidad permite la
separacin de mezclas proteicas por su afinidad o
capacidad de unin a un determinado ligando.
Las protenas que se retienen en la columna son
aquellas que se unen covalentemente a la matriz
de la columna.
La protena de inters que ha quedado retenida en
la columna se eluye (se libera) mediante el
empleo de una solucin que rompa la interaccin
entre el ligando y la protena.
Cromatografa de exclusin
molecular o cromatografa en gel
Separa a las protenas en funcin de su tamao.
La matriz de la columna esta formada por un
polmero entrecruzado con poros de tamaos
determinados.
Las protenas de mayor tamao migran a lo largo
de la columna ms deprisa que las de pequeo
tamao.
Las protenas de menor tamao, entran en los
poros y su marcha a lo largo de la columna se
hace ms lenta.
Filtracin en Gel
En este tipo de Los resultados obtenidos
cromatografa se coloca se ilustran en la siguiente
la muestra dentro de la figura, en la cual se
columna empacada con observa que, mientras
perlas de agarosa. ms grande sea la
Las protenas grandes protena, ms rpido
pasan de largo, mientras saldr de la columna
que las pequeas entran (cuidado al interpretar el
en los pequeos poros de eje vertical o de las
las perlas y se quedan all ordenadas, pues se refiere
un rato, eluyendo despus a Ve/Vo)
de las grandes.
Dilisis
Las protenas se pueden separar en base a
su tamao y solubilidad a ciertos pHs,
pero cuando estos ltimos, como pIs, son
muy cercanos, se hace necesaria otra
tcnica que sea capaz de separar a las
protenas en base a su tamao, y esta es la
dilisis.
Electroforesis.
Se basa en el movimiento de partculas
cargadas en un campo elctrico, hacia un
electrodo con carga opuesta.

La movilidad de estas macromolculas


depende de su carga, forma y tamao.
Medios de soporte para Electroforesis.
El soporte ms comn es un polmero de
agarosa o acrilamida, similar a los
empleados en la cromatografa de columna.

No obstante, pueden emplearse medios de


soporte como papel y lquidos.
Forma en la que se lleva a cabo la
Electroforesis.
1. Se aplica una muestra con carga elctrica en el
medio de soporte, que puede ser papel o gel.
2. Se hace pasar una corriente elctrica por el
medio, a un voltaje controlado, para lograr la
separacin deseada.
3. Cada banda que se observa en el gel es una
protena distinta.
4. Una vez que las protenas se han separado en el
gel (agarosa), ste se tie para revelar la
ubicacin de las protenas.
En una variacin de la electroforesis en gel
de poliacrilamida, la muestra de protenas
se trata con el detergente dodecil sulfato de
sodio (SDS), cuya estructura es
CH3 (CH2)10 CH2OSO3Na, antes de
aplicarse en el gel.
El SDS, desnaturaliza por completo a las
protenas , rompiendo todas las
interacciones no covalentes que determinan
su estructura terciaria y cuaternaria.
Ventajas de la electroforesis en gel
de SDS- poliacrilamida (SDS-
PAGE)
La acrilamida ofrece ms resistencia a las
molculas grandes que a las pequeas.
Las protenas pequeas avanzan con ms
rapidez que las grandes.
Este tipo de electroforesis puede servir
para estimar el peso molecular de las
protenas comparando las muestra con
muestras estndar.
Para casi todas las protenas , el
logaritmo del peso molecular tiene una
relacin lineal con su movilidad en SDS-
PAGE.
El enfoque isoelctrico o
isoelectroenfoque
Este es otra variacin de la electroforesis
en gel.
Dado que las distintas protenas tienen
diferentes grupos titulables, tambin tienen
distinto punto isoelctrico.
En un experimento de enfoque isoelctrico,
se prepara el gel con un gradiente de pH.
Conforme las protenas migran a travs
del gel bajo la influencia del campo
elctrico, encuentran regiones de distinto
pH que hacen que cambie la carga de la
protena.
Despus cada protena llega a un punto
en el que no tiene carga neta (su punto
isoelctrico) y deja de avanzar.
Centrifugacin en gradiente de
concentracin
CRISTALOGRAFA POR
RAYOS X.
Conocimiento de la estructura y funcin de
las protenas.

Puede revelar la posicin tridimensional


exacta de la mayor parte de los tomos de
una molcula proteica.
Aspectos bsicos
Se requieren cristales puros de la protena
que interesa estudiar, obtenidos
generalmente por aadir sulfato de amonio
u otra sal concentrada a la disolucin
proteica para disminuir su solubilidad. Una
adicin lenta de sal favorece la formacin
de cristales ordenados en vez de
precipitados amorfos.
Figura: un cristal de protena.
Anlisis con rayos X.
Hay tres componentes requeridos en un
experimento cristalogrfico por rayos X :
La fuente de rayos X .
Un cristal de protena.
Un detector .
Al acelerar los electrones contra una pieza de
cobre, se produce un haz de rayos X de
longitud de onda de 1.54 A.
Un haz estrecho de rayos X se hace incidir en
el cristal proteico. Parte de este haz atraviesa el
cristal sin ningn cambio de direccin. El resto
se dispersa en una serie de direcciones
diferentes.
Los haces dispersos (o difractados) pueden ser
detectados mediante pelcula fotogrfica, de
manera que el ennegrecimiento de la emulsin
es proporcional a la intensidad del haz de rayos
X dispersado.
El cristal de la protena se monta en un
capilar y se sita en una orientacin
precisa con respecto al haz de rayos X y
a la pelcula sensible.
Un movimiento de precesin del cristal
suministra una fotografa de rayos X en
la que existe una disposicin regular de
manchas.
Se miden las intensidades de cada una de las
manchas y estos son los datos experimentales
bsicos de un anlisis cristalogrfico de rayos
X.
El paso siguiente consiste en reconstruir la
imagen de la protena a partir de las
intensidades de las manchas.
Los puntos ms prximos a la periferia de la
fotografa contienen informacin de los lados
de las molculas ms prximos en el espacio
dentro del cristal.
La resolucin obtenida mediante difraccin de
rayos X depende del nmero de puntos
analizados.
Patrn de difraccin de rayos X