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EXTRACCIÓN Y PURIFICACIÓN DE PROTEÍNAS.

La mayor parte de las investigaciones bioquímicas requieren la purificación, al menos


parcial, de las sustancias objeto de estudio. Esto requiere generalmente un gran
esfuerzo ya que una célula contiene miles de sustancias diferentes, la molécula que
buscamos puede ser extremamente inestable o encontrarse a concentraciones muy
bajas. En este tema se presenta una visión general de las técnicas más usuales
empleadas para la purificación de proteínas, aunque muchas de ellas son aplicables a
la separación de la mayoría de las moléculas biológicas.

Los recientes avances en genética molecular han aumentado la importancia que


tienen los procesos de recuperación y purificación de proteínas.

A lo largo de los años, el aumento del uso de microorganismos como fuente de


proteínas, particularmente enzimas, ha conducido a la mejora en la eficiencia de
producción y a productos más reproducibles. La gran mayoría de las enzimas de uso
industrial son proteínas extracelulares procedentes de organismos como: Aspergillus
sp. Bacillus sp. e incluye a las enzimas α-amilasa, proteasas y glucoamilasa

Muchas de estas son producidas a partir de cepas silvestres de microorganismos. Sin


embargo, en la producción de proteínas para uso en el campo del diagnóstico clínico
y para aplicaciones terapéuticas, la ingeniería genética y proteica está comenzada a
jugar un papel muy importante día a día. La ingeniería genética además de permitir
enormes incrementos del rendimiento, ha permitido la transferencia del material
genético de animales a bacterias. De esta forma, esos productos sólo disponibles en
pequeñas cantidades en los tejidos animales pueden ser producidos ahora en
cantidades virtualmente ilimitadas a partir de bacterias crecidas de forma muy sencilla.

Las enzimas o las proteínas producidas por los microorganismos pueden ser
intracelulares, periplásmicas o secretadas al medio de cultivo. Para enzimas
extracelulares, el grado de purificación requerido es mínimo y los procesos a gran
escala pueden rendir toneladas de producto proteico.

Muchas otras enzimas sin embargo, son producidos en mezclas intracelulares mas
complejas y representan un mayor desafío implicado en la purificación proteica. Los
productos para un uso terapéutico deben presentar unas características de purezas
muy exigentes y exactas. De nuevo, la ingeniería genética ha sido capaz de ayudar
en esta tarea. En el caso de las proteínas terapéuticas, hay grandes ventajas si la
proteína de interés puede ser secretada, bien al periplasma, bien al medio. Esto
provoca una enorme reducción del nivel de proteínas contaminantes y otras
macromoléculas de forma que se puede obtener el producto puro tras solo dos o
tres pasos de purificación.

Ahora es posible añadir grupos a la proteína los cuales ayudan a su purificación Ya


que confiere propiedades específicas, pudiendo posteriormente eliminar estos grupos
cuando ya no es necesario.

MÉTODOS DE EXTRACCIÓN Y PURIFICACIÓN DE PROTEÍNAS.


LISIS CELULAR

Para obtener proteínas intracelulares de los microorganismos existen tres métodos


generales; enzimáticos, químicos o físicos. No todas las metodologías pueden ser
utilizadas en procesos a gran escala. Quizás el ejemplo mas destacado es la
sonicación, que es el método más empleado en la obtención de proteínas en el
laboratorio.

Métodos enzimáticos de ruptura celular


La lisozima cataliza de forma específica, la hidrólisis de enlaces β- 1,4-glucisidícos
presentes en los mucopéptidos de las paredes celulares de las bacterias. Las
bacterias Gram-positivas son las que presentar mayor sensibilidad a la lisozima. Sin
embargo, la ruptura final de la envoltura celular, depende a menudo de la presión
osmótica del medio de suspensión una vez que se ha digerido la pared.

Métodos químicos de lisis celular

Álcali.
Este método ha sido utilizado con considerable éxito para la extracción de proteínas
bacterianas a pequeña y gran escala.

Detergentes.
Los detergentes, tanto iónicos, como es el caso del lauril sulfato sódico, colato sódico
(aniónico) y el bromuro de cetiltrimetilamonio (catiónico), o no-iónicos.

Métodos físicos de lisis celular

Choque osmótico.
El método implica el lavado del cultivo de bacterias en una solución tampón para tratar
de eliminar los restos del medio de cultivo. El empleo del choque osmótico se está
viendo favorecido con el incremento en el número de proteínas recombinantes que se
secretan al periplasma.
Homogeneización con abrasivos.
Consiste en una cámara que contiene bolsa de vidrio y varios discos fijos y rotatorios.
La suspensión celular se bombea en la cámara, y la rápida agitación es suficiente para
romper incluso las bacterias más resistentes. La cámara de desintegración está
refrigerada para eliminar el calor que se genera.

Tamización sólida
El método implica la extrusión del material celular congelado a través de un orificio de
pequeño diámetro y a una presión elevada, manteniendo la temperatura próxima a
-20°C.
Tamización líquida
Este es ahora el método de ruptura celular de elección utilizado en la lisis a gran
escala de microorganismos, estando muy extendida su aplicación tanto en procesos
industriales como de investigación. Es particularmente útil en la ruptura de células
bacterianas aunque también puede ser efectivo en la rotura de hongos o levaduras.
Las células en una suspensión líquida son forzadas a pasar a través de un orificio de
pequeño diámetro bajo una presión muy elevada.
Para trabajos a gran escala se emplea generalmente un homogeneizador que se
pensó para la producción de emulsiones en la industria lechera.

PURIFICACIÓN INICIAL

Eliminación de restos celulares


Una vez provocada la ruptura celular, la primera etapa en la purificación de una
enzima intracelular es la separación de los restos celulares. La separación de sólidos
de líquidos es una operación clave en el aislamiento de una enzima y normalmente se
lleva a cabo por centrifugación o filtración.

Centrífugas
Existen diferentes centrífugas con rangos de capacidad desde las de menos de 1 ml
hasta aquellas que superan varios litros, capaces de aplicar una fuerza centrífuga
superior a 100.000 g.

Centrífugas de flujo continuo


Debido a los grandes volúmenes de líquido que es necesario manejar al comienzo de
un proceso de purificación enzimática a gran escala, es preferible utilizar una
centrífuga de flujo continuo para eliminar el material particulado.
Existen tres tipos básicos de centrífugas: la centrífuga tipo disco o multicámara, la
centrífuga de cámara hueca y la centrífuga de cestillo.

Centrifugas de cestillo
En el contexto de la purificación de enzimas esto se refiere generalmente a materiales
intercambiadores iónicos, lo cuales han sido empleados apara la adsorción de la
proteína deseada.

Filtración através de la membrana.


Un método alternativo para la clarificación de extractos celulares es la filtración. Sin
embargo, la preparaciones microbianas frecuentemente son gelatinosas y por ello
difíciles de filtrar por los métodos tradicionales a menos que se empleen áreas de
gran tamaño para la filtración.

SEPARACIÓN ACUOSA BIFÁSICA


Los sistemas acuosos de dos fases, típicamente creados almizclar soluciones de
polietilenglicol y dextrano o polietilenglicol y sales especificas como fosfato potásico o
sulfato amonico se pueden utilizar tanto para la separación de proteínas durante la
purificación proteica como para la separación de proteínas de los restos celulares. Este
fenómeno refleja el balance entre los componentes implicados: polímeros, sales,
proteínas y solventes (agua).

PRECIPITACIÓN

Sulfato amónico
La sal más comúnmente empleada es el sulfato de amonio debido a su alta
solubilidad, a la ausencia de toxicidad para la mayor parte de las enzimas y a su bajo
costo. La precipitación de una proteína mediante el tratamiento con una sal depende
de diversos factores: como el pH, temperatura, la concentración de proteínas y la sal
empleada.
Solventes orgánicos
La adición de solventes orgánicos a soluciones acuosas reduce la solubilidad de las
proteínas al disminuir la constante dieléctrica del medio. Siendo los más utilizados el
etanol, la acetona y el 2-propanol, que es el más empleado. Debido a que las
proteínas se desnaturalizan en presencia de solventes orgánicos es aconsejable
trabajar a temperaturas inferiores a 0⁰C.

Polímeros de alto peso molecular


Existen otros agentes precipitantes orgánicos que pueden ser empleados para el
fraccionamiento de proteínas; entre ellos nos encontramos los polímeros
acuosolubles, de los cuales es el polietilenglicol el más ampliamente utilizado.
CROMATOGRAFÍA
La purificación de enzimas por cromatografía ha sido una práctica de laboratorio
durante muchos años. Estos mismos procedimientos cromatograficos pueden ser
empleados de forma similar para el aislamiento de cantidades muy superiores de
proteínas.
La cromatografía es la única metodología con la selectividad suficiente para purificar
una proteína de una mezcla proteica compleja con un grado de purificación final
superior al 99,8%.

Optimización del salto de escala y de la calidad del proceso


El propósito principal en la cromatografía preparativa es la purificación de grandes
cantidades de proteína en el menor tiempo posible. Los flujos suelen ser elevados ya
que la velocidad de procesamiento es más importante que la resolución.
El salto de escala en la separación cromatografica es, en principio, sencillo, ya que la
teoría de esta metodología señala que el diámetro de la columna no presenta un
efecto importante sobre la resolución, de forma que bastaría con incrementar el
diámetro de la columna para provocar el salto de escala.
Antes de realizar un proceso a gran escala es importante que el proceso de
purificación que se ha de efectuar este optimizado y totalmente estudiado a nivel de
laboratorio. La búsqueda inicial de las condiciones ideales en una técnica de adsorción
debe efectuarse empleando diferentes adsorbentes bajo diversas condiciones de pH y
fuerza iónica. Se pueden poner a punto métodos cromatograficos adecuados
utilizando tanto equipos convencionales de baja presión como de elevada presión, con
grandes prestaciones.

Selección de la metodología
Para obtención y separación de proteínas a gran escala se puede emplear cualquier
de las técnicas cromatrograficas disponibles: filtración a través de geles, intercambio
iónico, interacción hidrofóbica , afinidad, inmunoafinidad, y electroenfoque.

Tabla 1 métodos cromatografico para la purificación de proteínas a gran escala


Característica Tipo de Características Aplicación
molecular cromatografía
aprovechada
Tamaño Gel filtración Resolución moderada para el El fraccionamiento es mejor
fraccionamiento y buena para en las últimas etapas de la
tampones intercambiadores. purificación. En cualquier
Capacidad limitada por el momento puede ser utilizado
volumen de la muestra. los tampones
intercambiadores y podrá
existir una limitación respecto
al volumen de la muestra.
Carga Intercambiador La resolución puede ser alta. Es más efectiva en las
iónico Capacidad alta no limitada por primeras fases del
el volumen de la muestra. La fraccionamiento cuando se
velocidad puede ser muy van a manipular grandes
elevada dependiendo de la volúmenes.
matriz.
Cromatoenfoque La resolución puede ser alta.Es mejor usarla en una
La capacidad puede ser alta. purificación posterior, ya que
La velocidad puede ser alta. las matrices son caras.
Polaridad Interacción Resolución buena. Capacidad Puede ser utilizado en
hidrofobica muy alta y no limitada por elcualquier fase, pero es mejor
volumen de la muestra. aplicarla cuando la fuerza
Velocidad alta. iónica es alta tras la
precipitación con sales o
después de un intercambio
iónico.
Afinidad afinidad La resolución puede ser Puede emplearse en
biológico elevada. Capacidad puede ser cualquier etapa, aunque
alta o baja, dependiendo de normalmente no es
ligando y no limitada por el recomendable en las
volumen de la muestra. primeras fases.
Velocidad elevada.

En este sentido, etapas en las que se produce una concentración del producto, como
es la cromatografía de afinidad, hidrofobica o de intercambio iónico deben realizarse
antes que aquellas que causan una dilución, como es el caso de la filtración a través
de geles. La cromatografía de interacción hidrofobica puede realizarse posteriormente
a una de intercambio iónico con un cambio mínimo en el tampón, puesto que la
mayoría de las proteínas se unen mas fuertemente a un soporte hidrofobica a fuerzas
iónicas altas.

LA CROMATOGRAFÍA DE AFINIDAD ES CAPAZ, POR SI SOLA, PARA LLEVAR A


CABO LA PURIFICACIÓN DE PROTEÍNAS A ESCALA DE LABORATORIO.

Elección de la matriz
Quizás la decisión mas importante que se debe tomar cuando se diseña un proceso de
purificación a gran escala sea la concerniente a la selección del tipo de matriz de
cromatografía. Una matriz de cromatografía a gran escala deberá ser hidrofilica,
macroporosa, rígida, con partículas esféricas, químicamente estable, ligandos
delicados y de fácil modificación.
Tabla 2. Propiedades de las matrices cromatográficas básicas.
Tipo de Matriz Porosidad Adsorció Rigide Estabilida Facilidad Coste
n z d de relativo
no- modificació
específic n
a
Dextrano con enlaces Baja Baja Baja Buena Buena Bajo/medio
entrecruzados
Poliacrilamida con Baja Baja Baja Buena Buena Medio
enlaces entrecruzados
Agarosa Alta Baja Baja Deficiente Buena Medio
Agarosa con enlaces Alta Baja Media Buena Buena Medio
entrecruzados
Compuesto Alta Media Media Buena Buena Medio
Poliacrilamida/Dextrano
Compuesto Media Baja Media Buena Buena Medio/alto
Poliacrilamida/Agarosa
Polímero acrílico Media Media Media Buena Buena Medio
hidroxilado
Copolímero etilenglicol- Baja/media Media Media Buena Buena Medio
metacrilato
Celulosa Media/alta Alta Baja Buena Buena Bajo
Sílice porosa Baja/media Alta Alta Deficiente Deficiente Alto
Polímero orgánico Media/alta Baja Alta Buena Buena Alto
rígido

Gel filtración
Éste tipo de separación se basa en el tamaño molecular. La fase estacionaria esta
formada por bolas porosas rodeadas de una fase solvente móvil. Cuando se añade la
muestra, las moléculas de la mezcla se reparten entre los poros del gel del solvente.

Cromatografía de intercambio iónico


Tradicionalmente para el fraccionamiento de proteínas se han empleado los
intercambiadores iónicos basados en compuestos de celulosa con diversos
sustituyentes;
Tabla 4. Sustituyentes en intercambiadores iónicos
Intercambiador anionico
Amina cuaternaria (Q) -CH2-N+-(CH3)3
-O-CH2-CH2-N+-
Amino etilo cuaternario (QAE)
(C2H5)3
-O-CH2-CH2-N+-
Dietilaminoetilo (DEAE)
(C2H5)2

Los intercambiadores celulósicos iónicos son ideales para diversas operaciones como
primera etapa en varios procesos.

No es posible usar habitualmente en procesos a gran escala estas columnas de


celulosa, debido a que no pueden soportar grandes velocidades de flujo y a que sufren
cambios de volumen si se producen cambios de pH o fuerza iónica siendo muy
complicado regenerarlas sin volver a empaquetar la columna.

CROMATOGRAFIA DE AFINIDAD
La cromatografía de afinidad es quizá el método de purificación más elegante para
obtener una proteína a partir de una mezcla compleja. Aunque se usa ampliamente en
el laboratorio, solo en los últimos años parece aceptable en purificaciones a escala
industrial.
Esta metodología se basa en la interacción de una proteína con un ligando
inmovilizado. El ligando puede ser bastante especifico para una proteína particular, por
ejemplo un sustrato, un análogo del substrato, un inhibidor, o un anticuerpo. Existen
alternativas en las que el ligando es capaz de interaccionar con una variedad de
proteínas, en este caso del NAD, AMP, ADP, colorantes, o cadenas de hidrocarburos.

Cromatografía de interacción hidrofóbica


Este tipo de cromatografía se desarrolla al comprobarse que las proteínas se retienen,
de forma inesperada, sobre geles de afinidad con cadenas espaciadoras
hidrocarbonadas.
Las interacciones hidrofóbicas son más fuertes a fuerza iónica alta, con lo que, a
menudo, la absorción puede ser llevada a cabo tras la precipitación salina o la
cromatografía de intercambio iónico, sin necesidad de modificar la concentración
salina de la muestra. Las proteínas ligadas se puede eluir alterando el pH del
solvente, la fuerza iónica o mediante el empleo de un agente caotropico o un
modificador orgánico tal como el etilenglicol.
Los iones utilizados se pueden agrupar en series dependiendo de si promueven
interacciones hidrofóbicas (efecto de eliminación de sales) o si se rompe la estructura
del agua (efecto caotropico) para debilitar la fuerza de interacción hidrofóbica.

Cromatografía líquida de gran resolución


Uno de los mayores avances en cromatografía ha sido el desarrollo de matrices de
relativamente bajo tamaño de partícula con gran capacidad de resolución y que sean
capaces de trabajar a altas presiones.

ULTRAFILTRACION
La ultrafiltración ha sido una técnica de uso corriente en el laboratorio para la
concentración de soluciones proteicas en condiciones muy suaves. También es una
alternativa para la diálisis y filtración a través de geles para la eliminación de sales o
los cambios de tampones.

DISEÑO DE PROTEINAS PARA SU PURIFICACION


Los factores presentes en pasos previos a la purificación de las enzimas, tienen un
gran impacto en su desarrollo y los métodos de purificación, así, la tecnología de DNA
recombinante ha tenido un gran impacto en la purificación.
La fusión de un gen de interés a secuencias promotoras eficientes hace que una
proteína heteróloga se exprese en un organismo madre hasta un total de un 10 al 40%
de la proteína soluble total de la célula en comparación con la expresión de muchas
proteínas naturales de la células, que constituyen un 0,01 a un 4% de la proteína total
celular.
De esta forma, la purificación final se simplifica. Estos altos niveles de expresión
pueden provocar que la proteína se produzca como gránulos denso e insolubles
denominados cuerpos de inclusión. Los problemas de purificación de fusiones por
afinidad son, en 1 lugar los derivados de las condiciones necesarias para la posterior
elución y, en 2 lugar, los inherentes al eliminación de la cola de afinidad una ves que
sea purificada la proteína.

CONCLUSION
La electroforesis constituye parte importante del procedimiento rutinario del análisis de los ácidos
nucleicos y proteínas. Y así como el microscopio permite visualizar microorganismos y estructuras
similares, la electroforesis nos ayuda a observar los ácidos nucleicos y proteínas (de los cual se trato este
trabajo) al final del procedimiento.

El principio básico de la electroforesis consiste en la migración de las moléculas a través de un gel u otro
tipo de matriz de naturaleza porosa, en el cual, por acción de un campo eléctrico, serán separadas de
acuerdo a su tamaño o peso molecular. Para controlar el avance de la separación de las moléculas en la
matriz y establecer un patrón de fragmentos, las moléculas deberán ser teñidas con diferentes colorantes.

Estos pasos facilitan la visualización de las moléculas a manera de simples bandas las cuales serán
posteriormente analizadas e interpretadas.

En biología molecular, la mayoría de los estudios básicos y aplicados requieren el uso de la electroforesis;
sin embargo, este procedimiento presenta variaciones de acuerdo al tipo de estudio que se piensa
ejecutar. En la electroforesis de tipo vertical, se analizan tanto moléculas de ADN como proteínas,
mientras que en la electroforesis
horizontal generalmente se trabaja con ADN o ARN. De otro lado, existen otros métodos electroforéticos
que presentan ciertas modificaciones, así tenemos la electroforesis en campo pulsado, mayormente
usada para separar fragmentos
muy grandes de ADN (ADN genómico), la electroforesis bidimensional para un análisis más sofisticado de
las proteínas etc.

Es importante señalar que la electroforesis en asociación con otras técnicas tales como PCR, e
hibridación, brinda una gran ayuda en el campo de la salud. Gracias a esta técnica es posible visualizar
las bandas de ARN o ADN de patógenos, detectar cambios o mutaciones a nivel genético, visualizar una
nueva proteína, entre otros.

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