Tema 4- Propiedades físico-químicas de las proteínas.

Aislamiento de
proteínas. Determinación de características moleculares de proteínas.

Propiedades ácido – base de proteínas

Las proteínas tienen carácter multidisociable por el elevado número de grupos

ionizables que contienen (el extremo N terminal, el extremo C terminal y las
cadenas R ionizables de los aminoácidos que las forman). Por lo tanto, las
proteínas pueden presentar distintos estados de ionización en función del pH al
que se encuentren.

Se define como punto isoeléctrico de una proteína el pH al cual la movilidad

electroforética es cero (µ = 0) y punto isoiónico el pH al cual la carga neta global
(el balance global de cargas – y +) es cero (q = 0). Estos puntos suelen coincidir
y los representamos como pI. En algunos casos podría ocurrir que, aunque la
proteína tenga carga neta cero a ese pH, presente cierta movilidad electroforética
al encontrarse en una solución tamponada que contiene iones de bajo peso
molecular con los que interacciona y que enmascaran sus cargas.

De forma general, cuando una proteína se encuentre a pH < pI tendrá carga neta
positiva, cuando el pH = pI tendrá carga neta cero y presentará un mínimo de
solubilidad y cuando se encuentre a pH > pI tendrá carga neta negativa.

Solubilidad de proteínas

La solubilidad de las proteínas está directamente relacionada con su estado de

ionización por lo que va a depender directamente del pH del medio. Otros
factores que afectan a la solubilidad son:

- Temperatura. Entre 0 y 40 ºC la solubilidad de las proteínas aumenta al

aumentar la temperatura, pero a partir de 40 / 50 ºC, la mayoría de las proteínas
se inestabilizan y comienzan a desnaturalizarse.

- Concentración salina. Dependiendo de su concentración, las sales ejercen dos

efectos contrarios sobre la solubilidad de las proteínas:
 Efecto “Salting in” o solubilización por salado: a baja concentración, las
sales incrementan la solubilidad de muchas proteínas al cambiar la
tendencia a ionizarse de las cadenas R de los aminoácidos que las
forman.

Efecto “Salting out” o precipitación por salado: cuando la concentración

salina y la fuerza iónica aumentan mucho, la solubilidad disminuye como
consecuencia de la eliminación de las moléculas de agua que solvatan a
las moléculas de proteína, por lo que éstas tienden a precipitar.

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- Adición de ácidos como ácido tricloroacético (TCA) o perclórico (PCA). Estos

ácidos producen la precipitación de las proteínas y se utilizan para eliminarlas de
medios biológicos.

- Adición de disolventes orgánicos como etanol o acetona. Estos disolventes

disminuyen la constante dieléctrica del medio y producen la agregación y
precipitación de las proteínas.

Aislamiento y caracterización de proteínas

Para realizar el aislamiento y la caracterización de proteínas se deben considerar

previamente numerosos factores:

 Elevado número de proteínas en células y tejidos

 Concentración existente de una determinada proteína
 Actividad biológica de cada proteína, pH y temperatura de trabajo

Para la liberación de la proteína de un tipo celular o tejido de partida se pueden

utilizar diferentes técnicas:

 Trituración mecánica u homogenización

 Choque osmótico
 Tratamiento con disolventes
 Tratamiento con enzimas
 Sonicación
Las técnicas para aislar y caracterizar proteínas están basadas en sus
diferencias de:

 SOLUBILIDAD
 CARGA
 TAMAÑO (Pm)
 INTERACCIONES ESPECÍFICAS

Durante los procesos de aislamiento y caracterización de proteínas son

necesarios diferentes métodos de detección:
 Contenido TOTAL de proteínas (inespecífico)
Absorción a 280 nm, Biuret, Lowry, Bradford
 Detección de proteínas específicas
Propiedades estructurales específicas
Funcionalidad

Métodos generales para el aislamiento y la purificación de proteínas

Los métodos que se utilizan para el aislamiento y la purificación de proteínas se

pueden clasificar atendiendo a la propiedad fisicoquímica de las proteínas que
se utiliza para separarlas y poder distinguirlas:
 BASADOS EN LA DIFERENCIA DE SOLUBILIDAD
Precipitación y solubilización por salado
Precipitación isoeléctrica
Fraccionamiento con disolventes
 BASADOS EN LA CARGA ELÉCTRICA
Cromatografía de intercambio iónico
Electroforesis en gel de poliacrilamida
 BASADOS EN EL TAMAÑO MOLECULAR
Electroforesis en gel de poliacrilamida/SDS
Cromatografía de exclusión molecular
Ultracentrifugación
Diálisis
 BASADOS EN LA ESPECIFICIDAD DE LIGANDOS
Cromatografía de afinidad