La purificación de proteína es una serie de procesos que permite aislar un solo tipo de

proteína de una mezcla compleja , es decir , retener la mayor cantidad de proteína funcional
con el menor número de contaminante .Es fundamental para la caracterización de la función,
estructura y interacciones de la proteina ,por ejemplo una enzima ,un receptor celular o un
anticuerpo .Hay varios pasos en el proceso de la purificación ,puede liberar a la proteína de la
matriz que lo confina ,separar las partes proteica y no proteica de la mezcla y finalmente
separar la proteína deseada de las demás .El proceso de purificación de una proteína , se da a
lugar mediante la extracción de extracto proteico que es el aislamiento de una proteína ,lo
cual significa extraerla de la célula e incluirla en una solución ,Para obtener el extracto
proteico se debe romper la membrana celular,sin embargo algunas células requieren que
algún tipo de ruptura mecánica para liberar su contenido.

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Pero porque purificar una proteína , pues por varias cosas que han servido a lo largos de los
años, como para PRECISAR SECUENCIAS DE AMINOÁCIDOS , ESTABLECER RELACIONES
EVOLUTIVA , INVESTIGAR LA FUNCIÓN BIOQUÍMICA, ESTABLECER RELACIONES
ESTRUCTURA-FUNCIÓN Y TAMbien EN APLICACIONES TERAPÉUTICAS O BIOTECNOLÓGICAS
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1-OBTENCIÓN de un extracto crudo de proteínas.
Cuando uno desea purificar una proteína a partir de una célula se debe tener en cuenta que
para preparar un extracto celular, si la proteína en cuestión fue sintetizada para operar en
un ambiente extracelular o si su función la cumple dentro de la célula .

Como vemos aquí , será intracelular , cuando su función sea dentro de la celular y
extracelular cuando sea fuera de la célula.Para realizar estas extracción se realizará
mediante procesos de lisis.Este proceso permitirá Minimizar la desnaturalización de la
proteína,Permite cierta selectividad Y Libera ácido nucleicos

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En el caso de proteínas extracelulares, la tarea es mucho más sencilla ya que, en general,

estas moléculas han sido diseñadas para operar en un ambiente hostil, como lo es el medio
extracelular, y además, generalmente se encuentran en un porcentaje relativamente alto
respecto al total de proteínas. Algo muy diferente ocurre en el ambiente intracelular, donde
una proteína citoplasmática o que se halla en el interior de una organela, está menos
accesible, y hay que romper las células y/u organelas para obtener la proteína.

El primer paso (1) consiste en elegir la muestra biológica de partida, esta puede ser células
en suspensión (cultivo) o tejido total. Después (2) se requiere seleccionar la solución
amortiguadora adecuada para realizar la ruptura del tejido y la extracción de la proteína total
en su forma soluble sin afectar las características estructurales y funcionales de la proteína
de interés. En este paso se recomienda trabajar a 4ºC, de forma rápida y en presencia de
inhibidores de proteasas para proteger a las proteínas de la degradación. Determinar el
método que se empleará para lisar la membrana celular (3). Estos métodos pueden ser
físicos como (A) la homogenización manual o mecanizada, (B) la sonicación o ciclos de
congelación y descongelación (C), o bien ser químicos como el uso de detergentes como el
Tritón X-100 (D) o la lisis por choque osmótico, por ejemplo, los eritrocitos al diluir su medio
con agua y hacer más hipotónica la solución en la que se encuentran hasta generar que se
hinchen y revienten (E). Se puede emplear más de un paso de extracción y la combinación
de métodos químicos y físicos. El aclaramiento (4) consiste en separar fragmentos celulares
de las proteínas solubles mediante centrifugación. Finalmente se cuantifica la cantidad de
proteína en el extracto usando un espectrofotómetro (5). El extracto es la muestra (6) de la
que se parte para aplicar una o varias técnicas de purificación de proteínas. Determinación
de la concentración de proteína, se puede medir directamente, mediante la absorbancia
a 280 nm en un espectrómetro UV, o indirectamente, usando métodos colorimétricos
como ensayos de BCA o Bradford
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Salazón o Salting out , este método es cuando se aumenta la fuerza iónica de una solución
proteica añadiendo sal .La solubilidad disminuye y precipitados de proteína..En la
precipitación por insolubilización se emplean sales disociables.Diferentes tipos de sales
neutras o ligeramente ácidas son utilizadas para la solubilización precipitación o
fraccionamiento de proteínas: están incluidas es NaCL(cloruro de sodio, así como el KCL y
CaCl2 cloruro de calciclo a diferentes concentraciones y combinación de pH, se pueden
usar diversas sales , pero no hay mejor que el Sulfato de amonio , debido a que tiene
ventajas de su alta solubilidad a bajas temperaturas , baja densidad de solución que no
interfiere con la sedimentación por centrifugación de la mayoría de las proteínas
precipitadas, también tiene un bajo costo, ausencia de efectos desnaturalizantes y en
soluciones concentradas previene o limita el desarrollo bacteriano

El sulfato de amonio, tienen efectos generales sobre la estructura del disolvente que
conducen a la disminución de la proteína solubilidad y salting out, en este caso , las
moléculas de proteína tienden a asociarse entre sí porque las interacciones
proteína-proteína con energéticamente más favorable que la proteína-solvente interacción.

Las proteínas tienen puntos característicos , y estos se utilizan en separaciones de

proteínas en extractos crudos.
Alguna aplicacion, por ejemplo ,Como las proteínas tienen diferentes de composición
aminoácidos , las moléculas de proteínas precipitan a diferentes concentraciones de
solución salina, y la proteínas que no son deseadas se pueden eliminar de una mezcla de
solución de proteína mediante el Salting out , y cuando la solubilidad de la proteína en
diferentes concentraciones de solución salina se desconozca .

EXPLICACIÓN CON IMAGEN CELESTE:

La región más eficaz de salting out es el punto isoeléctrico de la proteína porque todas las
proteínas exhiben solubilidad mínima en soluciones de resistencia iónica constante en sus
puntos isoeléctricos

IMAGEN DE ABAJO
La mayoría de las proteínas son menos solubles a altas concentraciones un efecto llamado
salting out.
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SI TENEMOS UNA CONCENTRACIÓN PROTEICA
Donde la fuerza iónica no es demasiada alta ,y ha notado que con un aumento leve en la
contratación de sal ,el aumento de la solubilidad , y que no hay precipitación visible en el
tubo, y pues todo es soluble ,

Al segundo se le agrega una solución de sal con fuerza iónica muy alta y es una solución
muy concentrada, en este caso se puede observar que sin aumentar la solubilidad ,la
solubilidad disminuye y que hay un sedimento visible .
Por lo que si se traza una gráfica

Solubilidades vs Sal, la concentración

Inicialmente se observa un aumento de la solubilidad con aumento de la concentración de
sal , pero luego con el aumento de la concentración de sal hay una disminución de la
solubilidad .EL PRIMER FENÓMENO ES SALTING IN , con aumento de sal ,aumento de
solubilidad , EL SEGUNDO SERÍA EL SALTING OUT, con una concentración de sal muy
alta , las proteínas se precipitan

DIÁLISIS:

La diálisis es una forma de filtración molecular utilizado para la precipitación , este proceso
se realiza debido a que ,la sal puede interferir en los procesos de purificación y puede
alterar las propiedades biológica de la proteína

Es un proceso que separa moléculas de acuerdo con su tamaño, mediante el empleo de

membranas semipermeables que contienen poros de dimensiones inferiores a las
macromoleculares. Estos poros permiten que moléculas pequeñas, tales como las de los
disolventes, sales y metabolitos pequeños, se difundan a través de la membrana pero
bloquean el tránsito de moléculas mayores.

La diálisis se emplea rutinariamente para cambiar el disolvente en el que se encuentran

disueltas las macromoléculas. Una disolución macromolecular se introduce en el saco de
diálisis, que se sumerge en un volumen relativamente grande de disolvente nuevo. Las
moléculas pequeñas pasan a través de la membrana al fluido externo hasta que se alcanza
el equilibrio, las macromoléculas permanecerán en el interior del saco de diálisis. El proceso
puede repetirse varias veces a fin de sustituir completamente un sistema disolvente por otro

Existen factores que afectan la velocidad de la diálisis: Solvente: Solución acuosa: en

general, la velocidad de diálisis es mayor en agua destilada, sin embargo en muchos casos
para estabilizar moléculas objeto de investigación es necesario utilizar soluciones de fuerza
iónica y pH definidos. Solución de una macromolécula: durante la diálisis penetra agua en
el saco por ósmosis, por lo tanto el tubo debe llenarse completamente con el fin de evitar la
dilución del contenido.

Condiciones físicas: Temperatura: entre más alta sea la temperatura, mayor será la
velocidad de diálisis. A temperaturas elevadas, la viscosidad del solvente es menor y la
velocidad de difusión aumenta

En la diálisis como podemos observar en la imagen superior derecha ,se usa una bolsa que
tenga poros lo suficientemente pequeños para impedir el paso de moléculas grandes
(proteínas), pero lo bastante grandes, como para que las moléculas pequeñas puedan
pasar a través de ellos. Dentro de la bolsa se coloca alguna fracción del homogenado y se
cierra herméticamente. El sistema así construido se pone dentro de un recipiente con agua
destilada, que se renueva continuamente.

Bajo estas condiciones se tiene una diferencia de concentraciones, entre el líquido del
interior de la bolsa y el agua destilada, y va a existir una tendencia a igualar las
concentraciones, por lo que las moléculas del interior van a tratar de salir hacia el agua
destilada, pero como las moléculas de proteína no pueden pasar por los poros, solamente lo
harán las moléculas pequeñas, el transporte de materiales seguirá hasta que se igualen las
concentraciones en los dos compartimentos.

En la imagen de abajo ,se tiene como primer paso , colocar la mezcla de proteínas dentro
una membrana de celofán , y después de varios cambios en la solución externa a la bolsa y
varias horas queda en equilibrio
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Cromatografía de exclusión molecular (filtración en gel)

La cromatografía de filtración en gel es una técnica que permite separar

moléculas en función de su tamaño molecular.

La capacidad separadora reside fundamentalmente en el gel cuya matriz

consta de un gran número de esferas porosas microscópicas

. Cada gel se caracteriza por un rango de fraccionamiento que depende del

tamaño de sus poros. Estas esferas están constituidas por largas cadenas de
polímeros unidas entre sí por enlaces químicos para formar una red
tridimensional.

Las moléculas cuyo rango de tamaño se encuentra entre las muy grandes seran
excluidas del gel y las muy pequeñas . puede penetrar los poros en diferente grado
,de acuerdo a su tamaño .

El acceso a los poros de gel está limitado por efectos estéricos

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Observando nuevamente con las 3 moléculas de diferentes tamaños , las moléculas
más grandes, osea la rojas no pueden entrar a los poros , por lo que no son
retrasadas y salen rápidamente .

(Explica la hoja)

De esta forma se evidencia la separación de la mezcla en tres fracciones

conteniendo moléculas de diferente tamaño.

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Los factores que influyen en la separación Además de la diferencia intrínseca esta:
- Longitud de la columna. La capacidad de separación de sustancias de diferente
tamaño aumenta con la longitud de la columna.

- Flujo. La resolución de la separación disminuye al aumentar el flujo del líquido con

que son arrastradas las moléculas a lo largo de la columna.

- El volumen de la muestra a cromatografiar. Debe ser pequeño comparado con el

volumen total de la columna. Las mejores separaciones se obtienen aplicando
volúmenes de muestra iguales o menores al 5% del volumen total.

- Empaquetado del gel en la columna. Las propiedades separadoras del gel se

alteran profundamente, e incluso desaparecen, cuando un gel no está empaquetado
homogéneamente en la columna o se encuentra excesivamente comprimido.

Mayor masa molecular eluye primero

El gel retiene partículas de menor masa molecular
y estos serían Principios básicos de la cromatografía de exclusión molecular., que
aquí las moléculas son separadas de acuerdo a su peso molecular.

Las moléculas pequeñas penetran en los pequeños conductos que presentan las
bolas de gel , donde la velocidad de flujo de solvente es menor.
Las moléculas grandes, incapaces de penetrar en los pequeños conductos de bolas
de gel se mueven entre ellas, donde la velocidad de flujo de solvente es superior.
Como consecuencia , las moléculas de mayor peso molecular son eludidas antes
que las de menor peso molecular.

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Cromatografía de intercambio iónico.

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Un intercambiador iónico es, por lo general, un polímero que tiene grupos cargados
unidos. La mayoría de las proteínas son estables dentro de un margen de pH
determinado (es decir, hay un margen en el que no se desnaturalizan), en el que
están cargadas positiva o negativamente.
 La cromatografía de intercambio iónico se usa comúnmente como un paso
intermedio en un esquema de purificación de proteínas, este proceso permite
separar las proteínas en función de su carga neta de superficie a través de
interacciones electrostáticas que ocurren entre las proteínas y la fase estacionaria
cargada
:
Existen dos tipos de cromatografía de intercambio iónico:
Catiónico: Donde las proteínas cargadas positivamente se unen a una fase
estacionario con carga negativa
Aniónico: Aquí las proteínas están cargadas negativamente , se unen a una fase
estacionaria positivaMENTE
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La cromatografía de intercambio iónico separa las proteínas de acuerdo con su

carga neta, la cual depende de la composición de la fase móvil.

Por otro lado,en la fase estacionaria el material que permanece dentro de la

columna cromatográfica durante la cromatografía y que retiene algún componente
de la muestra, posee una gran área superficial y puede ser un sólido o un líquido
dispuesto sobre un sólido que actúa como soporte.
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Para el procedimiento de la cromatografía de intercambio iónico

Es importante ,saber que la fase estacionario primero será equilibrada con un buffer
de baja fuerza iónica, cuando el equilibrio se ha logrado ,toda la fase estacionario se
encuentra asociada a iones complementarios

A continuación la muestra proteína es sembrada sobre la fase estacionario en el

mismo buffer de baja fuerza iónica , esta proteína unida se lava abundantemente
con un buffer de alta fuerza iónica o de diferente ph ,

posteriormente , los iones complementarios con el buffer de elusión , interactúan con

la fase estacionaria cargada desplanzando a la proteína unida ,y finalmente se
genera un cambio más drástica en el ph, y la concentración salina con el fin de
remover las partículas que aún se encuentra unidas a lo iones complementarios de
la fase estacionario

En la parte de la regeneración , por último, se remueven las partículas que aún están
asociadas al intercambiador.se pueden regenerar a su forma inicial para reanudar la
operación de intercambio. Así, el intercambio iónico es un proceso cíclico y no
continuo.

El principio de esto es que las moléculas cargas se adhieren a los intercambiadores

de forma reversible de modo que dichas moléculas pueden ser unidas o desunidas
cambiando el ambiente iónico.
La separación mediante intercambiadores iónicos se realiza por lo general, en dos
fases: en la primera las sustancias a separar se unen al intercambiador utilizando
condiciones que originan una unión fuerte y estable; a continuación, se eluye de la
columna con buffers de diferentes pH o diferente fuerza iónica.

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CROMATOGRAFÍA DE AFINIDAD Y DE ALTA PRESIÓN

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cromatografía de afinidad

Implica que la fase estacionaria CONTIENE CIERTAS ESTRUCTURAS químicas

,que se les llama ligando ,estos tienen una formación específica para que sean
adheridas fácilmente a las estructuras cuaternarias o terciarias de las proteínas de
interés. Simplemente se adiciona la mezcla de proteínas ,la proteína de interés
van a ligar fácilmente a esos ligando y serán separadas y la otras proteínas
son extraidas , si se desean extraer esas proteinas de interes se le agrega
solución de ligando lo cual lo ,que hace es sustituir o reemplazar a la mezcla
de proteínas de interés y ligando .
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cromatografía líquida de alta

presión (HPLC).

Esta técnica es considerada una de las técnicas de purificación más versátiles y

confiables teniendo una amplia aplicación en la investigación química, bioquímica y
clínica, entre otras, para la determinación de la pureza de sustancias, el
aseguramiento de la calidad de productos farmacéuticos, etc.

Esta técnica de separación y análisis consiste en hacer pasar una muestra líquida o
sólida disuelta en un disolvente adecuado junto con una fase líquida móvil por una
columna cromatográfica.

Esta columna se caracteriza por encontrarse muy empaquetada, por lo que es

necesario ejercer elevadas presiones para que el proceso no se alargue
excesivamente en el tiempo. La separación de los componentes de la mezcla se
efectúa gracias a interacciones de éstos con la fase móvil y estacionaria.

En el equipamiento: El disolvente elegido ha de ser compatible con la muestra a

analizar y ofrecer unas buenas características de separación, para ello pueden
utilizarse eluciones isocráticas, un solo disolvente o una mezcla fija de ellos, o variar
su composición a lo largo del proceso en las llamadas eluciones con gradiente. En
ambos casos se necesitan depósitos adecuados para albergar los disolventes.

Generalmente, estos reservorios se encuentran asociados a una serie filtros y

mecanismos de eliminación de gases que excluyen posibles partículas y gases que
 pueden afectar al proceso cromatográfico obstruyendo la columna y/o alterando los
registros.
La fase estacionaria en HPLC presente en la columna se ha caracterizar por ser estable y
resistente a altas presiones. Generalmente estos rellenos suelen ser inorgánicos como
partículas de sílice, alúmina (óxido de aluminio) o vidrio.

En la salida de la columna podemos encontrar un dispositivo de detección que nos

identificará los solutos presentes en la fase móvil. Han de ser sensibles a pequeñas
variaciones,

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Electroforesis e isoelectroenfoque.

Hay otra técnica que es la electroforesis .Se basa en el movimiento de partículas

cargadas en un campo eléctrico , hacia un electrodo con carga opuesta .

La movilidad de las macromoléculas dependerá de su carga ,forma y tamaño.Aquí

en una matriz polimérica, las cuales están en un campo eléctrico , se deposita la
muestra mediante pipeteadores en pequeño pozuelos .Se le aplica campo
magnético , y hay una migración del área negativa hacia la positiva y son separados
de acuerdo a su punto isoeléctrico.El Punto isoeléctrico es donde el punto de las
cargas positivas de la proteína son iguales en cantidad a las cargas negativas por lo
que ya no hay más desplazamiento .

Isoelectroenfoque. o enfoque isoelectrico

Tiene dos partes , la primera parte consiste en depositar en un tubo de ensayo o
vidro un gel que es la fase estacionaria, una solucion anfolitica ,y hay un gradiente
de PH ,del mayor a menor ph.Aquí nos menciona , se establece un gradiente de pH
estable en el gel después de la aplicación de un campo eléctrico .Después se le
agrega la muestra de proteínas las cuales por su punto isoeléctrico podrán
separarse . Y van a teñirse para observar sus diferencias .Aquí es donde también
afecta el punto isoeléctrico , de acuerdo al ph , las proteínas se separan .

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Posteriormente se deposita en una cámara , CONTENEDOR con gel de acrilamida

con una solución sulfatante QUE lo que hara sera desnaturalizar las proteínas
obteniendo una separación bidimensional .y que va a haber una disminución del
punto isoeléctrico , y también su separación por su masa .

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OTROS MÉTODOS DE PURIFICACIÓN

CENTRIFUGACIÓN

La centrifugación es el procedimiento más utilizado para separar un homogeneizado

en diferentes partes o fracciones .Este homogeneizado se colocará en tubos de
ensayo y re rota a altas velocidades en una centrífuga o en una ultracentrífuga .se
pueden centrifugar con velocidades hasta 100000 revoluciones por minuto
produciendo grandes fuerzas ,hasta de 600 mil veces la fuerza,

Tales velocidades requieren de cámaras centrifugar que estén refrigeradas y sujetas

a vacío de modo que la fricción lo eleve la temperatura del homogenizado.La
centrifuga esta rodeada por un grueso blindaje metálico ya que un rotor fuera de su
punto de equilibrio puede romperse y liberar energía de forma explosiva.

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C.DIFERENCIAL
El homogenato es centrifugado repetidas veces a velocidades crecientes
sedimentando progresivamente y realizando un fraccionamiento diferencial de sus
componentes