Purificación de proteínas

Sebastián Orozco Cod:1950046

Alejandro Triana Cod:1950045
Las técnicas de la ingeniería de la proteína son una parte esencial de la
modificar y producción de proteínas con propiedades específicas que se
pueden aplicar en los diversos procesos industriales.
Estas técnicas son cruciales en la investigación biotecnológica.
Sin embargo, estos métodos dependen completamente de la capacidad
de aislar y purificar las proteínas deseadas para poder comprender sus
propiedades físicas y químicas, junto con sus estructuras terciarias e
interacciones con ligandos y substratos.
 Crear un extracto Purificación final.
Protocolo de la proteína
Purificación
• Cromatografía de
para la cruda. intermedia. afinidad
purificación • Lisis celular • Diálisis. • Cromatografía de
de una • Centrifugación • diafiltración intercambio iónico.
proteína. • Precipitación • cromatografía por
del extracto exclusión de tamaño.
METODOS DE PURIFICACION DE PROTEINAS

En primer lugar hay que recoger la proteína, si

la proteína es intracelular se recoge toda la
célula, si es extracelular, se debe recoger el
medio de cultivo al cual se excreto la proteína.
Luego de recoger se debe preparar el extracto
para iniciar él proceso de purificación.
Generalmente la proteína que se quiere extraer
representa solamente el 1% del volumen total
de la muestra.
Preparación del extracto
Si la proteína es intracelular se debe proceder primero con la lisis celular, existen
diversos métodos para realizar este proceso y uno de ellos es el de congelar-
descongelar, el cual como su nombre lo indica por procesos de congelación y
descongelación rápidos se logra romper la membrana celular y liberar el contenido
celular, también existen métodos mecánicos como el ultra sonido o aquellos en los
que se usa detergente para disolver la pared celular.
Cuando se logra extraer el contenido celular se añade a la solución sales y
detergentes para reducir orientación hidrofóbica de las proteínas y facilitar su
separación, las sales se añaden para disminuir las interacciones moleculares y
mantener la solución.
Estabilización de las proteínas en solución

Una vez preparada la mezcla, las proteínas deben ser

estabilizadas para mantener la bioactividad de la proteína,
debido a la fragilidad de las mismas. Por esta razón, hay que
tomar precauciones para proteger a la proteína durante el
proceso de purificación.
La temperatura es una amenaza para las proteínas, ya que
pueden desnaturalizarse. Este proceso debe hacerse a
menudo a temperaturas apenas mayores que las de
congelación. La congelación directa y los ciclos de
congelación-descongelación pueden destruir proteínas.
Separación de los componentes del extracto

Las similitudes entre las proteínas nos permiten

separarlas de otros materiales no proteicos,
como lípidos (grasas), carbohidratos y ácidos
nucleicos, que también se liberan cuando se
destruye una célula. Las diferencias entre las
propias proteínas se usan entonces para separar
las proteínas deseadas de las otras contenidas
dentro de la célula.
Precipitación de proteínas

Las proteínas suelen tener aminoácidos

hidrófilos en su superficie que atraen e
interaccionan con moléculas de agua. Esa
característica se usa como base para
separar proteínas de otras sustancias del
extracto. Se puede añadir sulfato de amonio
es a la mezcla de proteínas para
precipitarlas. Se separan a las proteínas de
las moléculas no proteicas y también da
como resultado un precipitado de proteínas
que es bastante estable.
Ciertos problemas asociados a la precipitación
por sulfato de amonio hacen que éste sea una
mala elección en ciertos contextos industriales. El
sulfato de amonio es muy reactivo cuando
contacta con acero inoxidable, y muchos equipos
de purificación industrial están hechos de acero
inoxidable. Otros solventes usados a menudo
para promover la precipitación de proteínas son
el etanol, isopropanol, acetona y dietil éter. Estos
solventes hacen que las proteínas precipiten
eliminando el agua presente entre las moléculas
de proteínas, igual que el sulfato de amonio.
 Métodos de separación por filtración (según el tamaño)

Hay distintas formas de separar moléculas según su tamaño y

densidad. La centrifugación es uno de esos métodos, esta separa las
muestras girándolas a gran velocidad. Con este proceso, las proteínas
pueden aislarse en una única capa. La centrifugación a escala industrial
se logra habitualmente mediante centrifugas de flujo continuo que
permiten el procesamiento continuo del extracto procedente del
biorreactor. Esto acelera el proceso de separación, comparado con la
centrifugación de pequeños volúmenes.
También se pueden usar filtros de distintos tipos y tamaños para separar
proteínas. En la filtración por membrana, se usan finas membranas de nylon o de
otro material sintético con poros extraordinariamente pequeños para eliminar
todos los restos celulares de la solución. La microfiltración elimina los
precipitados y las bacterias. En los procesos de ultrafiltración se usan filtros que
pueden separar incluso proteínas grandes de proteínas más pequeñas.
Uno de los principales inconvenientes de estos sistemas es su tendencia a
obstruirse fácilmente, pero viéndolo de otra perspectiva mas positiva estos son
mas rápidos que los de centrifugación.
La diafiltración y la diálisis son métodos de filtración basados en el concepto químico de equilibrio, la
migración de sustancias disueltas desde áreas de mayor concentración a zonas de menor
concentración. La diálisis depende de la capacidad de algunas moléculas de atravesar membranas
semipermeables mientras que otras se detienen o enlentecen por su tamaño. Este paso de la
purificación es necesario a menudo para eliminar las sales, los solventes y otros aditivos usados en
etapas anteriores del proceso. A continuación se sustituyen las sales con agentes tampón que ayudan
a estabilizar las proteínas durante el resto del proceso de purificación. La diafiltración añade un
componente de filtro a la diálisis.
Cromatografía.
Los métodos de cromatografía nos permiten
clasificar las proteínas según su tamaño o según si
tienden a adherirse a otras sustancias o a disolverse
en ellas.
La cromatografía por exclusión de tamaño
(SEC) utiliza esferas de gel como sistema de
filtración. Existen geles con distintos tamaños de
poro, y el gel necesario para una filtración correcta
depende de los pesos moleculares de los
contaminantes que hay que separar del extracto

Este método sólo puede hacer una separación

preliminar, y puede plantear problemas en un
contexto industrial porque precisa columnas muy
altas.
La cromatografía de intercambio iónico separa las proteínas en función de su carga neta de
superficie, a través de interacciones electrostáticas que ocurren entre las proteínas y la fase
estacionaria cargada.

Existen dos tipos de CII: (1) intercambio aniónico (fase estacionaria cargada positivamente que
une proteínas cargadas positivamente); y (2) de intercambio catiónico (fase estacionaria cargada
positivamente que une proteínas cargadas negativamente).
Debido a que las proteínas intercambian iones hidrógeno con el solvente, la carga neta de una
proteína está influenciada por el pH del solvente en se encuentra disuelta. El punto isoeléctrico (pI)
de una proteína es el pH en el cual la proteína no tiene carga neta.

pH mayor al PI pH menor al PI
Carga neta + carga neta -

Sin embargo, para la purificación de proteínas, la estabilidad de la proteína es la

consideración de mayor importancia al elegir las condiciones de purificación y por ende
la columna más adecuada para unir la proteína.
En la Cromatografía de intercambio iónico. Las
proteínas se encuentran unidas a una fase
estacionaria cargada en un búfer de baja fuerza
iónica. Las proteínas unidas pueden ser eluidas
incrementando la fuerza iónica del búfer o
ajustando el pH.
La cromatografía de afinidad se basa en la capacidad de la mayoría de las proteínas de unirse
específica y reversiblemente a compuestos con una forma específica llamados ligando.
El ligando puede unirse de manera directa a la proteína de interés o a una etiqueta molecular
que se encuentre ligada a la proteína. La cromatografía de afinidad es, en general, la técnica
de purificación más robusta y típicamente se utiliza en los pasos tempranos del esquema de
purificación.
La purificación por cromatografía de afinidad puede ser el único paso requerido para lograr
un grado de pureza adecuado
La fase estacionaria para la cromatografía de afinidad está constituida por una
matriz inerte unida covalentemente a un ligando que se une específicamente a una
proteína o a un grupo de proteínas.

La matriz inerte típicamente está compuesta por agarosa o poliacrilamida

entrecruzada. Las proteínas pueden ser purificadas por cromatografía de afinidad
de manera selectiva o no selectiva. En una cromatografía de afinidad selectiva se
usa un ligando específico para una proteína o para una etiqueta molecular unida
covalentemente a la misma
GRACIAS