LABORATORIO DE BIOCONVERSIONES

Práctica 3
SEPARACIÓN Y PURIFICACIÓN DE
ENZIMAS

INTRODUCCIÓN
Las enzimas se encuentran formando parte de mezclas complejas, usualmente en
el interior de células que además poseen cientos deotras enzimas. Pueden formar
parte de agregados moleculares, complejos conotras enzimas, proteínas inertes,
ácidos nucleicos, polisacáridos o lípidos. Paraestudiar una en particular, se hace
indispensable entonces un proceso de purificación.

Extracción de enzimas
Las condiciones para extraer las enzimas y pasarlas a solución son a menudo críticas
y requieren el estudio de muchas variables. Es necesario destruir las células,
eventualmente las estructuras subcelulares y disociar las enzimas de otras moléculas.
El primer paso consiste en la obtención de un homogenizado,que implica lisis celular
y transferencia de las enzimas a solución o suspensión. Puede llevarse a cabo por:
a) Homogenización mecánica: puede utilizarse un homogeneizador de vidrio,
mortero, licuadora, a veces con la ayuda de abrasivos como alúmina, arena o
bolitas de vidrio y con un solvente adecuado.
b) Homogeneización sónica: el choque de ondas sónicas o ultrasónicas provoca
cambios de presión de miles de atmósferas, que rompen la pared celular. Se usa
generalmente para bacterias y levaduras.
c) Desintegración térmica: El congelamiento y descongelamiento rápidos y
repetidos suelen usarse para desintegrar bacterias y eritrocitos. Por congelación se
forman cristales de hielo intracelulares, destruyendo la estructura. Al descongelarse,
las células se destruyen osmóticamente.
d) Desintegración química: se utilizan agentes que atacan la pared celular.
e) Homogeneización por deshidratación: se basa en la precipitación de
proteínas por solventes orgánicos.

En el siguiente diagrama se puede apreciar en desglose, la precipitación de

enzimas.

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Homogenado (600-900
xg/10-15 min)

Sobrenadante (Extracto libre de

Precipitado (restos
células --> 8,000-1,0000 xg / 20-
celulares, núcleos)
30 min)

Precipitado Sobrenadante (Enzimas

(mitocondias y lisomas) solubles --> 105,00 xg / 60 min)

Precipitado (Mitrocondria, Sobrenadante (Enzimas

ribosomas, retículo
solubles)
endotelial)

Purificación de enzimas por métodos de precipitación.

Las diferencias en comportamientos de solubilidad han sido usadas por más de 50 años
para la separación de proteínas (Weatherley, 1994). Actualmente, la precipitación es
usualmente utilizada como un paso de separación durante las primeras etapas de un
proceso de purificación, y normalmente es seguida por otro tipo de separaciones, como
la cromatografía. La precipitación puede ser utilizada también como método de
concentración de proteínas como paso previo a un proceso de purificación (Harris y Angal,
1995). La precipitación de proteínas es obtenida por la adición de sales, inducida por el
cambio de pH o potencial iónico, o por adición de solventes, ya sean orgánicos, inertes o
polímeros. Los precipitados pueden ser recuperados por filtración o centrifugación, por
lavado o por resuspensión en un buffer adecuado (Harris y Angal, 1995).

Precipitación por salado o “salting-out”.

La proteína no es desnaturalizada y la actividad enzimática es recuperada mediante la
resuspensión del pellet; adicionalmente, las sales pueden estabilizar las proteínas contra
la desnaturalización, la proteólisis o la contaminación bacteriana, características que
hacen de este método una alternativa fácil y confiable para la separación de proteínas
(Harris y Angal, 1995).
La causa de la precipitación por salado difiere a la causada por el ajuste del pH, lo que
lleva a que estas técnicas sean usadas una tras otra con el fin de maximizar la purificación
de las proteínas deseadas. El salting-out depende de la naturaleza hidrofóbica de la
superficie de la proteína. Los grupos hidrofóbicos predominan en el interior de ésta, pero
algunos se localizan en diferentes regiones de la superficie; el agua es puesta en contacto
con la superficie, haciendo que estas regiones no queden expuestas; cuando la sal es
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agregada, el agua solvata los iones de la sal, y mientras la concentración de sal se

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incrementa, el agua es removida de los alrededores de la proteína, eventualmente
exponiendo las regiones hidrofóbicas. Dichas regiones en las proteínas pueden
interactuar mutuamente o con las de otras moléculas, resultando en una aglomeración.
De esta forma las proteínas con regiones hidrofóbicas más abundantes formarán
agregados y se precipitarán más rápidamente que aquellas con pocas regiones
resultando un fraccionamiento (Harris y Angal, 1995).

Purificación por diálisis

En la purificación por diálisis se debe colocar la muestra que contiene el extracto
enzimático en una bolsa o tubo de membrana semipermeable y se cierran los extremos,
con el fin de separar las moléculas pequeñas de las grandes en solución, basándose en
diferentes velocidades de difusión a través de una membrana.
La bolsa que contiene la solución, se sumerge en agua destilada y se mantiene en
agitación constante durante 24 horas, durante este tiempo la membrana permite que las
moléculas pequeñas se difundan al agua exterior, dejando en el interior de la bolsa, las
moléculas más grandes. (Bender 1990).

Análisis de datos.
Para juzgar si un método de purificación es adecuado, deben calcularse la
recuperación y el grado de purificación alcanzados.
Considerando las unidades enzimáticas totales de la etapa inicial como el 100%
puede calcularse el rendimiento de cada etapa refiriendo las unidades totales de cada
paso a las iniciales. Para calcular el grado de purificación, debe obtenerse primero el
valor de actividad específica alcanzado en cada paso. Si seconsidera la actividad
específica inicial como unidad de purificación, el grado de purificación de cada etapa
se calcula haciendo el cociente entre la actividad específica de dicha etapa y la del
primer paso.

OBJETIVOS

OBJETIVO GENERAL
El alumno aprenderá los procesos de extracción y purificación de enzimas.

OBJETIVOS ESPECIFICOS
• Extraer la enzima del caldo de cultivo y concentrar la enzima.
• Determinar cantidad de enzima por determinación de proteína

MATERIALES Y EQUIPO
• Centrifuga
• Matraz Earlenmeyer de 250 𝑚𝐿 (por equipo)
• Tubos eppendorf
• Potenciómetro (por grupo)
• Vaso de precipitado de 250 𝑚𝐿 (por equipo)
• Espectrofotómetro
• Celdas de UV-Vis

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• Micropipetas de 2-20 y 100-1000 𝜇𝐿
• Gradillas para tubos eppendorf
• Sulfato de Amonio
• Buffer de fosfatos pH 7 (amilasa)
• Reactivo Bradford

DESARROLLO EXPERIMENTAL
1. El cultivo obtenido de la práctica anterior se coloca en tubos Falcón nivelados,
los cuales son colocados en la centrifuga por 7 minutos a la velocidad máxima del
equipo.
2. Después de este tiempo se separa el sobrenadante, el cual es colocado
nuevamente en tubos Falcón y se le agrega sulfato de amonio hasta obtener
precipitación; al final se centrifuga por 7 min a la velocidad máxima del equipo.
3. El precipitado obtenido se resuspende en 5 𝑚𝐿 en una solución buffer de
fosfatos (pH =7)
4. Realizar una diálisis para eliminar el exceso de sales.
5. Determinar concentración del metabolito de estudio.

CUESTIONARIO POST-LABORATORIO
1. Menciona tres métodos de precipitación de enzimas.
2. ¿Cuáles son las condiciones de centrifugación que se emplean industrialmente
(T y rpm)?
3. ¿Cuáles son los métodos para lisis para liberar enzimas intracelulares?
4. Investigue por lo menos un método cromatográfico para separar enzimas
5. Investigue el uso de membranas en la purificación de enzimas

REFERENCIAS
• Dubois, T., Jacquet, A., Scheneck, A. G. and Looze, Y. (1988). The thiol
proteinases from the latex of Carica papaya L. I. Fractionation Purification and
Preliminary Characterization. Biological Chem Hoppe- Seyler. 369: 733-740.
• Jeremy Mark Berg, Lubert Stryer, Jeremy Berg, John Tymoczko. (2008).
• Bioquimica. Editorial Reverté. 217-225.
• Segel H. Irwin. (1976). Biochemical Calculations “How to solve mathematical
problems in general biochemistry”. John Wiley & Sons, Second Edition.
• HARRIS, E. L. V., ANGAL, S. (1995) Protein purification methods. A practical
approach. 6th edition, Oxford University Press, New York, p. 151-156
• WEATHERLEY, L. R. (1994) Engineering Processes for Bioseparations.
ButterworthHeinemann, Oxford, p. 73-90; 202-216

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