BIOTECNOLOGÍA Y BIOPROCESOS

SIMON PEÑA YESSICA LESLY

PURIFICACIÓN DE ENZIMAS
16 abr. 20
Los métodos de purificación de enzimas dependen de la fuente biológica y de la
concentración de la enzima.
Un primer paso consiste en la separación de los distintos componentes
intracelulares, generalmente por centrifugación. Los procesos de purificación
utilizan las técnicas clásicas de fraccionamiento proteico y pueden basarse en el
movimiento de sustancias en una fase liquida o en la transición de sustancias de
una fase a otra.
Esquema general de un método de purificación
1. Separación de las células
2. Si la proteína es intracelular, ruptura celular y separación de restos
3. Concentración
4. Aislamiento primario
5. Parificación de alta resolución
6. Pulido del producto final
Purificación por el tamaño de masa
 Centrifugación: se utiliza en moléculas grandes y pequeñas, remueve los
restos celulares después de la homogenización.
 Filtración en gel: se utiliza en moléculas pequeñas, depende del tamaño
molecular. El gel debe ser químicamente inerte, debe de tener un número
pequeño de grupos iónicos y una alta rigidez mecánica.
 Ultrafiltración: las moléculas e iones pasan por la membrana de diálisis
bajao la influencia de presión.
Purificación por cargas
 Cromatografía de intercambio iónico: moléculas grandes y pequeñas, es un
intercambio reversible de iones en solución con iones enlazados a un medio
de soporte inerte.
 Electroforesis: moléculas pequeñas, migración de moléculas cargadas en
un medio. La movilidad electroforética se afecta por:
 Carga: a mayor carga, mayo será mayor la movilidad.
 Tamaño: las partículas grandes se mueven más lentamente que las
pequeñas.
 Forma: los contornos redondos generan menor retardo friccional.
 Electroforesis de zona: las moléculas son inmovilizadas mediante fijación
en diferentes zonas.
  Enfoque isoeléctrico: tiene un alto poder de resolución, se realiza por tres
vías, gradiente de velocidad, geles y electroenfoque de convección en
zona.
Purificación por el cambio de solubilidad
 Cambio de pH: se usa para precipitar la enzima
 Cambio en fuerza iónica: a altas concentraciones de sal, la concentración
de agua se reduce.
 Disminución en la constante dieléctrica: al añadir solventes solubles en
agua disminuirá la constante dieléctrica e incrementará las fuerzas
electroestáticas.
Otros métodos:
 Cromatografía de afinidad: enlazamiento especifico no covalente de las
enzimas con las moléculas.
 Precipitación fraccional: útil en la primera etapa de la purificación.
 Cromatografía hidrofóbica
 Cromatografía en hidroxiapatita
 Precipitación por aumento de la fuerza iónica
 Precipitación por disminución de la fuerza iónica
 Precipitación por la alteración del pH
 Precipitación por solventes orgánicos