PURIFICACIÓN

DE ENZIMAS
 ¿Por qué necesitamos purificar enzimas?

• Para identificar la estructura y función de

la proteína o enzima de interés.
• Para estudiar su regulación y sus
interacciones proteína-proteína o proteína-
enzima.
• Para producir anticuerpos.
• Purificamos enzimas para ser utilizadas
en ensayos.
• Para realizar análisis estructural por
cristalografía de rayos X
 Es importante estudiar las enzimas en un
sistema simple para comprender su estructura,
cinética, mecanismos, regulaciones y función en
un sistema complejo.
 Es importante aislar la enzima pura para usarla
con fines médicos e industriales.
 Primera enzima purificada: ureasa por Summer
(1926)
 ¿Donde nosotros obtenemos
proteínas o enzimas?

 Cualquier organismos
 Órganos o tejidos
 Embriones
 Células de cultivo celular
 Proteínas desde sistemas de expresión
• Genes clonados en un vector,
insertados en un organismo que
sintetiza proteína
Objetivos de la Purificación de Enzimas


 actividad recuperada

 sin enzimas degradadas u otras inactivadas

 No hay otras enzimas o moléculas grandes denominadas

contaminantes
Selección de la Fuente de la enzima a purificar y
Solubilización de proteínas
 Localizacion intracelular de la enzima

El conocimiento de la localización intracelular y solubilidad

relativa de las enzimas ha permitido desarrollar
procedimientos de extracción diferencial que facilitan la
purificación

La ruptura
de las células en un buffer adecuado libera tales enzimas
al medio. Permanecen en el sobrenadante luego de la
eliminación de los componentes particulados.

(membranas,
mitocondrias, etc.).
 Pueden formar parte de las membranas celulares y
pueden ser extraídas después de la destrucción de la
misma;
 Pueden estar asociadas a material lipoproteico
insoluble. Para separarlas se debe disociar el
complejo.
Cómo saber si el proceso de purificación es exitosa

1. Pasos de purificación: da una breve descripción de la fracción probada

2. Volumen de la muestra en ml
3. Concentración de la enzima
4. Unidades enzimáticas totales o Actividad enzimática (= columna 3 x columna 2). Evalua el rendimiento de su purificación
5. Proteínas totales
6. Actividad específica (= columna 3/columna5). Indica el grado de prurificación alcanzado
7. Rendimiento ( obtenido a partir de la columna 4 tomando el primer valor de esta columna como 100%)
8. Grado de purificación (obtenido a partir de la columna 6 tomando el primer valor de esta columna como equivalente a 1)
 Pasos de purificación de proteínas

Paso 1. Solubilización de proteínas:

1. Homogenización
2. Centrifugación
3. Filtración
Paso 2. Estabilización de proteínas
Paso 3. Aislamiento de proteínas

Nota: Algunos materiales biológicos

constituyen por sí mismos una
solución proteica clara o casi clara
adecuada para su aplicación directa a
columnas de cromatografía tras
centrifugación o filtración.
Homogenización

A escala de laboratorio:
• Sonicación
• Prensa francesa
• Escisión enzimática o química de
la célula
• Congelación-descongelación
A mayor escala:
• Homogeneización a alta presión
• Molienda de microesferas
 Centrifugación

• La centrifugación se realiza para

aislar las proteínas que son
componentes de la membrana o
del conjunto subcelular (Por
ejemplo: proteína mitocondrial)
• El lisado celular se centrifuga a
una velocidad que elimina
únicamente los componentes
celulares más densos que el
orgánulo deseado.
Ultrafiltración
 Las moléculas pequeñas se filtran por presión
 Se utiliza para concentrar proteínas.
 Alternativamente, centrifugación con membrana de diálisis.

Diagrama de una celda de presión Amicon usada para

concentrar macromoléculas en solución

Diagrama mostrando cómo opera una

membrana DiafloR a nivel molecular
 Paso 2. Estabilización de proteínas
• Hay que tener cuidado para preservar la estructura y la función de las proteínas después de
sacarlas de su entorno natural, donde eran estables
• pH - Para evitar la desnaturalización o la pérdida de función, las proteínas se colocan en una
solución tamponada a su pH nativo o cerca de él.
• Temperatura - la purificación de proteínas se realiza normalmente a baja temperatura ~ 0ºC.
mientras que algunas proteínas son térmicamente estables a altas temperaturas.
• Inhibición de proteasas
• Retraso de crecimiento de microbios que pueden destruir las proteínas
 A menudo se utiliza azida sódica
Paso 3. Aislamiento de proteínas

• El método de aislamiento de las proteínas difiere de una proteína a otra.

• Las proteínas pueden aislarse en función de las siguientes propiedades:
 3.1. Solubilidad

• Salting-in: La mayoría de las proteínas globulares

tienden a hacerse cada vez más solubles a medida
que aumenta la fuerza iónica debido a la adición de
sal. Este fenómeno se conoce como salting-in de las
proteínas.
• Salting-out: Al aumentar la concentración de sal,
disminuye la atracción electrostática entre las
moléculas de proteína por la presencia de abundantes
iones salinos. Este fenómeno se conoce como salting-
out de las proteínas.
• La concentración de sal a la que precipitan las
proteínas difiere de una proteína a otra.
• El salting-out es uno de los procedimientos de
purificación de proteínas más utilizados.
• El sulfato de amonio es el reactivo más utilizado.
 Alta solubilidad (3,9M en agua a 0ºC)
 Se puede hacer una solución de alta fuerza iónica
(hasta 23,5 en agua a 0ªC)
 3.2. Tamaño molecular

A. Diálisis
• Proteínas pueden ser separadas desde moléculas
pequeñas tales como sales por diálisis a través de
una membrana semipermeable tal como membrana
de celulosa con poros.
• La mezcla de proteínas es colocada dentro de
bolsas de diálisis el cual es sumergida en solución
búfer.
• Las moléculas que tienen dimensiones
significativamente mayores que el diámetro del
poro quedan retenidas en el interior de la bolsa de
diálisis.
• Las moléculas más pequeñas y los iones capaces
de atravesar los poros de la membrana se difunden
por su gradiente de concentración y emergen en la
solución fuera de la bolsa.
 3.2. Tamaño molecular

B. Cromatografía Filtración en Gel

• También conocida como cromatografía de
exclusión molecular.
• Fase estacionaria: Microesferas porosas.
Ejm: Sephadex, Sepharose, etc.
• Fase móvil: Bufer
Ejm: Tetrahidrofurano, Cloroformo, Dimetil
formamida.
 B. Cromatografía Filtración en Gel

• Las microesferas están hechas de un polímero

insoluble pero altamente hidratado, como dextrano,
agarosa o poliacrilamida.
• La muestra se aplica en la parte superior de la
columna formada por las microesferas porosas en el
tampón.
• Las moléculas pequeñas de la muestra pueden entrar
en estas microesferas o perlas, pero las grandes no.
• Las moléculas pequeñas se distribuyen en el interior
de las microesferas o perlas y entre ellas, mientras
que las moléculas grandes se localizan únicamente
en la solución entre las perlas.
• Las moléculas grandes fluyen más rápidamente a
través de esta columna mientras que las moléculas
pequeñas recorren un camino más largo y tortuoso,
estas saldrían últimas.
 3.2. Carga iónica

A. Cromatografía de intercambio
iónico
• Fase estacionaria: Intercambiadores
iónicos.
• Fase móvil: buffers de
concentraciones variables.
• Principio: La cromatografía de
intercambio ionico se basa en la
atracción entre intercambiadores de
iones de carga opuesta y el analito
(proteína-muestra).
• Intercambiadores de iones.
A. Cromatografía de intercambio iónico

Las resinas de intercambio iónico contienen grupos cargados.

Si estos grupos son de naturaleza ácida, interactúan con proteínas cargadas positivamente y se
denominan intercambiadores de cationes.

Si estos grupos son de naturaleza básica, interactúan con moléculas cargadas negativamente y se
denominan intercambiadores de aniones.
A. Cromatografía de intercambio iónico

Hay 4 pasos en la cromatografía de intercambio ionico:

1. Equilibrado - estabilización de los intercambiadores de iones con iones de carga opuesta en el
tampón. Por ejemplo, Na+Cl-
2. Aplicación de la muestra y lavado (la proteína unida a los intercambiadores de iones permanece
unida mientras que la otra se elimina durante el lavado)
3. Elución - Eliminación de la proteína unida a los intercambiadores de iones con la ayuda de una
mayor concentración de tampón de elución.
4. Regeneración - Preparación de los intercambiadores de iones para la siguiente ronda de
purificación de proteínas.
A. Cromatografía de intercambio iónico

Si una proteína tiene una carga neta positiva a pH 7, normalmente se unirá a una columna de perlas
que contengan grupos carboxilato (intercambiadores de cationes).

la proteína o enzima con carga

positiva se une a la columna.

las proteínas con carga negativa

atraviesan la columna
A. Cromatografía de intercambio iónico

Para eluir nuestra proteína de interés, añadir tampón o mayor concentración de sal. El Na+ interactuará con
la resina catiónica y el Cl- interactuará con nuestra proteína cargada positivamente para eluir de la columna.

+ aumento de [NaCl] en el tampón de elución

A. Cromatografía de intercambio iónico

• Las proteínas se unirán a un intercambiador de iones con diferentes afinidades.

• Al lavar la columna con tampón, las proteínas que tienen afinidades relativamente bajas por la
resina de intercambio iónico se desplazarán más rápidamente por la columna que las proteínas
que se unen fuertemente a la columna a los intercambiadores iónicos.
• Cuanto mayor sea la afinidad de unión de una proteína por la columna de intercambio iónico, más
se ralentizará su elución fuera de la columna.
• Las proteínas pueden eluirse cambiando el tampón de elución por otro con una mayor
concentración de sal y/o un pH diferente (elución escalonada o elución en gradiente).
Cromatografía de intercambio iónico por elución paso a paso
3.2. Carga iónica

B. Electroforesis en Gel

Aparato:
1. Tanque de bufer
2. Bufer o Tampón
3. Electrodos
4. Fuente de alimentación
5. Medio de soporte
6. Colorante de
seguimiento
B. Electroforesis en Gel

• Principio: Cualquier ion o molécula cargada migra cuando se coloca en un campo

eléctrico, la velocidad de migración depende de su carga neta, tamaño, forma y la
corriente eléctrica aplicada.
• Puede representarse mediante la siguiente ecuación:
B. Electroforesis en Gel

• La electroforesis es el movimiento de partículas cargadas a través de un electrolito

cuando se someten a un campo eléctrico.
• Los cationes se desplazan hacia el cátodo.
• Los aniones se desplazan hacia el ánodo.
• Se utiliza habitualmente en análisis biológicos, sobre todo en la separación de
proteínas, péptidos y ácidos nucleicos.
• La poliacrilamida se utiliza como medio de soporte para la separación de proteínas.

Según la técnica de vertido en gel, se clasifican en:

1. Horizontal
2. Vertical
B. PAGE

• PAGE es siempre vertical porque en los

geles HGE se vierten en una bandeja
que está expuesta al oxígeno
atmosférico.
• El oxígeno inhibe la polimerización de
la acrilamida, por lo que interfiere en la
creación del gel.
 B. PAGE

PAGE vertical puede ser

de dos tipos:
B. PAGE
B. PAGE

Propósito de utilizar dos capas de gel

 Stacking gel (5%) necesaria para concentrar todas las proteínas en una
banda, de modo que empiecen a migrar juntas en el gel al mismo tiempo.
 Separating gel (12%) o gel de corrida permite separar las proteínas en
función de su peso molecular.
B. PAGE

• Native-PAGE: Las proteinas están corriendo

en su estado nativo (es decir su estructura
terciaria o cuaternaria)
• SDS-PAGE: SDS significa dodecil sulfato
sódico. El SDS es un tampón aniónico que
contiene b-mercaptoetanol y SDS. El b-
mercaptoetanol reduce los puentes disulfuro
que estabilizan la estructura terciaria de las
proteínas y desnaturaliza la proteína.
Aporta una carga negativa uniforme a los
polipéptidos.
B. SDS-PAGE vs Native PAGE
B. PAGE

Tinte de seguimiento: Como las proteínas y los ácidos nucleicos son en su mayoría incoloros.
Los colorantes iónicos se utilizan para detectar la movilidad de la proteína. El colorante de rastreo
más utilizado es el azul de bromofenol.
3.2. Carga iónica
C. Isoelectroenfoque

• Enfoque isoeléctrico o
Isoelectroenfoque es un método
electroforético en el que las proteínas
se separan en función de su punto
isoeléctrico (pI).
• Aprovecha la propiedad de las
proteínas de que su carga neta viene
determinada por su entorno local.
• Principio: En el punto isoeléctrico, la
carga neta de la proteína se hace
cero. Por lo tanto, la movilidad de las
proteínas es nula en un campo
eléctrico.
3.3. Carga ionica

Separa proteínas en función de sus puntos

isoeléctricos en un gradiente de pH estabilizado.

Procedimiento de Isoelectroenfoque:
• Un extracto celular se desnaturaliza
completamente mediante una
concentración elevada de urea (8M).
• El extracto celular desnaturalizado se vierte
sobre el gel de poliacrilamida recubierto
con anfolitos.
• Cuando se colocan en un campo eléctrico,
los anfolitos se separan y forman un
gradiente de pH continuo.
 3.4. Afinidad de unión

Cromatografía de afinidad:

• Principio: Muchas proteínas pueden

unirse a moléculas específicas de forma
muy fuerte pero no covalente. La sustancia
que se desea purificar se adsorbe de forma
específica y reversible a un ligando
(sustancia de unión), inmovilizado
mediante un enlace covalente a un material
del lecho cromatográfico.
• Pasos:
1. Incube la muestra bruta con el ligando
inmovilizado.
2. Lavar los componentes de la muestra no
unidos al soporte sólido.
3. Elución de las moléculas de interés en
forma purificada.
En 1910 se describe por primera
vez esta técnica por el botánico
ruso M. Tswett la usa para
separar pigmentos de plantas y le
da el nombre de cromatografía
por las bandas de colores que se
separaban. Se utilizaron columnas
de yeso.

En 1952 Martin y James desarrollan la

cromatografía de gas-líquido, encontrándose
aplicaciones de gran importancia. • En 1956 se
estableció el inicio del desarrollo de la teoría de
En 1930 fue separación cromatográfica (Van Deemter, 1956;
redescubierta por Giddings, 1965, etc ). • Actualmente no hay un
Kuhn y Lederer, campo de la Química, Biología y Medicina que no
separaron utilice la cromatografía en alguna de sus formas.
carotenoides.
Mikhail Semiónovich Tsvet 1906

Acuñaría el término de
“cromatografía” a través de sus
experimentos iniciales de
separación de clorofilas de
tejidos vegetales (fase móvil) en
columnas de carbonato de calcio
(fase estacionaria)
Richard Kuhn y Edgar Lederer (1931)
Aplicaron técnicas cromatográficas para separar
carotenoides. Kuhn recibió premio Nobel de
Química de 1939 por su trabajo sobre los
carotenoides y vitaminas
Richard Kuhn

Richard L. M. Synge y Archer John Porter Martin (1941)

Aplicaron técnicas cromatográficas para estudiar la composición
de aminoácidos en lana. En 1952 recibieron el permio Nóbel en
Química "por su invención de la cromatografía de partición".

En 1954, Cal Giddings planteó la hipótesis que sería posible aplicar a la cromatografía
líquida los mismo factores que hacían a la cromatografía de gases una poderosa técnica
de separación. Fue el inicio de la cromatografía líquida de alta resolución (HPLC)

Actualmente no hay un campo de la Química, Biología y Medicina que no utilice la

cromatografía en alguna de sus formas.
 Método físico-químico
de separación de los
componentes de una
mezcla, los cuales se
distribuyen entre dos
fases

Los componentes a separar deben ser solubles en la fase móvil y

capaces de interaccionar con la fase estacionaria
 CROMATOGRAFÍA

FASE MÓVIL GAS LÍQUIDO

Según los estados de
las fases implicadas
FASE Sólido Líquido Sólido
ESTACIONARIA Líquido

Adsorbente Adsorbente Resina Gel

Según el dispositivo utilizado para Plano Columna

Columna
poner en contacto la fase SOPORTE Columna Columna
estacionaria y la fase móvil

Según el mecanismo de interacción Reparto Reparto Adsorción Tamaño

MECANISMO Reparto Adsorción Intercambio
del soluto con la fase estacionaria molecular
iónico

C.G.L C.G.S C.L.L C.C.F. C.L.S

C.P C.C.I C.E.M
NOMBRE c.gas-líq c.gas-sól c.líq-líq c. capa c. liq-
c. papel c. cambio c. exclusión
fina sól
iónico molecular

Figura tomada de Hernández, L.

Introducción al análisis instrumental.2002
Cromatograma de purificación por cromatografía de exclusión molecular

Resinas para Gel-Filtração
NOME
indica quais os tamanhos das
partículas que podem entrar
nos poros da resina e serem
fracionados. Acima ou abaixo
TIPO FAIXA DE RESOLUÇÃO
da faixa, não há separação.
(kD)

Sephadex G-10 Dextrana 0.05 - 0.70 Moléculas pequenas

Sephadex G-25 Dextrana 1-5
Sephadex G-50 Dextrana 1 - 30
Sephadex G-100 Dextrana 4 - 150 Proteínas
Sephadex G-200 Dextrana 5 - 600

Bio-Gel P- 2 Policrilamida 0.1 - 1.8 Moléculas pequenas

Bio-Gel P- 6 Policrilamida 1-6
Bio-Gel P- 10 Policrilamida 1.5 - 20
Bio-Gel P- 30 Policrilamida 2.4 - 40
Bio-Gel P-100 Policrilamida 5 - 100 Proteínas
Bio-Gel P-300 Policrilamida 60 - 400

Sepharose 6B Agarose 10 - 4.000

Sepharose 4B Agarose 60 - 20.000 Células, partículas sub-celulares
Sepharose 2B Agarose 70 - 40.000

*Sephadex e Sepharose: Amersham Pharmacia Biotech; Bio -Gel: Bio -Rad Laboratories
 Tipos de Resina de troca Iônica

NOME TIPO GRUPO IONIZÁVEL OBSERVAÇÕES

Dowex 1 Fortemente básica Ø - CH N+(CH ) Troca aniônica
2 33
resina de polistireno
Dowex 50 Fortemente básica Ø - SO -H Troca Catiônica
3
resina de polistireno
DEAE -celulose Básica Dietilaminoetil Fracionamento de proteínas
- CH CH N+(C H ) ácidas e neutras
2 2 2 52
CM -celulose Ácida Carboximetil Fracionamento de proteínas
- CH COOH básicas e neutras
2
DEAE -Sephadex Gel de dextrano Dietilaminoetil Combinação de gel filtração
básico - CH CH N+(C H ) e troca iônica de proteínas
2 2 2 52
ácidas e neutras
CM - Sephadex Gel de dextrano Carboximetil Combinação de gel filtração
ácido - CH COOH e troca iônica de proteínas
2
básicas e neutras

* Dowex: Dow Chemical Co.; Sephadex: Amersham Pharmacia Biotech;Bio

- Gel: Bio Rad Laboratories
Elución a partir de la columna de
intercambio iónco.
Se pueden emplear cinco tipos de gradiente: (1)
lineal, (2) convexo, (3) cóncavo, (4) múltiple y
(5) discontínuo
Separa las proteínas sobre la base de una interacción reversible entre la proteína
objetivo (o grupo de proteínas) y un ligando específico unido a una matriz de
cromatografía
 Tipo de ligantes em cromatografia de afinidade
1. Mono-específicos: - ligação específica da molécula-alvo
- análogos de substratos ou inibidores de enzimas
- agonistas ou antagonistas de receptores
- haptenos ou determinantes antigênicos de anticorpos
- ligantes com “tag” ou “marcação”
- glutationa-S-transferase
- poli-Histidina

2. Grupo-específico: ligantes para separação de grupos:

Ligante Especificidade
grupo-específico
Proteína A Região Fc de IgG
Proteína G Região Fc de IgG
Concanavalina A Grupos glicosil- ou manosil-
Cibacron Blue Várias enzimas, albumina
lisina Plasminogênio, RNA ribossomal
arginina proteinases tipo tripsina
benzamidina proteinases tipo tripsina
calmodulina Proteínas reguladas por calmodulina
heparina Fatores de coagulação, lipases,
hormônios, receptores estoróides, etc
Metais de transição Proteínas e peptídeos com resíduos
de His expostos
Interacción reversible entre la superficie hidrofóbica de una proteína y una matriz cromatográfica
con un ligando hidrofóbico