Enzimología

Bitácora de
laboratorio
Reporte de práctica 1: Métodos de extracción de proteínas
(enzimas) a partir de diferentes fuentes.
Reporte de práctica 2: Cuantificación de la concentración de
proteínas (enzimas) extraídas a partir de diferentes fuentes
por el método de Lowry.
Reporte de práctica 3: Detección cuantitativa de la actividad
enzimática tipo α- amilasas

Fátima Rodríguez Martínez, matrícula 2125324

11 de mayo del 2023. General de Escobedo, N.L.
Unidad de Aprendizaje: Enzimología
Competencia: Analizar los criterios de aislamiento y purificación de enzimas
para sentar las bases de la caracterización bioquímica de las enzimas de
importancia biotecnológica.
Tema: Métodos de extracción de proteínas.
Nombre de la Práctica: Métodos de extracción de proteínas (enzimas) a
partir dediferentes fuentes.
Lugar: Laboratorio de Biotecnología

Propósito:
La realización de esta practica de laboratorio se da con el propósito de aislar
las enzimas que se encuentran en la muestra de cascara de pitaya
recolectadas previamente en el laboratorio de biotecnología, a través del uso
de métodos de extracción que consiste en recolectar y concentrar las
proteínas de la muestra de acuerdo a las propiedades de solubilidad de estas,
dadas por sus características bioquímicas.

Introducción:
Las proteínas son compuestos de alto valor científico ya que desde el punto de
vista de la comprensión del metabolismo biológico de todos los organismos ya
sean micro o macro, se pueden identificar proteínas con asombrosas propiedades
catalíticas (enzimas), como en los microorganismos que les permiten secretar
antibióticos como la penicilina en la bacteria Penicillium chrysogenum gracias a la
enzima ACV sintetasa, o como enzimas con alto valor industrial como la cascara
de pitaya que se ha visto involucrada en estudios resientes últimamente
demostrando que es una buena fuente de polifenoles bioactivos con la mayoría de
ácido clorogénico, ácido cafeico, ácido ferúlico y ácido p-cumárico, rutina e
isoquercitrina. También el polvo de cáscara de pitahaya se mostró eficiente como
fibra dietética antioxidante y 14 tipos de betacianinas que poseen actividades
antioxidantes y de eliminación de radicales libres, todos estos compuestos han
interaccionado con alguna enzima de la Hylocereus undatus que deberían
estudiarse más a fondo para comprender el ya demostrado alto valor nutricional.

Todo esto gracias al mejoramiento de técnicas de obtención de estas proteínas.

Como las técnicas cromatográficas donde en cualquiera de ambas situaciones
 se comienza con procesos de extracción ya sea por sedimentación, coagulación,
floculación, o filtración, la más utilizada es la sedimentación ya que es más
rápida y se enfoca en las propiedades químicas y físicas de las proteínas que se
quieren extraer, a diferencia de la filtración, coagulación y floculación que se
enfoca en el tamaño de la proteína, el procedimiento que se debe tener en
cuenta para realizar una sedimentación es el siguiente:

• Liberar la proteína eficientemente de la fuente original. Mediante una liberación

celular química o mecánica, ejemplo: Molienda del tejido en buffer de extracción.

• Remover los sólidos para dejar la proteína de manera soluble en el

sobrenadante, ejemplo usando filtro tipo Whatman, centrifugador en
condiciones:5,000- 10,000 rpm por 10 min.

• Concentrar la proteína: Precipitación con solventes como sales, etanol, metanol,

ultrafiltración, centrifugación.

• Remover contaminantes para una pureza deseada ejemplo: con membranas de

diálisis, para poder estabilizar la proteína: pH, temperatura, concentración de
sales.
Como se puede observar para la extracción de estas proteínas ya sean
únicamente proteínas o proteínas de función catalítica, se resalta el uso de
solventes, ya que la elección de estos dará con la obtención del tipo de enzima
que deseamos, la solubilidad de las proteínas es una increíble característica dada
por la estructura bioquímica de estas, por ejemplo, las proteínas estructurales
fibrilares son insolubles en agua debido a la diferencia de polaridad, pero la mayor
parte de las proteínas globulares son solubles en agua porque colocan las
cadenas hidrófilas en la periferia de la molécula, concentrando los grupos apolares
en el interior por lo que se facilita su movilización en el interior de los organismos,
donde por otro lado las fibrilares con estas características se encuentran dando
estructura.

Otra de las estructuras bioquímicas que dan la propiedad a las proteínas de ser
unas más solubles que otras en agua son si estas proteínas se conforman de
más aminoácidos polares (con carga o sin carga) que apolares, ya que las
interacciones de los aminoácidos polares suelen tener más radicales libres (-R)
que, al ionizarse, establecen enlaces débiles fuertes (puentes de hidrógeno) más
fuertes con las moléculas de agua.

Y sin dejar de lado la solubilidad también se distorsiona por la concentración

salina del medio, en disoluciones salinas diluidas, los iones contribuyen a
aumentar la polaridad de las cadenas laterales, pero en altas concentraciones de
sales ocurre un efecto adverso, ya que los iones compiten con las moléculas de
 la proteína para rodearse de moléculas de agua, la desventaja de usar sales
como método de disolución es que la mayoría de las proteínas pierden su
actividad, pero se puede eliminar la sal por diálisis (una bolsa hecha de
membrana semipermeable que permite la salida de sales).

Existen otro tipo de disolventes orgánicos que crean en efecto contrario ya que
son neutros miscibles con el agua, particularmente el etanol o acetona,
disminuyen la solubilidad de la mayor parte de las proteínas globulares en el
agua, de tal manera que precipitan de su disolución.
La propiedad de solubilidad hace que se clasifiquen los tipos de proteínas de la
siguiente manera:
Albúminas: Solubles en agua.
Globulinas: Solubles en soluciones salinas diluidas.

Glutelinas: Solubles en soluciones de ácidos y bases diluidos.

Prolaminas: Solubles en soluciones acuosas de etanol.

Materiales biológicos y reactivos:

• Cascara de pitaya previamente deshidratada y molida.

• Agua destilada
• 100 ml de solución de 0.1M Tris HCl pH 6.8 con NaCl al 0.5 M
• Acetona fría

Equipos y Materiales:

• Micropipetas,
• tubos de 15 mL
• Centrífuga refrigerada
• Incubadora
• Vortex
• Termómetro
• Gradilla para tubos
• Hielo.
 Metodología:

1. Se peso 1 g de material, se suspende el material en 6 ml de agua y

se agito por 10 min en un vortex.

2. Se centrifugo el tubo a 10,000rpm a 4 ºC por 5 min.

3. Se descarto el precipitado y se recuperó el sobrenadante, almacenando en

frío hasta su uso.

4. Se repite el procedimiento con el resto de la harina, pero usando la solución

salina.
5. Una vez obtenidas las muestras se procede a precipitar las proteínas usando
acetona fría (Para esto se coloca acetona a -70 ºC). Agregue 4 mlde acetona
por cada ml de extracto.
6. Deje reposar por 10 min y proceda a precipitar usando centrifugación.
7. Descarte el sobrenadante y resuspenda el precipitado en un volumen de
500 µl. El precipitado resuspendido será la fuente de proteínas (enzima).
 Resultados y discusión:

• Descripción de los extractos obtenidos discutir el protocolo realizado,

modificaciones, puntos críticos.
La solución inicial que se obtuvo resulto tener alta viscosidad al punto de
que no se podía realizar completamente la agitación en el vortex, por lo que
se optó por agregar 6 ml tanto de agua como de acetona para cada
solución, esto ocurre según a la literatura al enlazamiento de gran cantidad
de proteínas que no tenían afinidad por el agua, por lo tanto, podemos
suponer que nuestra muestra cuenta con bastantes proteínas fibrilares o
tejido fibroso ya que era difícil de disolver en agua, corroborando con la
lectura introductoria, coincide con el contenido nutricional de fibra
antioxidante de la pitaya.
Después de la precipitación de las proteínas gracias a la acetona se pudo
aclarecer más la muestra debido a que la acetona permite la recuperación
eficiente de proteínas y elimina los componentes no proteicos,
polisacáridos, lípidos y compuestos fenólicos, por lo que el sobrenadante
de la solución acuosa se torno mas claro y facilito la recolección de un
precipitado de proteínas-enzimas más concentrado.
Los volúmenes obtenidos fueron de aproximadamente 500 µl

• Diagrama de flujo del proceso de extracción.

 Conclusión

El alumno remarca lo aprendido durante el desarrollo de la actividad práctica. Aquí

puede hacer énfasis en los fundamentos prácticos.

Las betacianinas poseen actividades antioxidantes y de eliminación de radicales

libres, lo que sugiere sus efectos beneficiosos sobre los trastornos metabólicos.
Estas sustancias fueron aisladas e identificadas de la cáscara de Hylocereus
undatus y fue evaluada su capacidad para mejorar la obesidad, la resistencia a la
insulina y la esteatosis hepática en ratones obesos inducidos por una dieta alta en
grasas. Resultados mostraron que la cáscara de pitaya de pulpa blanca contiene
14 tipos de betacianinas.

Anexo
1. ¿Cuáles son los criterios que se deben de considerar en los procesos de
extracción de proteínas?
El equipo disponible, ya que la mayoría del proceso dependerá del equipo o
material disponible, después revisar las condiciones de las muestras, tipo
de proteína que se desea extraer, seleccionar el mejor solvente que de
acuerdo a su estructura química se disuelva la proteína y después se
precipite mediante el uso de acetona fría, se debe considerar también que
la acetona este fría porque eso mejorará la precipitación de las proteínas.
2. ¿Por qué cree usted que debe haber variaciones en el proceso de
extracción dependiente del solvente?
Debido a que el proceso puede comenzar con el fin de disolver lo
más posible las enzimas que se encuentran en la muestra, así como
actúa el agua o la solución salina, pero en la otra parte del proceso la
acetona realiza el efecto contrario reestructurando las proteínas,
enfriándolas, precipitándolas ya que disminuye el grado de ionización
de los radicales de las proteínas
entre proteínas no se tienen la misma estructura química, por lo
tanto, tampoco la misma afinidad hacia ciertos solventes.
comenzando si es una proteína globular o fibrilar,
3. Si usted evaluará varios solventes para establecer un método de extracción de
proteínas (enzimas), ¿qué criterios tomaría en cuenta para su selección?
Como estos reaccionarían con la enzima, comenzando si es una proteína
globular o fibrilar.
4. Si usted quisiera a partir de los extractos seleccionados purificar su proteína
(enzima), ¿qué criterios tomaría en cuanta para seleccionar el tipo de técnicas
cromatográfica
La cantidad de aminoácidos polares con o sin carga, como están acomodados los
grupos hidrofílicos también el pH del agua que uso.
Referencias

Buchannan B. B., W. Gruissem and R. L. Jones (Eds.). 2002. Biochemistry and

Molecular Biology of Plants. American Society of Plant Physiologists

Riveron, B. (2022). La pitahaya rosa, rica en compuestos antioxidantes.

https://actualfruveg.com/2022/04/16/pitahaya-rosa-antioxidantes/

Tang , W.; Li , W.; Yang , Y.; Lin , X.; Wang , L.; Li , C.; Yang, R. (2021).
Phenolic Compounds Profile and Antioxidant Capacity of Pitahaya Fruit Peel from
Two Red-Skinned Species ( Hylocereus polyrhizus and Hylocereus undatus).
Foods, 10(6):1183.
Nombre de la Práctica: Cuantificación de la concentración de proteínas (enzimas)
extraídas a partir de diferentes fuentes por el método de Lowry
Lugar: Laboratorio de Biotecnología

Propósito:
La realización de esta practica de laboratorio se da con el fin de determinar la
concentración de proteínas por el método de lowry de nuestras dos
soluciones previamente extraídas, tanto acuosa como salina.

Introducción:

El método de Lowry es un método clásico utilizado para la cuantificación de

proteínas en muestras biológicas. Fue desarrollado por Oliver H. Lowry y sus
colegas en 1951 y ha sido ampliamente utilizado desde entonces.

¿Cuál es el fundamento de este método para la cuantificación de proteínas?

El fundamento del método se basa en la presencia de los aminoácidos tirosina y

triptófano en las proteínas. Estos aminoácidos son capaces de reducir los
iones de fosfomolibdato y tungstato presentes en el reactivo de Folin-
Ciocalteu. Esta reacción de reducción genera un cambio de color en la
solución, que es detectado y cuantificado.

La absorbancia de la solución es medida a una longitud de onda específica

utilizando un espectrofotómetro, y la cantidad de proteína presente en la
muestra se determina comparando la absorbancia con una curva estándar
de concentraciones conocidas de una proteína de referencia. La relación
entre la concentración de proteína y la absorbancia es lineal, lo que permite
una cuantificación precisa.

Es importante tener en cuenta que el método de Lowry es sensible a otros

componentes de la muestra, como ácidos nucleicos, detergentes y sales,
que pueden interferir en la reacción y afectar la cuantificación de las
proteínas. Por lo tanto, es necesario tener cuidado en la preparación de las
muestras y realizar las correcciones si es necesario.

Cuando se agrega una muestra que contiene proteínas, ocurren varias etapas
 en la reacción:

• Las proteínas presentes en la muestra se desnaturalizan y se rompen en sus

unidades constituyentes, los aminoácidos.

• Reacción previa de la proteína en medio alcalino con iones Cu2+ evita la

precipitación formandose un complejo de coordinación entre el cobre y el
nitrógeno peptídico

• Los aminoácidos tirosina y triptófano se presentan en las proteínas que

reaccionan con el fosfomolibdato y el tungstato en el reactivo de Folin-
Ciocalteu. Esta reacción de oxidación-reducción genera un complejo de color
azul intenso.

Materiales biológicos y reactivos:

• Solución Standard de Albumina Bovina (2 mg/ml).

• -Reactivo de Lowry, compuesto por tres soluciones que se mezclan en el
momento de su utilización, y que son las siguientes:
A: Carbonato sódico al 2% en NaOH 0.1 MB:
Sulfato cúprico al 1%
C: Tartrato sódico-potásico al 2%

Nota: En el momento de su uso se mezclan 50 ml de A con 0.5 ml de B y 0.5 ml de

C.

• -Reactivo de fenoles de Follin-Ciocalteau. Este reactivo viene preparado

comercialmente y se debe mantener en refrigeración. Para su uso se diluye
inmediatamente antes en la relación de 1 parte de reactivo por 2 de agua
destilada.
• Extractos enzimáticos

Equipos y Materiales:

• Espectrofotómetro
• Micropipetas
• Microtubo Incubadora
• Vortex
• Gradilla para tubos
• Hielo.
 Metodología:

1. Preparación de los reactivos tal como se describen arriba en la sección de

material biológico y reactivos
2. Preparación de la curva de calibración según la siguiente tabla:

Tubo 0 1 2 3 4 5 6 7 6

Agua 100 95 90 80 70 60 40 20 0
destilada
(µL)
Albumina 0 5 10 20 30 40 60 80 100
Bovina
stock 2
mg/mL (µL)
Concentraci 0 0.1 0.20 .40 .60 .80 1.20 1.60 2
ón final de
Albumina
(mg/ml)
Reactivo 1 1 1 1 1 1 1 1 1
Lowry
(mL)
3. Se agita vigorosamente y se deja reposar durante 10 min
4. Agregar 100 µL del reactivo de Follin-Ciocalteau
5. Se agita vigorosamente y se deja reposar durante 45 min en obscuridad
total
6. Leer las muestras en el espectrofotómetro a una longitud de onda de 700
nm
7. Para la lectura de las muestras se sigue el mismo procedimiento que parala
curva, solo se sustituye la albumina por 100 µL de la muestra problema.

Resultados:

• Diagrama de flujo del proceso de cuantificación.

• Resultados de la curva de calibración
Los resultados obtenidos de la curva de calibración fueron los
presentados en la siguiente tabla:

concentración abs 1 abs 2 Promedio

0 0.026 0.035 0.0305
0.1 0.028 0.078 0.053
0.2 0.088 0.06 0.074
0.4 0.106 0.1 0.103
0.6 0.205 0.156 0.1805
0.8 0.233 0.171 0.202
1.2 0.339 0.335 0.337
1.6 0.427 0.391 0.409
2 0.569 0.537 0.553
El grafico de dispersión:
 Concentración proteíca vs absorbancia
0.6
y = 0.2569x + 0.0188
0.5 R² = 0.9921
Absorbancia (ua)

0.4

0.3

0.2

0.1

0
0 0.5 1 1.5 2 2.5
Concentración de albumina

Podemos observar que el comportamiento de este fenómeno es lineal ya

que se obtiene una línea de tendencia de línea recta, la ecuación de
esta línea de tendencia nos ayudara a predecir los valores de
concentración (x) en cualquier medida de absorbancia (y). El hecho de
que la albumina sea una proteína soluble en agua nos aproxima a que
así es como se comportarían las proteínas globulares (solubles).

• Concentraciones de proteínas de lasmuestras analizadas obtenidas

mediante regresión lineal con la ecuación arrojada en la curva
estándar.
Tipo de solución abs repeticiones abs promedio(y) Concentración de proteínas (x) Formula de despeje
Acuosa 2.785 x=(y-0.0188)/0.2569
2.75 2.702 10.44453095
2.571
Salina 1.113
1.198 1.173666667 4.495393798
1.21

Por lo tanto, la concentración de proteínas en la muestra acuosa fue de 10.5

mg/ml y de la muestra salina fue de 4.5mg/ml.
Conclusión

Podemos concluir que nuestro modelo de regresión lineal fue exitoso, ya que el valor
de R2=0.9 indicando que los datos si tienen una mayor tendencia a seguir este
 modelo, por lo que se puede utilizar en el fututo para predecir las concentraciones
de otras proteínas, por el contrario, si se purificaran los tipos de proteínas de
acuerdo a su tamaño o función, encontradas en las muestras seguramente se
obtendrían datos mejores y más específicos de acuerdo al tipo de proteína.

Anexo

Cuestionario

1. Explique el fundamento del método de cuantificación de proteínas utilizado

El punto de este método de cuantificación de proteínas es colorear a las

proteínas incoloras para que por medio de un espectrofotómetro medir la
absorbancia en el espectro visible de este colorante, si la intensidad del color
desarrollado luego de la reacción colorimétrica es proporcional a la cantidad
de proteínas presentes en la muestra, esta reacción se puede usar para
cuantificar la concentración de proteínas que son tratadas con los mismos
reactivos. Por lo tanto, en principio el reactivo de Lowry provoca una reacción
de desnaturalización debido a las sales, donde seguidamente ocurre una
reacción llamada reacción de Biuret donde en presencia de proteínas, se
forma un complejo de coordinación entre los iones iones Cu2+ y los pares de
electrones no compartidos del nitrógeno, que forma parte de los enlaces
peptídicos, y para cuando se le agrega el reactivo de Folin- Ciocalteu que
contiene molibdato y tungstato sódico, estos fenoles son capaces de
reaccionar con agentes oxidantes para evitar que se oxide la muestra.
Reacción de Folin: característica de los grupos –OH reductores de los
aminoácidos tirosina y triptófano que, junto con los complejos Cu+2 , reducen
el reactivo de Folin generando un color azul.

2. ¿Por qué hay variaciones en el contenido de proteínas a partir de las

diferentes solventes de extracción utilizados?
Porque evidentemente hay más cantidad de proteínas que son
solubles en agua como las albuminas que proteínas globulinas que son
solubles en soluciones salinas diluidas.

3. Explique que otros métodos para cuantificar proteínas existen y

fundaméntelos
Existen varios métodos de colorimetría ya que son sencillos de realizar, pero
también se usa la turbidimetría Medición de la turbidez resultante de la
precipitación de proteínas · Absorción en el ultravioleta Se mide la absorbancia a
 270nm originada fundamentalmente por los anillos aromáticos de triptófano y
tirosina. · Métodos de unión a colorantes

Referencias

Gaccia, E. Fernandez, I. Fuentes, A. Determinación de polifenoles

totales por el método de FolinCiocalteu.
https://riunet.upv.es/bitstream/handle/10251/52056/Garcia%20Mart%C3%ADnez%
20et%20al.pdf?sequence=1
Kaur, C. y Kapoor, H. C. (2001). “Antioxidants in fruits and vegetables-The
millennium's health”. International Journal of Food Science and Technology, vol. 36,
nº. 7, pp. 703–725,
Buchannan B. B., W. Gruissem and R. L. Jones (Eds.). 2002. Biochemistry and
Molecular Biology of Plants. American Society of Plant Physiologists

Nombre de la Práctica: Detección cuantitativa de la actividad enzimática tipo α-

amilasas
Propósito:
El propósito de la realización de esta práctica es cuantificar la actividad enzimática
de enzimas de tipo α- amilasas.

Introducción: Los ensayos enzimáticos cuantitativos además de detectar

solamente la actividad catalítica evidencian la cantidad de enzima activa
presente en una muestra y puede ser expresada en moles o bien, en unidades
enzimáticas o UI; definiendo esa última como la cantidad de enzima necesaria
para degradar 1mol de sustrato por minuto.

Hay diversidad de protocolos útiles para detectar la actividad enzimática y

generalmente se basan en la medición del sustrato consumido o la liberación
de elementos producidos durante la reacción en un tiempo determinado. Uno
de los equipos más utilizados en este tipo de ensayos en el espectrofotómetro
ya que muchas de las técnicas miden la variación en la absorbancia mientras
se lleva a cabo la reacción.
Un parámetro bioquímico importante para una enzima es la actividad específica,
que se define como la actividad enzimática por miligramo de proteína total,
normalmente expresada en unidades de enzima por mL (U/mL), o bien en
(U)/mg de proteína. La actividad específica proporciona una medida de la
pureza de la enzima en una mezcla. Para enzimas puras de la misma familia y
suponiendo masas moleculares y constantes de Michaelis similares, la
actividad específica también mide la eficiencia de la enzima, ya que está
directamente relacionada conel número de recambio, es decir, el número de
moléculas de sustrato convertidas en producto por unidad de tiempo para una
sola molécula de enzima cuando la enzima está saturada con el sustrato.
Normalmente, el precio comercial de una enzima se fija en unidades de
enzima; por lo tanto, para un proceso industrial seprefiere una enzima con
alta actividad específica.

Materiales biológicos y reactivos:

• Extractos enzimáticos
• Reactivo DNS

Solución 1 8 mL NaOH 2M + 12 g Tartarato de sodio – potasio

Solución 2 20 mL DNS 96 mM
Solución final DNS 12 mL H2O caliente + Solución 1 + Solución 2

• Maltosa para curva estándar solución stock 2 mg/mL

• Buffer de reacción
El buffer en el que se llevara a cabo la reacción es una solución de Na2HPO4 20
mM con 6.7 mM de NaCl pH 5 y pH 6. EL pH se ajustarácon ácido citrico 0.1
M.
• Sustrato de almidón al 1% en buffer de reacción (pH5 y pH6) y
calentando para favorecer la disolución del almidón.
• Solución de amilasa de saliva (como control positivo).

Equipos y Materiales:

• Espectrofotómetro
• Micropipetas
• Microtubos
• Incubadora
• Vortex
• Gradilla para tubos
• Hielo.

Metodología:

1. Realizar la curva estándar de maltosa de acuerdo con la siguiente tabla:

Para la curva de maltosa, por duplicado, se realizaron diluciones de la
misma utilizando el stock de 2 mg/mL:

Trabajar por duplicado o triplicado

Concentración (mg/mL) Agua destilada (µL) Maltosa (2 mg/mL)

0.00 200.00 0.00
0.10 190.00 10.00
0.20 180.00 20.00
0.50 150.00 50.00
0.75 125.00 75.00
1.00 100.00 100.00
1.50 50.00 150.00
2.00 0.00 200.00

2. Agregar 100 µL de reactivo de DNS

3. Incubar los tubos en baño maría por 5 min y 5 min en hielo molido.
4. Agregar 900 µL de agua destilada a cada uno de los tubos
5. Realizar lectura en el espectrofotómetro a 540 nm
6. Considerar amilasa de saliva humana como control positivo
7. Evaluación de las muestras se sigue el mismo procedimiento, pero su usala
muestra enzimática de acuerdo a la siguiente tabla:

Solución Blanco Control Muestra

positivo problema
Sustrato 100 µL 100 µL 100 µL
Amilasa humana 100 µL
Muestra 100 µL
problema
 Incubar 10 min a 37°C
DNS 100 µL 100 µL 100 µL
Amilasa humana 100 µL
Incubar 5 min en baño maría, seguido de 5 min en hielo molido
Agua bidestilada 900 µL 900 µL 900 µL
µ
Volumen total 1.2 mL 1.2 mL 1.2 mL

8. Una vez obtenido el volumen total se procede a dar lectura mediante

espectrofotometría a 540 nm
9. Cálculos
Al momento de realizar la curva estándar de maltosa se adquieren 2
lecturas de absorbancias por cada una de las diluciones preparadas
(duplicado), estas lecturas se promedian, se grafican y se obtiene la
ecuación de la recta y= mx + b
Donde: y corresponde a la absorbancia
X representa la concentración de la muestra
10. En esta fórmula se despejará “X” sustituyendo “Y” con la absorbancia
obtenida en cada una de las muestras. EL resultado serán los mg/ml de
azucares liberados que a su vez corresponderán a las unidades
enzimáticas por ml.

Resultados:

• Datos de las absorbancias de la curva estándar de maltosa

Concentración (mg/mL) Promedio Abs 1 Abs 2 Abs 3
0 0.019 0.016 0.023 0.018
0.1 0.015 0.012 0.015 0.018
0.2 0.039333333 0.04 0.039 0.039
0.5 0.135333333 0.137 0.128 0.141
0.75 0.233666667 0.235 0.232 0.234
1 0.340333333 0.343 0.352 0.326
1.5 0.471333333 0.457 0.488 0.469
2 0.670333333 0.711 0.63 0.67

• Grafica de la curva estándar de maltosa

 Concentración de maltosa vs abs y = 0.335x - 0.0128
R² = 0.9937
0.8
0.7
0.6
0.5
Absorbancia

0.4
0.3
0.2
0.1
0
0 0.5 1 1.5 2 2.5
-0.1
Concentración de maltosa (mg/ml)

• Cálculos de la actividad enzimática de acuerdo con las lecturas de

absorbancias y ecuación de la línea recta de la curva estándar
Concentración
Muestras Promedio Abs 1 Abs 2 Abs 3
(mg/mL)
Acuoso 0.975 1.058 0.936 0.932 2.950
Salino 0.653 0.731 0.618 0.609 1.986

Concentración
Muestra Acuoso Promedio Abs 1 Abs 2 Abs 3
(mg/mL)
Blanco 0.163 0.180 0.166 0.144 0.526
Control Positivo 1.076 1.189 1.119 0.920 3.250

Concentración
Muestra Salina Promedio Abs 1 Abs 2 Abs 3
(mg/mL)
Blanco 0.109 0.105 0.127 0.094 0.3626
Control Positivo 1.210 1.208 1.239 1.183 3.6501
Por lo tanto, podemos observar que la concentración de maltosa que se
liberó en la solución acuosa gracias a la actividad de las enzimas
𝛼milasa es de 2.950mg/ml que a su vez corresponden a las unidades
enzimáticas por mililitros ya que 2.950 es la cantidad de enzima
necesaria para transformar 1𝜇𝑚𝑜𝑙 de sustrato por minuto. Para la
concentración de maltosa liberada en la solución salina por la actividad
de estas enzimas es de 1.986mg/ml a lo que es equivalente a encontrar
de 𝛼milasa 1.986U.

• Cálculos de las unidades de actividad enzimática especifica (U/ml) y realice

 el cálculo para expresarlos en U/mg de proteína, con el uso de las
concentraciones de proteínas.
Si la actividad enzimática se obtiene de 𝑎𝑐𝑡 = 𝑈/𝑚𝑙, para la muestra acuosa se
obtiene
𝑈 1000𝜇𝑙
𝑎𝑐𝑡 = 100𝜇𝑙 ( ) = 29.5𝑈/𝑚𝑙
1𝑚𝑙

Para la solución salina se obtendrían 19.86U/ml.

Conclusión

En conclusión, gracias a la curva de maltosa podemos saber la concentración de

azucares redox que libero la enzima alfamilasa en proporción a su actividad,
para futuros procedimientos se podría agregar una curva de absorbancia vs el
tiempo en que la enzima va degradando estos azucares y tener mejores
estimaciones.

Anexo

Cuestionario

1. ¿Explique la importancia de medir la actividad enzimática en términos de

Unidades de actividad por minuto?
Para la industria es de suma importancia estas unidades ya que buscan
volver las eficiente un proceso y según la enzima que tenga mayor actividad
enzimática en un menor tiempo cuando esta esta saturada de sustrato esto
resta costos al proceso.
2. ¿Por qué hay variaciones en el contenido de actividad enzimática de
diferentes muestras?
Porque las enzimas pueden trabajar diferente dependiendo en el tipo
de solución que se encuentren, en la solución salina se observa que
fue la muestra con menos actividad enzimática esto puede deberse a
que las sales o iones pudieron intervenir en el sitio activo de la enzima,
o el pH de la solución salina era mas alto y el Ph de la 𝛼milasa optimo
es de 5.
3. ¿Cuáles son las condiciones que se deben de considerar al medir la
actividad enzimática de una enzima?
Que todas las condiciones de sus propiedades químicas sean optimas,
como el Ph optimo, que se encuentre en el disolvente de su mejor
actividad.
4. ¿Qué función tiene el almidón en la reacción?
Se necesita como sustrato para que a partir de este polisacárido la enzima se una
y comience a degradarlo en azucares mas pequeños que si interactúan con el
DNS cambiando de color la reacción, y que sea optimo poder medir con una
longitud de onda visible la concentración de estos azucares liberados, ya sea con
enzima de control o muestra enzima muestra.

Referencias

Buchannan B. B., W. Gruissem and R. L. Jones (Eds.). 2002. Biochemistry and

Molecular Biology of Plants. American Society of Plant Physiologists