Manual Laboratorio de Microbiología

Laboratorio de Ingeniería en
Alimentos
Asignatura: Microbiología General

PRACTICA 2. PREPARACIÓN DE
MEDIO DE CULTIVO Clave: LIA-TE-BIO 245 - 01
Fecha de emisión: Febrero 2014

Rev. 2 Hoja 1 de 5
Elaboró: Lorena Luna Guevara.
1. INTRODUCCION.
Un medio de cultivo es un sustrato que proporciona los nutrientes necesarios para el desarrollo
de microorganismo a probar.
Los microorganismos presentan grandes diferencias en sus requerimientos nutricionales que

son reflejo de la extrema diversidad bioquímica y fisiológica. El agua, sales inorgánicas, fuentes
de carbono y fuentes de nitrógeno, metales son necesarios para todos. Existen bacterias que
requieren la presencia de determinado nutriente, sin el cual no pueden desarrollarse, este
nutriente se denomina: FACTOR DE CRECIMIENTO y las bacterias que necesitan de ellos se
llaman: Auxótrofo.
Los medios de cultivo pueden ser: líquidos, semisólidos y sólidos, los líquidos son aquellos
medios que carecen de material gelificante.
En la microbiología el material gelificante es el agar químicamente es un polisacárido obtenido a

partir de algas marinas presentando entre sus ventajas que la mayoría de los microorganismos
no lo utilizan como nutrientes. La presencia y cantidad de éste permite diferenciar los medios
semisólidos que presentan una concentración de 0.5 – 1% de los sólidos con una concentración
mayor del 2 % (se emplean los términos sólido y semisólido pero recordemos que se tratan de
geles).
Dependiendo de su composición y su empleo pueden ser: diferenciales, selectivos, de

transporte, enriquecido etc.
Los medios de cultivo en microbiología se fabrican o bien en forma de polvo o bien en forma
granulada ambas presentaciones son higroscópicas por lo que deben mantenerse en lugares
cerrados y ambiente secos.
2. OBJETIVO:
Conocer el procedimiento para la preparación de los distintos medios de cultivos para el

aislamiento e identificación de microorganismos cepas.
Aprobaciones: Academia de ……………………

Coordinación de Ingeniería …………….
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Rev. 2 Hoja 2 de 5
3. MATERIAL Y EQUIPO
• 10 cajas de petri estériles

• 1 matraz Erlenmeyer
• pipetas
• mechero
• autoclave.
4. PROCEDIMIENTO:
Las formas de preparación vienen indicadas en cada etiqueta y dependen del fabricante.
Se recomienda la siguiente técnica
1. Utilizar un recipiente de volumen 2.5 veces mayor al que se prepara

2. Se agrega aproximadamente la mitad del agua total al medio y se deja reposar unos 15
minutos.
3. Si es necesario calentar, el calentamiento debe ser paulatino y agitando continuamente,
evitar el calentamiento prolongado.
ESTERILIZACIÓN:
1. Autoclave durante 15 min a 121 C ( 15 lbs)

2. Deben incluirse controladores de autoclave.
3. No introducir en la autoclave ingredientes termolábiles p.e las soluciones de
carbohidratos, que deben esterilizarse por filtración.
CONTROL DE ESTERILIDAD:
Medios preparados (en tubo, matraces ó en placa) deben ser sometidos a prueba de esterilidad
(antes de usarse) incubando de 18 – 24 horas a temperaturas de 37° C si observamos
crecimiento deseche el material.
Ejemplo de Preparación de los medios de cultivo:
AGAR PAPA DEXTROSA
Tabla 1: Fórmula aproximada para 1000 ml de agua purificada.

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Infusión de papa (sólidos) 4.0 g

Dextrosa 20.0 g
Agar 15.0 g
pH final 5.6  0.2
Método de preparación:
Suspender 39 gramos del polvo en un litro de agua purificada. Mezclar perfectamente, calentar
con agitación frecuente y hervir durante un minuto hasta disolución completa. Distribuir y
esterilizar a 121°C por 15 minutos.
AGAR NUTRITIVO
Tabla 2: Fórmula aproximada para 1000 ml de agua purificada
Peptona de gelatina 5.0 g

Extracto de carne 3.0 g
Agar 15.0 g
pH final 6.8  0.2
Suspender 23 gramos de polvo en un litro de agua purificada. Mezclar perfectamente, calentar
con agitación frecuente y hervir durante 1 a 2 minutos hasta disolución. Esterilizar a 121° C
durante 15 minutos.
AGAR MAC CONKEY
Tabla 3: Fórmula aproximada para 1000 ml de agua purificada.
Peptona de caseína 1.5 g

Peptona de gelatina 17.0 g
Peptona de carne 1.5 g
Lactosa 10.0 g
Sales biliares 1.5 g
Cloruro de sodio 5.0 g
Agar 13.5 g

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Rojo neutro 0.03 g

Cristal violeta 0.001 g
pH final 7.1  0.2
Suspender 50 gramos del medio en un litro de agua purificada. Mezclar bien hasta que se
obtenga una suspensión uniforme. Dejar reposar de 10 a 15 minutos. Calentar suavemente
agitando frecuentemente y hervir durante 1 minuto. Esterilizar en autoclave a 121°C durante 15
minutos.
5. CUESTIONARIO:
1.- Diga usted que entiende por: esterilidad, séptico y antiséptico.
2.- Mencione 3 métodos de esterilización.
3.- Defina es un medio enriquecido, selectivo y diferencial.
4.- ¿Por qué se utilizan algodón para tapones?
5.- ¿Qué ventajas presenta el agar?
6.- ¿A quién se debe el empleo del agar en laboratorios?
7.- ¿Qué alteraciones se presenta en los medios por exceso de esterilización?
8.- ¿Qué otros métodos conoce para el control en la esterilidad por autoclave?
6. BIBLIOGRAFIA:
Zinsser 1994, Microbiología. Ed. Panameriacana. Veinteaba edición.
Tortora G., J.,2007, Introducción a la Microbiología, Ed Médica Panaméricana.
Manual de Medios de Cultivo. Bioxon

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8. ACTUALIZACIONES
Control de cambios
Nivel de revisión Fecha de la emisión Razón de cambio
1 22 de junio de 2009 Generación de documento
2 X de febrero 2014 …….

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PRACTICA 4. OBSERVACION DE Asignatura: Microbiología General

MICROORGANISMOS DEL
Clave: LIA-TE-BIO 245 - 01
AMBIENTE
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1. INTRODUCCION.
Los microorganismos se encuentran presentes en todos los ambientes: en el aire, agua, suelo,
superficies e incluso sobre nuestra piel.
Específicamente el aire, además de partículas en suspensión, es portador de bacterias en forma
vegetativa o esporuladas. La población microbiana del aire está compuesta principalmente por
esporas de hongos, especialmente de hongos imperfectos Cladosporium spp.y basidiosporas,
por bacterias como Bacillus spp, Micrococcus spp. y Clostridium .
Existen distintos métodos para el análisis del aire: sedimentación, filtración y precipitación
electrostática, entre otros.
El método de sedimentación es uno de los más sencillos para la determinación de
microorganismos del aire. A pesar de ello, los resultados obtenidos son orientativos de las cifras
de microorganismos presentes en el aire, ya que estos niveles varían en función de las
corrientes de aire y del tamaño de las partículas en suspensión.
2. OBJETIVO:
• Poner en evidencia la presencia de los microorganismos existentes en el ambiente.
• Aprender a diferenciar los tipos de morfologías colonial obtenidas en muestras de
ambiente.
Mechero
Cajas Petri con medios de cultivo:
• Papa dextrosa,
• Mac Conkey
• Agar Nutritivo

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MICROORGANISMOS DEL
AMBIENTE
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4. PROCEDIMIENTO:
1) Destapar las placas con agar Papa Dextrosa (PDA), Agar nutritivo y Agar Mac Conkey, en un
lugar cuyo nivel de contaminación se desee examinar, durante diferentes intervalos de tiempo:
30 minutos, 1 hora y 1 ½ hora. Es decir se pondrán simultáneamente las placas de agares para
observar sus diferencias con respecto a su selectividad. Tapar las placas de Agar Nutritivo y
Agar Mac Conkey e incubar durante 24-48 horas a 37 ºC. Mientras que las placas de Agar Papa
Dextrosa serán incubadas durante 5 días a 28°C.
2) Sin lavarse las manos, un integrante del grupo, hará una impresión con el dedo pulgar sobre
la superficie con Agar Papa Dextrosa (PDA), Agar nutritivo y Agar Mac Conkey. Las placas de
Agar Nutritivo y Agar Mac Conkey incubar durante 24-48 horas a 37 ºC. Mientras que las placas
de Agar Papa Dextrosa serán incubadas durante 5 días a 28°C.
3) En otra placa con agar nutritivo colocar un cabello incubar durante 24 horas a 37 ºC
4) Leer las morfologías utilizando la hoja de reporte.
Tabla 1: Reporte de Morfología Colonial.
Colonia 1 Colonia 2 Colonia 3
1.-Tamaño (mm.).
2.- Color.
3.- Forma;
puntiforme.
circular.
irregular.
4.- Elevación:

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MICROORGANISMOS DEL
AMBIENTE
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Plana
Elevada
Convexa
Pulvinada
Umbonada
5.- Superficie:
Lisa
Rugosa
6.- Aspecto:
húmedo.
seco.
7.- Bordes:
enteros.
irregulares.
filamentosos.
8.- Luz reflejada:

brillante.
mate.
9.-Luz transmitida:
opaca.
traslúcida.
transparente.
10.- Consistencia:
suave: butirosa
suave: mucoide
suave: friable
Dura

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MICROORGANISMOS DEL
AMBIENTE
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ELEVACION
Fig. 1 Forma y bordes
5. CUESTIONARIO:
1.- ¿Por qué es importante leer la morfología colonial?
2.- ¿Qué tipo de microorganismos pueden ser aislados con el medio Papa Dextrosa?
3.- ¿Qué tipo de microorganismos pueden ser aislados en los medios Agar Nutritivo y
MacConkey?

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MICROORGANISMOS DEL
AMBIENTE
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6. BIBLIOGRAFIA:
Díaz, R.,Gamazo C., López-Goñi, I.. 1999. Manual Práctico de Microbiología. Cap. 32: Cultivos
de microorganismos del ambiente. 2ª Ed. Editorial Masson S.A. Barcelona, España. 151 pp.
7. ACTUALIZACIONES
Control de cambios

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PRACTICA 3. AISLAMIENTO DE
MICROORGANISMOS Clave: LIA-TE-BIO 245 - 01

Rev. 2 Hoja 1 de 3
1. INTRODUCCION.
El cultivo de m.o. son los medios a través de los cuales en forma intencional se obtiene
crecimiento en los llamados medios de cultivo. Si el cultivo tiene un solo tipo de m.o. se
denomina cultivo puro o axénico, cuando encontramos más de un tipo de m.o. se denomina
cultivo mixto.
El proceso mediante cual se separan los m.o. se denomina “aislamiento” y el m.o. separado
“aislado”.
La forma de sembrar la muestra depende del tipo de medio de cultivo.
a) Medio líquido; la inoculación se efectúa con el asa, pipeta o hisopo.
b) Medio sólido; sea en caja o en forma inclinada, la forma de inoculación se efectúa por
estría o picadura (o extensión).
c) Agar semisólido; se inocula por picadura, esto se hace generalmente con asa recta.
2. OBJETIVO:
• Desarrollar y practicar el método de aislamiento por estría cruzada.
• Aprender a leer la morfología colonial.
3. PROCEDIMIENTO:
I.- Aislamiento por el método de estría.
1) Flamee el asa bacteriológica hasta llevarla al rojo vivo.

2) Deje enfriar el asa.
3) Tome una gota de cultivo.
4) Siga los esquemas proporcionados:
Hay que tener en cuenta las siguientes precauciones para el esquema de estría cruzada.

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a).-Marcar las cajas antes de empezar a trabajar y no hablar durante el proceso para evitar
contaminación.
b).- Flamear el asa antes de cada serie de estrías y enfriarla en una orilla de la placa.
c).- El medio de cultivo a emplear dependerá del inóculo en cuestión
d).- Con la última serie de estrías no volver a tocar la primera serie de estrías. (Fig. 1 y Fig.2)
e).- Tiempo de incubación
Fig. 1. Secuencia para la técnica de aislamiento por estría cruzada.

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Fig. 2. Tipos de aislamientos
4. CUESTIONARIO:
1.- ¿Cuál es la importancia de un buen aislamiento?
2.- Menciona dos tipos de aislamiento aparte de la estría cruzada
3.-¿Cuál es la coloración de las colonias aisladas y a que se debe?
5. BIBLIOGRAFIA:
• Prescott. L. M., Harley, 1999, Microbiología. Cuarta Edición. Graw Hill. Interamericana,
México.
• Zinsser 1994, Microbiología. Ed. Panameriacana. Veinteaba edición.
7. RESIDUO(S) GENERADO(S) Y DISPOSICIÓN:
8. ACTUALIZACIONES
Control de cambios

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PRACTICA 5. MICROSCOPIA

Rev. 2 Hoja 1 de 5
1. INTRODUCCION.
Casi la totalidad de los organismos unicelulares son imperceptibles para el ojo humano y para
observarlos es esencial el microscopio. El uso de este dispositivo es indispensable en el
laboratorio de microbiología para el estudio de la morfología y estructura de los
microorganismos, así como su reacción a diferentes colorantes, lo cual junto con otros criterios,
permitirá su identificación, por lo tanto, es importante conocer su adecuado manejo.
Además de la ampliación de la imagen hay que tener en cuenta dos factores más: el contraste y
la resolución. Los objetos deben poseer cierto grado de contraste con su medio circundante para
poder ser percibidos a través del microscopio. Por otra parte, el grado de resolución depende de
las características del sistema de lentes que posea el microscopio. Este se encuentra limitado
por la longitud de onda de la luz emitida, el índice de refracción del medio en el que se realiza la
visualización y la apertura numérica del objetivo.
PARTES DEL MICROSCOPIO
El microscopio compuesto es aquel que dispone de dos o más lentes de aumento. Un

microscopio se divide en dos partes: el soporte y el sistema óptico (Fig 4)
1) Soporte. Es la pieza fija en la que sólo la platina y el condensador tienen un cierto
movimiento. Sus principales partes son:
a) Base. Normalmente alberga la fuente de iluminación, en determinados modelos incorpora
además, un sistema portafiltros con varios filtros y un diafragma de campo luminoso.
b) Brazo. Soporta todo el sistema óptico, el cabezal porta oculares y el revólver porta objetivos.
En él se dispone también un sistema de anclaje de la platina (movimiento de enfocado de la
preparación).

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c) Platina. Es la pieza donde se coloca la preparación microscópica para su observación.

d) El Macrométrico y el Micrométrico. Ambos permiten enfocar la preparación. El primero se
emplea para un enfoque rápido cuando se trabaja con objetivo de menor aumento (x10),
mientras que el segundo permite fijar el enfoque cuando se utilizan los objetivos de mayor
aumento (x40, x100).
2) Sistema Óptico. Está formado por un cuerpo tubular donde se instalan las lentes: los
oculares en un extremo y los objetivos en el extremo opuesto.
Fig. 1 Partes de un microscopio compuesto

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2. OBJETIVO:
• Identificar las partes y funcionamiento de un microscopio.

• Conocer el cuidado, manejo y utilidad del microscopio.
• Microscopio Óptico
4. PROCEDIMIENTO
1) Compruebe que las lentes del ocular y de los objetivos estén limpias: de no ser así,
límpielas cuidadosamente con papel especial para óptica. No tocar las lentes con los
dedos.
2) Coloque la preparación (sin cubreobjetos y con la muestra en la parte superior) sobre la
platina sujetándola con el dispositivo móvil. Compruebe previamente, que el objetivo de
menor aumento está en posición de empleo.
3) Ajuste los binoculares a la distancia interpupilar y ajuste el foco de cada ocular si el
microscopio lo permite.
4) Coloque el objetivo de 10 aumentos (10 x) y enfocar:
a) Acerque al máximo la lente del objetivo a la preparación, empleando para ello el macro
métrico. No realizar dicha operación mirando por el ocular, pues correría el riesgo de
“clavar” el objetivo en la preparación con el consiguiente destrozo de ambos.
b) Enfoque con el micrométrico observando por el ocular hasta obtener un enfoque nítido
5) Pase al objetivo de 40 aumentos (40 x )Suba ligeramente el condensador. La imagen

debe estar casi enfocada, afine el foco con el micrométrico. Si la imagen no está ni
medianamente enfocada, es preferible volver a un enfoque con el objetivo de 10 x. El
objetivo de 40 x trabaja muy cerca de la preparación y por ello es susceptible de dos tipos
de accidentes: ser “clavado” en la preparación y resultar manchado con aceite de
inmersión si se observa la preparación ya usada con éste último.
6) Empleo del objetivo de inmersión:
a) Gire el revólver hacia el objetivo de inmersión dejándolo a medio camino entre éste y el
objetivo de 40 x.
b) Coloque una gota de aceite de inmersión sobre el punto de la luz.

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Rev. 2 Hoja 4 de 5
c) Termine de girar el revólver hasta la posición del objeto de inmersión, asegurándose de

que éste no toca la preparación, pero sí la gota de aceite.
d) Enfoque cuidadosamente con el micrométrico. Recuerde que la distancia entre el

objetivo y la preparación es mínima.
e) Una vez que ya ha puesto aceite de inmersión sobre la preparación ya no puede

volverse a colocar los objetivos de 10 x y de 40 x sobre ese campo. Por lo tanto, si desea
enfocar otro campo, debe retirar el objetivo de inmersión girando el revólver hacia el
objetivo de menor aumento (x10), seleccionando otro campo y empezando a enfocar
desde éste último.
f) Finalizada la observación de una preparación, y antes de retirarla de la platina, se

colocará el objetivo de menor aumento girando el revólver en el sentido hacia la lupa.
Nunca retire la preparación con el objetivo de inmersión en posición de
observación.
g) Retire la preparación y limpie el objetivo de inmersión cuidadosamente con un papel

especial para óptica. Compruebe también que el objetivo de 40 x está limpio.
RESULTADOS
Siguiendo las indicaciones para el manejo del microscopio:

a) Observar un examen en fresco de microorganismos
b) Observar preparaciones coloreadas suministradas por la cátedra.
2) Dibujar lo observado

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Examen en Fresco Preparación Colorea
5. CUESTIONARIO:
1.- Menciona tres tipos de tinciones diferenciales a parte de la T. de Gram
2.- ¿Cuál es la función del aceite de Inmersión?
3.- Menciona otros dos tipos de microscopios a parte del óptico para la observación de bacterias
e incluso virus:
6. BIBLIOGRAFIA:
Manacorda M. A., Manual de Prácticas de Microbiología General, Unidad Académica: E.S.S.A.
8. ACTUALIZACIONES
Control de cambios

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PRACTICA 6. TÉCNICA DE TINCIÓN
DE GRAM Clave: LIA-TE-BIO 245 - 01

Rev. 2 Hoja 1 de 4
1. INTRODUCCION.
La mayoría de los microorganismos son incoloros y presentan poco contraste cuando se

observan directamente al microscopio. Cuando los microorganismos son teñidos antes de
observarlos, aumenta grandemente el contraste de las células y su medio.
Antes de teñir es necesario hacer un frote y fijarlo. Un frote es una delgada capa de células que
cubre un área de un portaobjetos, este frote debe ser secado al aire y fijado por calor o
químicamente por alcohol. La fijación se da como resultado de la coagulación del protoplasma y
adherencia al portaobjetos. Así los frotes no fijados son “lavados” en el proceso de tinción.
Son varias las técnicas usadas en microbiología para la observación de los microorganismos:
simple (directa), diferencial, tinción de estructuras, negativas y tinción de material de reserva.
La tinción más usada en microbiología es la de Gram y se considera una tinción diferencial.
Los microorganismos difieren entre sí desde el punto de vista químico y físico por lo que
reaccionan de manera diferente a los colorantes. Las tinciones diferenciales ocupan dos
colorantes: el primero (cristal violeta) y uno de contraste (safranina) y clasifica a los m.o. según
su capacidad de retener el colorante primario Gram (+) ó el colorante de contraste ó secundario
Gram (-).
2. OBJETIVO:
Conocer y manejar la técnica de tinción de Gram de acuerdo con la estructura celular de las
bacterias Gram (+) y Gram (-).

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Rev. 2 Hoja 2 de 4
• Cepas ( proporcionadas por el profesor)

• Mechero Bunsen.
• Portaobjetos.
• Cubreobjetos.
• Microscopio.
REACTIVOS:
➢ Cristal violeta.
➢ Lugol.
➢ Alcohol- Acetona.
➢ Safranina.
PREPARACION DE REACTIVOS
CRISTAL VIOLETA
1 gr cristal violeta 100 mL alcohol
LUGOL
2 gr KI + 1 gr I metálico 300 mL alcohol
ALCOHOL CETONA
80 ml alcohol + 20 cetona
SAFRANINA
1 gr safranina 100mL alcohol
4. PROCEDIMIENTO:
I) Técnica de tinción de Gram.

1.- Hacer un frotis de cada uno de los m.o. y dejarlos secar al aire.
2.- Fijar los brotes al calor.

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Rev. 2 Hoja 3 de 4
3.- Cubrir los frotis con cristal violeta y dejarlos actuar durante un minuto. Escurrir el colorante y
lavar con chorro suave de agua corriente.
4.- Cubrir los frotis con lugol, dejarlos un minuto, escurrir y lavar.
5.- Decolora con alcohol-cetona (proporción de 50% cada uno) de 5-30 seg. escurrir y lavar con
chorro suave de agua corriente.
6.- Cubrir los frotis con safranina y dejarla durante 10 seg. escurrir y lavar con chorro suave de
agua corriente.
7.- Dejar secar al aire.
8.- Observar los frotis con el objetivo de inmersión.
9.- Hacer anotaciones y dibujos a colores de las observaciones que efectúe.
II) Observación de la técnica de Gram en cada uno de sus pasos.
1.- Hacer 4 frotis con las cepas proporcionadas y fijarlos al calor.
2.- Teñir los frotes según la técnica de Gram, deteniéndose en cada uno de los pasos
importantes, de tal manera que tenga un frotis teñido hasta el paso 3, 4, 5, 6.
3.- Examinar a inmersión cada uno de los frotis
III) Haga los esquemas a colores de cada una de las preparaciones observadas.
IV) Llene la siguiente tabla:
Reactivo. Morfología. Color observado.

Cristal
Violeta.
Lugol.
Alcohol
-acetona.
Safranina.

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Rev. 2 Hoja 4 de 4
5. CUESTIONARIO:
1.- ¿Qué importancia tiene la técnica de Gram?
2.- Escribe 4 ejemplos de bacterias Gram (+) y 4 Gram (-).
3- Cite tres razones por lo cual los microorganismos deben teñirse.
4.- ¿Por qué las bacterias Gram (-) se tiñen rojas y las Gram positivas azules?
6. BIBLIOGRAFIA:
México.
• Zinsser 1994, Microbiología. Ed. Panameriacana. Veinteaba edición
8. ACTUALIZACIONES
Control de cambios

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PRACTICA 7. PRUEBAS
BIOQUÍMICAS Clave: LIA-TE-BIO 245 - 01

Rev. 2 Hoja 1 de 5
1. INTRODUCCION.
Las pruebas bioquímicas se basan en la determinación de la presencia o ausencia de diferentes

enzimas codificadas por el material genético del cromosoma bacteriano. Estas enzimas
(catalasa, coagulasas, descarboxilasas, deaminasas, ureasas, peroxidasas, etc.) involucradas
en el metabolismo bacteriano pueden ser evidenciadas en medios de cultivo especiales que
contienen los substratos (hidratos de carbono, aminoácidos, etc.) sobre los cuales ellas actúan,
junto con un sistema indicador que va a poner de manifiesto la degradación del substrato o la
presencia de un metabolito específico (ácido fórmico, ácido láctico, ácido succínico, indol, etc.).
Las pruebas bioquímicas también evalúan la capacidad de reducir ciertos iones (ferroso a
férrico), la presencia o ausencia de flagelos (prueba de movilidad), la producción o no de
hemolisinas, el requerimiento de algunos factores especiales (proteínas), la producción de
algunas toxinas con capacidad virulenta (toxina diftérica, toxina botulínica, etc.).
2. OBJETIVO:
• Sembrar, leer e interpretar algunas pruebas bioquímicas útiles en la identificación de

bacterias bacilares Gram negativas.
• Identificar el género y especie de la cepa problema.
• Cepas bacterianas (Propuestas por el profesor)

• Agar TSI (triple azúcar hierro)
• Agar LIA (lisina hierro agar)
• Agar UREA
• Agar CITARTO DE SIMMONS
• Caldo MR- VP
• Agar MIO

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PRACTICA 7. PRUEBAS

Rev. 2 Hoja 2 de 5
4. PROCEDIMIENTO:
a) Siembra:
Sembrar la cepa problema en toda la bacteria disponible de acuerdo a la siguiente instrucción:
1. AGAR TSI:
Siembra: Estría en superficie y la picadura central hasta el fondo del tubo.
Fundamento: En TSI se determina la capacidad de un microorganismo para utilizar los hidratos

de carbono GLUCOSA, LACTOSA y/o SACAROSA, con producción o no de gases (CO 2 , H 2 )
junto con la producción o de ácido sulf (H 2 S).

Interpretación: La lectura se efectúa después de 18 a 24 horas de incubación a 37° C. Se lee
una fracción, la reacción ocurrida en la superficie del medio corresponde al numerador (parte
aerobia) y la reacción ocurrida en la profundidad del medio corresponde al denominador (parte
anaerobia). La acidez se denomina con la letra A (color amarillo) y la alcalinidad con la letra K
(color rojo).
En este medio se leen las siguientes reacciones bioquímicas: Fermentación de la glucosa (K/A),
fermentación de la glucosa, lactosa y/o sacarosa (A/A). No fermentación de los carbohidratos
(K/K), la bacteria no utiliza los hidratos de carbono, produciendo aminas que alcalinizan el fondo
y la superficie del medio.
Algunas bacterias no fermentadoras solamente atacan la peptona aeróbicamente dando un TSI:
K/N, es decir no hay cambio en el fondo del tubo, Producción de gas: ruptura del medio,
Producción de H 2 S ennegrecimiento del medio.
El agar TSI contiene tres azúcares: glucosa (1g/L), lactosa (10g/L), sacarosa (10g/L).
Como indicador de pH tiene Rojo de Fenol el cual vira de color amarillo en presencia de acidez y
al color rojo en presencia de alcalinidad.
Tiene como fuente de azufre el TIOSULFATO DE SODIO, necesario para que las bacterias
puedan producir H 2 S y como indicador de H 2 S SULFATO FERROSO el cual reacciona con el
H 2 S produciendo un precitado negro e insoluble de sulfato ferroso.
2.- AGAR LIA:
Siembra: Doble picadura hasta el fondo del tubo y siembra en superficie.

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PRACTICA 7. PRUEBAS

Rev. 2 Hoja 3 de 5
Fundamento: En agar LIA se determina la capacidad de un microorganismo para utilizar el

aminoácido Lisina descarboxilándolo o desaminándolo, la fermentación de glucosa, la
producción o no de gases (CO 2 ), junto con la producción o no de ácido sulfhídrico (H 2 S). Se
efectúa después de 18 a 24 horas de incubación (48 horas si es necesario) a 37°C. Se lee la

acidez misma que se denomina con la letra A (color amarillo) y la alcalinidad con la letra K (color
púrpura.) El indicador del pH del medio es PÚRPURA DE BROMOCRESOL, el cual en acidez
vira al color amarillo y en alcalinidad al color púrpura. Por contener pequeña cantidad de
Glucosa (1g/L) al ser fermentada al fondo del tubo es amarillo y la superficie alcalina.
Interpretación:
En este medio se leen las siguientes reacciones bioquímicas:
a. Fermentación de la glucosa (K/A), la bacteria no utiliza al aminoácido solo fermenta la
glucosa.
b. Descarboxilación de lisina (K/K).
c. Desaminación de la lisina (R/A) rojo/amarillo.
d. Producción de gas: ruptura del medio.
e. Producción de H 2 S ennegrecimiento del medio.
3.- AGAR CITARTO DE SIMMONS:
Siembra: En superficie únicamente.
Fundamento: En agar CITARTO DE SIMMONS se determina la capacidad de un

microorganismo de emplear el citrato como única fuente de carbono en ausencia de
fermentación de azúcares o de producción de ácido láctico. Se efectúa después de 18 a 24
horas de incubación (48 horas si es necesario) a 37°C.
Normalmente el metabolismo del citrato comprende una condensación de acetilo con la
coenzima A y oxalacetato para entrar en el ciclo de Krebs. El medio utilizado contiene también
sales de amonio inorgánicas. Un organismo capaz de utilizar el citrato como única fuente de
carbono también es capaz de utilizar sales de amonio como única fuente de nitrógeno. Las sales
de amonio se desdoblan en amoniaco (NH) con la consiguiente alcalinidad del medio.
Interpretación: El indicador de pH es AZUL DE BROMOTIMOL el cual en presencia de

alcalinidad vira al color azul indicando que la prueba es POSITIVA.
Cuando no hay cambio de color ni crecimiento se dice que la prueba es NEGATIVA.
Si no hay cambio de color, pero sí hay crecimiento la prueba es DUDOSA.

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PRACTICA 7. PRUEBAS

Rev. 2 Hoja 4 de 5
4.- AGAR UREA:
Siembra: Superficie, solamente.
Fundamento: En agar UREA se determina la capacidad de un microorganismo de producir

UREASA y desdoblar la urea, formando 2 moléculas de amoniaco. La lectura se efectúa
después de 18 a 24 horas de incubación a 37°C. El sustrato UREA es un a diamina del ácido
carbónico, denominado carbamida. Todas las amidas (RCO-NH 2 ) son rápidamente hidrolizadas.
La ureasa es una enzima constitutiva ya que la sintetizan ciertas bacterias sin tener en cuenta si
hay o no el sustrato urea.
Interpretación: El indicador de pH es rojo de Fenol, el cual en alcalinidad vira en color violeta

indicando una prueba POSITIVA. Si el color es amarillo indica una prueba NEGATIVA.
5.- CALDOS MR-VP:
Siembra: En cada caldo con asa recta.
Fundamento: En el caldo MR- VP se determina la vía metabólica por la cual la bacteria es

capaz de fermentar la glucosa.
Interpretación: La lectura se efectúa después de 48 horas de incubación a 37°C, agregar 10

gotas de ROJO DE METILO al tubo MR, la aparición inmediata de un color rojo indica que la
prueba es positiva y un color amarillo indica que la prueba es negativa.
La lectura del VP se efectúa después de 48 horas de incubación a 37°C agregar al tubo 10
gotas de KOH al 40% y 5 gotas de ALFA NAFTOL al 5% mezclar fuerte después de la adición de
cada reactivo, esperar 15 minutos y leer la aparición de un color rojo indica una prueba de VP
POSITIVA, la aparición de un color amarillo o café indica una prueba de VP NEGATIVA.
La bioquímica de la fermentación de la glucosa hace muy poco probable encontrar cultivos MR y
VP POSITIVOS. Lo que sí es probable encontrar las 2 pruebas negativas en el caso de bacterias
no fermentadoras.
6. AGAR MIO
Siembra: Por picadura.
Fundamento: Podemos observar si el microorganismo es móvil, si puede descarboxilar la

ornitina y degradar el triptófano para producir indol, a través de la enzima triptofanasa.

Alimentos

PRACTICA 7. PRUEBAS

Rev. 2 Hoja 5 de 5
Interpretación: La movilidad se demuestra por un enturbiamiento del medio o por crecimiento

que se difunde más allá de la línea de inoculación. La reacción positiva a la ornitina está dada
por un color púrpura del medio. Por decarboxilación, se alcaliniza el medio, con el consecuente
viraje del indicador hacia el color púrpura. Debido a la fermentación de la glucosa se reduce el
pH produciendo una condición ácida y originando que el indicador de pH púrpura de bromocresol
vire al amarillo. El indol, es producido a partir del triptófano por los microorganismos que
contienen la enzima triptofanasa. El desarrollo de un color rojo luego de agregar unas gotas de
reactivo de Kovac´s o de Erlich, indica un resultado positivo.
5. CUESTIONARIO:
1.- ¿Cuál es la finalidad de realizar pruebas bioquímicas?
2.- ¿Qué otras pruebas bioquímicas existen aparte de las mencionadas en esta práctica y cuál
es su fundamento?
3.- ¿En qué consisten las pruebas API?
6. BIBLIOGRAFIA:
• Koneman Elemer W. 1997.The Entereobacteriaceae in Diagnostic Microbiology Quinta

edición Washington Square: Lippincott-Raven Publishers: 173-203.
• Mac Faddin J. 1980, .Pruebas bioquímicas para la identificación de bacterias de

importancia clínica, Panamericana.
8. ACTUALIZACIONES
Control de cambios

Alimentos

PRACTICA 8. CURVA DE
CRECIMIENTO BACTERIANO Clave: LIA-TE-BIO 245 - 01

Rev. 2 Hoja 1 de 4
1. INTRODUCCION.
El crecimiento y la viabilidad de los microorganismos están determinados por factores

nutricionales, ambientales y condiciones de laboratorio óptimas. En general las bacterias crecen
con mayor rapidez que los microorganismos eucarióticos y es posible predecir una curva de
crecimiento característica de cada especie microbiana.
Cuando una bacteria es inoculada a un medio de cultivo líquido fresco, experimentará un periodo
de adaptación al medio y posteriormente se dividirá en forma exponencial, dando lugar a una
curva de tipo sigmoidea que se acostumbra a dividir en 4 fases:
A) Fase de retardo, de adaptación o fase lag: no hay división celular y la célula está
sintetizando nuevos componentes.
B) Fase de crecimiento exponencial o fase log: los microorganismos se dividen por fisión
binaria y lo hacen a intervalos regulares.
C) Fase estacionaria: el crecimiento disminuye debido al agotamiento de nutrimentos o la
acumulación de productos residuales tóxicos.
D) Fase de declinación o muerte.
La forma de cada porción de la curva y el tiempo de duración de cada fase dependerá de: la
especie de microorganismo, la preparación del inoculo, la composición química del medio de
cultivo y las condiciones ambientales de la incubación.
2. OBJETIVO:
• Identificar las fases de una curva de crecimiento a partir de un cultivo bacteriano.

• Conocer los métodos de medición del crecimiento microbiano y los parámetros cinéticos
(μ, td).

Alimentos


Rev. 2 Hoja 2 de 4
- 1 matraz Erlenmeyer de 250 ml. con 100 ml de medio liquido(Caldo Nutritivo o TSA)
- 2 matraces Erlenmeyer de 125 ml con 99 ml de solución salina isotónica estéril
- 6 pipetas de 10 ml estériles
- 16 pipetas de 1 ml estériles
- 1 mechero Fisher
- 1 espectrofotómetro y celdas
- 1 gradilla
- 16 tubos con 9 ml de diluyente
- 1 varilla doblada en “L”
- 12 cajas petri con agar nutritivo
4. PROCEDIMIENTO:
- El profesor inoculara en un matraz erlenmeyer con medio líquido (caldo nutritivo) 12 horas
antes de iniciar la práctica, que se utilizara como inoculo y para el re-siembre.
- Inocular en condiciones estériles un matraz erlenmeyer de 250 ml con 100 ml de caldo
nutritivo con 10 ml del microorganismo en estudio.
- Homogeneizar cuidadosamente agitando el matraz e inmediatamente tomar una muestra
de 5 ml con una pipeta estéril y vaciarla en una celda del espectrofotómetro. Esta muestra
corresponderá al tiempo cero, de la misma manera se tomaran muestras a las 0.5, 1, 2, 3,
y 4 horas, para el tiempo de 6 horas de incubación se tomaran 6 ml.
- Colocar el cultivo en incubadora con agitación (150 rpm) a 35 ºC
- Determinar la turbidez de las muestras en un espectrofotómetro a 560 nm y leer el valor
de la densidad óptica.
- En la muestra de 6 horas además de evaluar la turbidez se deberá poner 1 ml de cultivo
en un matraz erlenmeyer con 99 ml de diluyente, del matraz con la muestra diluida, hacer
una serie de diluciones en tubos con 9 ml de diluyente hasta 10 8. Cuidando de
homogeneizar las muestras cada vez que se haga una nueva dilución.

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Rev. 2 Hoja 3 de 4
- Enseguida inocular 0.1 ml de las últimas 3 diluciones en 2 cajas de petri con agar nutritivo
y distribuir la muestra con una varilla de vidrio doblada en “L”
- Dejar reposar las cajas unos minutos y posteriormente incubarlas en forma invertida
durante 24- 48 horas.
- Cuantificar el número de UFC/ mL
RESULTADOS:
Registrar las absorbancias y las UFC/mL (Unidades Formadoras de Colonias por mililitro) en la
siguiente tabla:
Tiempo de muestreo (h) Turbidez DO. O ABS UFC/mL

0
0.5
1
2
3
4
6
5. CUESTIONARIO:
1. ¿Cómo se define el crecimiento microbiano y cuáles son los eventos a nivel celular que
ocurren en cada una de las etapas de crecimiento?
2. ¿Qué condiciones ambientales y nutrimentales causaran una disminución o eliminación

de la fase lag en la curva de crecimiento? Y ¿Qué condiciones la incrementaría?
3. ¿Cómo se define el tiempo de duplicación? ¿Cómo se relaciona con la tasa de

crecimiento específica (μ)?
6. BIBLIOGRAFIA:
• Stainer, R.Y., Doudoroff, M. y Adelberg, E.A. Microbiología. Ed. Aguilar.

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Rev. 2 Hoja 4 de 4
8. ACTUALIZACIONES
Control de cambios

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CRECIMIENTO DE HONGOS Clave: LIA-TE-BIO 245 - 01

Rev. 2 Hoja 1 de 3
1. INTRODUCCION.
Una gran variedad de hongos microscópicos pueden contaminar y desarrollarse en alimentos o

simplemente permanecer en ellos y adquirir un especial significado desde el punto de vista
económico o sanitario. Las consecuencias de su actividad en los alimentos se manifiestan en dos
sentidos: la producción en ciertos casos de sustancias toxicas para el hombre y animales y la
descomposición o apariciones en el alimento. El grupo de los hongos comparte características entre
sus miembros que los distinguen notoriamente de las bacterias. Algunas especies exhiben una gran
diversidad en su de capacidad metabólica y de adaptación a numerosas sustratos.
Las características que definen a los principales hongos son: tipo de micelio, esporas,
esporangio, ciclo de vida y presencia o ausencia de reproducción sexual.
La clasificación abarca los siguientes grupos: phylomicetos, ascomicetos, basidomicetos,
deuteromicetos u hongos imperfectos.
2. OBJETIVO:
Evaluar en medios sólidos de laboratorio, curvas de crecimiento para Aspergilus parasiticus a

diferentes temperaturas (37,22.5 y 5°C) y pH (5.0, 3.5 y 2.0).
• Medio de cultivo agar papa-dextrosa “PDA”

• Ácido cítrico estéril al 30% (p/v)
• Cajas petri chicas
• Jeringa de Insulina
• Lavado de esporas

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Rev. 2 Hoja 2 de 3
4. PROCEDIMIENTO:
1. Se hacen crecer cuñas del moho Aspergilus parasiticus en agar papa- dextrosa “PDA”,
durante 10 días a 25° C. A partir de las cuñas se realizaron los lavados de esporas
correspondientes utilizando 5mL de agua estéril.
2. Se preparan los sistemas con pH ajustado con PDA acidificado con ácido al cítrico estéril
al 30% de acuerdo con la Tabla 1.
3. Los medios correspondientes a cada sistema y a su réplica se inoculan con 50 L del
lavado de esporas.
4. Todos los sistemas se incuban a diferentes temperaturas (37,22.5 y 10°C) durante cuatro
días, de acuerdo con la Tabla 2.
5. Se realizan determinaciones del diámetro de las colonias con ayuda de un vernier,
diariamente durante cuatro días.
6. Se elaboran curvas de crecimiento en donde se relacionan los diámetros de las colonias
(milímetros) en función del tiempo (horas). Se realizan regresiones que permiten obtener
las pendientes, las cuales representan las velocidades de crecimiento radial (VCR, mm/h)
para cada condición y para cada réplica.
TABLA 1 Cantidades de ac. cítrico necesario para ajuste de pH
pH mL de ac. Cítrico/ 50 mL de PDA

2.0
3.5
5.0
TABLA 2 Diseño experimental con las variables pH y temperatura
pH T(°C)
2.0 10
22.5
37
3.5 10
22.5
37
5.0 10
22.5
37

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Rev. 2 Hoja 3 de 3
Complete el cuadro siguiente, anotando las medidas del diámetro de la colonia del hongo.
Tiempo de incubación (hrs) Diámetro (mm)

0
24
48
72
96
5. CUESTIONARIO:
1. ¿En qué consisten las distintas fases que componen la curva de crecimiento microbiano?
2. De acuerdo con los resultados obtenidos en la VCR ¿Cuáles son las condiciones de
crecimiento que favorecen a Aspergilus parasiticus?
3. De acuerdo con los resultados obtenidos en las fase lag ¿Cuáles son las condiciones de
crecimiento que retardan el desarrollo de Aspergilus parasiticus?
4. Menciona las técnicas utilizadas para la medición del crecimiento microbiano.
6. BIBLIOGRAFIA:
• Stainer, R.Y., Doudoroff, M. y Adelberg, E.A. Microbiología. Ed. Aguilar.

• Jay J. M., 1994. Microbiología Moderna de Alimentos. Tercera Edición. Ed. Acribia.
7. RESIDUO(S) GENERADO(S) Y DISPOSICIÓN:
8. ACTUALIZACIONES
Control de cambios

Alimentos
Medición del crecimiento
Asignatura: Microbiología general
microbiano

Rev. 2 Hoja 1 de 3
Introducción
El crecimiento microbiano hace referencia al aumento del número de microorganismos a lo largo del
tiempo y no al aumento de tamaño de un microorganismo. El aumento del número de microorganismos
permite la formación de colonias o de poblaciones. Es por eso que en microbiología el crecimiento se
estudia por poblaciones y no en microorganismos individuales. Las bacterias se reproducen generalmente
por fisión binaria. El resultado de la fisión binaria son dos células hijas por cada célula madre, así, una
célula se divide en dos, dos en cuatro y cuatro en ocho y así sucesivamente.
Existen diversos métodos para determinar la velocidad del crecimiento microbiano, divididos de manera
general en: masa celular y número de células
Objetivo
Realizar diversos métodos tanto de masa celular como de número de células para la cuantificación de
microorganismos
Metodología
Determinación de peso seco: el principio de esta determinación es secar volúmenes conocidos de un cultivo
celular lentamente hasta obtener un peso constante.
Para ello preparar 100 mL de caldo lactosado e inocular una colonia de algún microorganismo, incubar y
después de 24 h, centrifugar a 5000 rpm durante 15 min desechar el sobrenadante, lavar la “pastilla” con 2
mL de solución salina, recentrifugar sí es necesario.
Pesar un papel filtro y filtrar la biomasa obtenida en horno a 70°C durante 20h o hasta alcanzar un peso
constante.
El peso de las células secas se expresa en g x L-1
Determinación del número de células: el principio de esta determinación es contar de manera puntual o con
el cuenta colonias o la cámara de Neubahuer el número de células o colonias.
Para ello tener cajas con colonias crecidas y contar las cajas que presenten un crecimiento entre 50 y 250
colonias de manera puntual, si la población es mayor usar el cuenta colonias, seleccionado para ello 5
cuadros al azar y realizar el conteo de las colonias. Usar la siguiente fórmula: No. bacterias/cm3=(número
de bacterias) * (inverso de la dilución)

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microbiano

Rev. 2 Hoja 2 de 3
Para el uso de la cámara de Neubahuer, colocar 0.1 mL de una dilución y contar como con el cuenta
colonias. Usar la siguiente fórmula: No. bacterias/cm3= (número de bacterias) * (inverso de la dilución) *
(factor de la caja)
Cuestionario
1. Indique el número de microorganismos de cada método empleado, reporte en UFC/mL o g x L-1
2. Cite 3 ventajas y desventajas de los métodos de cuantificación de microorganismos empleados
3. Cite otros métodos de cuantificación de microorganismos o de biomasa
4. Explique cómo podría ser más efectivo el método con cámara de Neubahuer, sobre todo para
diferenciar entre células vivas o muertas
5. Explique la diferencia entre masa celular y número de células
Bibliografía
Scragg, A., Biotecnología para ingenieros. Sistemas biológicos en procesos tecnológicos. 1ª. Ed. Editorial
Limusa México.

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microbiano

Rev. 2 Hoja 3 de 3
ACTUALIZACIONES
Control de cambios

Alimentos
PRACTICA 10. EFECTOS DE LOS
FACTORES FISICOS SOBRE EL
CRECIMIENTO DE LOS Clave: LIA-TE-BIO 245 - 01
MICROORGANISMOS
Rev. 2 Hoja 1 de 4
1. INTRODUCCION.
Los organismos para ser obtenidos en el laboratorio se debe garantizar que sus requerimientos
nutricionales sean satisfechos (medios apropiados con los componentes que den el aporte y
estén preparados correctamente para evitar deterioro de sus ingredientes). Las condiciones
físicas son importantes para obtener un satisfactorio crecimiento celular:
Estas condiciones incluyen control de:
1. temperatura
2. pH
3. concentración de azúcares
4. luz
5. concentración de sales
Temperatura.- las reacciones metabólicas están influenciadas por la temperatura cada especie
de microorganismo crece a cierta temperatura y este rango permite caracterizar a ese grupo.
Los organismos que crecen a temperaturas menores a 20° C se denominan psicrofílicos. Otros
microorganismos crecen a temperaturas mayores a 45 °C y se les denomina termófilos y los
que crecen en rangos de 20 a 45°C se les llaman mesofílicos. Aunque presentan un rango de
temperatura existente a la que el crecimiento es el óptimo: Temperatura optima de crecimiento
siendo los extremos superior e inferior las temperaturas máxima y mínima de crecimiento.
pH.- los organismos presentan un pH óptimo, mínimo y máximo de crecimiento dependiendo del
grupo microbiano estudiado.
Sales y azúcares.- existen organismos que necesitan para su crecimiento altas concentraciones
de sales denominados: Halofílicos.
Los microorganismos que toleran y crecen en altas concentraciones de azúcares son conocidos
como osmófilos.
2. OBJETIVO:
• Conocer y determinar la temperatura optima, pH y concentración de sales óptimas para el

crecimiento de microorganismos.
• Determinar las diferencias en los parámetros anteriores en función del grupo microbiano .

Alimentos
MICROORGANISMOS
Rev. 2 Hoja 2 de 4
Cepas: Proporcionadas por el Profesor

Tubos de ensaye con Caldo Nutritivo.
4. PROCEDIMIENTO:
1.- Efectos de temperatura

1. sembrar una asada de cada uno de los m.o en tubos con caldo nutritivo.
2. incubar cada m.o. a las siguientes temperaturas: 4, 28, 37 y 45 °C durante 24 horas.
microorganismo 4°C 28°C 37°C 45°C
Nota: el cuadro anterior se llenará mediante el método de las cruces.
2.- Efectos del pH
1. siembre las cepas en los tubos proporcionados con los pH indicados.

2. incube los tubos a 37 C
3. reporte en un cuadro.
microorganismos 4 5 7 12
Nota: siga el método de las cruces
3.- Cultivo de los organismos halofílicos

Alimentos
MICROORGANISMOS
Rev. 2 Hoja 3 de 4
a.- sembrar cada uno de los microorganismos de trabajo en tubos de Caldo nutritivo+ NaCl ( 5.0
, 7.0 y 10.0 %)
b.- incube a 37° C
4.- Cultivo de organismos sacarofílicos.
a.- Siembre cada uno de los m.o. en tubos de Caldo nutritivo+ Sacarosa ( 2.5 %, 5.5, 10 y 20 %)
b.- incube a 37° C
5. CUESTIONARIO:
1.- Con respeto a los microorganismos, diga qué son las temperaturas cardinales.
2.- Diga si crecieron igual los diferentes microorganismos en todos los valores de pH usados.
Explique a que cree que se deba las diferencias si las hay.
3.- Llene los siguientes cuadros.
Organismo pH óptimo pH mínimo pH máximo

Bacterias
Levaduras
Hongos fil.
4.- Por sus requerimientos gaseosos ¿Cómo se clasifican los organismos?
5.- A nivel de laboratorio ¿Cómo se pueden cultivar los organismos anaeróbicos?
6. BIBLIOGRAFIA:

Alimentos
MICROORGANISMOS
Rev. 2 Hoja 4 de 4
7. ACTUALIZACIONES
Control de cambios

Alimentos
AGENTES QUIMICOS SOBRE EL
MICROORGANISMOS
Rev. 2 Hoja 1 de 4
1. INTRODUCCION.
Los agentes antimicrobianos son substancias químicas naturales, (sintetizadas por hongos o
bacterias) sintéticas o semisintéticas que son capaces de inhibir el desarrollo o de destruir los
microorganismos patógenos infectantes.
Los antibióticos son agentes antimicrobianos de uso sistémico que pueden reducir y controlar la
presencia de microorganismos contaminantes del huésped y son administrados por ingestión
oral, uso tópico: absorbidos por la piel o inyectados.
El espectro de actividad del agente antimicrobiano puede ser:
Reducido: afecta a un número pequeño de especies bacterianas; Limitado: afecta a un número

moderado y limitado de especies bacterianas y Amplio espectro afecta a un gran número de
especies bacterianas sean ellas Gram (+) o
Gram (-).
Se define resistencia: capacidad de los microorganismos de modificar su estructura genética
para evitar ser dañados por ciertos antibióticos. Estos mecanismos bioquímicos de resistencia se
hallan codificados en el ADN cromosomal o de los plásmidos, y se traducen en:
Disminución de la permeabilidad celular que impide al antibiótico penetrar en la célula.
Inactivación enzimática de los antibióticos por fabricación de enzimas que producen cambios
estructurales en la configuración molecular de los agentes antimicrobianos.
Modificación del sitio donde actúa el antibiótico por la alteración de la configuración

estructural de los sitios activos, produciendo una pérdida de la afinidad entre el sitio activo y el
antibiótico.
Pruebas de sensibilidad
Se efectúan para determinar la resistencia de las bacterias a los antibióticos y a la vez medir la
actividad in vitro de un agente frente a una cepa determinada considerando una concentración
inhibitoria mínima (menor concentración de antimicrobiano capaz de inhibir el crecimiento

Alimentos
MICROORGANISMOS
Rev. 2 Hoja 2 de 4
bacteriano).
Estas pruebas pueden efectuarse por dilución, difusión en agar, gradiente de agar y métodos
automatizados.
2. OBJETIVO:
• Evaluar la eficacia de los agentes químicos mediante ensayos de inhibición bacteriana.
• Cepas (proporcionados por el profesor)

• Antimicrobianos
• Hisopos estériles
• Pinzas
• Mechero Bunsen
• Papel filtro
• Cajas petri con medio de cultivo
4. PROCEDIMIENTO:
1.- Usando hisopos estériles o asa de cultivo, sembrar masivamente 3 placas de agar nutritivo
con cada uno de los microorganismos.
2.- Colocar adecuadamente los sendiscos (discos de papel filtro impregnados con las
substancias antimicrobianas) con pinzas estériles sobre las placas de agar nutritivo sembradas.
Substancias antimicrobianas que se usarán:

I) Agentes tenso-depresores.
a) Jabones.
b) Detergentes.
c) Sales biliares.
II) Metales pesados.

III) Desinfectantes.
IV) Antibióticos y sulfas.

Alimentos
MICROORGANISMOS
Rev. 2 Hoja 3 de 4
3.- Incubar las cajas a 37°C.
RESULTADOS
Medir en milímetros el diámetro de los halos de inhibición producidos por cada uno de los
agentes antimicrobianos. Con los resultados obtenidos llenar la siguiente tabla.
Antimicrobiano Halo de inhibición (mm)

Alimentos
MICROORGANISMOS
Rev. 2 Hoja 4 de 4
5. CUESTIONARIO:
1. Menciona 3 ejemplos de Agentes Antimicrobianos contra bacterias Gram (-)
2. Explica el fundamento de las pruebas conocidas como “Antibiogramas”
3. Explica los efectos antimicrobiano de los siguientes agentes a nivel celular:
Agentes tensodepresores, Jabones, Sales biliares, Metales pesados, Desinfectantes

Antibióticos y sulfas.
4.- Actualmente se están estudiando los efectos antimicrobianos de los aceites esenciales,
busca 3 ejemplos.
6. BIBLIOGRAFIA:
México.
• Zinsser 1994, Microbiología. Ed. Panameriacana. Veinteaba edición.
7. ACTUALIZACIONES
Control de cambios

Alimentos
PRACTICA 12. RECUENTO DE
COLIFORMES: TECNICA DEL Asignatura: Microbiología General
NÚMERO MÁS PROBABLE(NMP)

Rev. 2 Hoja 1 de 4
1. INTRODUCCION.
Los microorganismos coliformes constituyen un grupo heterogéneo con hábitat

primordialmente intestinal , las bacterias coliformes totales comprende todos los bacilos Gram
negativos aerobios o anaerobios facultativos, no esporulados, que fermentan la lactosa con
producción de gas en un lapso máximo de 48 h. a 35°C ± 1ºC. El grupo de coliformes fecales
está conformado por 4 géneros principalmente: Enterobacter, Escherichia, Citrobacter y
Klebsiella, los cuales son capaces de fermentar la lactosa con producción de gas a las 48 h. de
incubación a
44.5 ± 0.1°C. Este grupo no incluye una especie determinada, sin embargo la más
prominente es Escherichia coli.
La determinación de microorganismos coliformes totales por el método del Número más
Probable (NMP), se fundamenta en la capacidad de este grupo microbiano de fermentar la
lactosa con producción de ácido y gas al incubarlos a
35°C ± 1°C durante 48 h., utilizando un medio de cultivo que contenga sales biliares. Esta
determinación consta de dos fases, la fase presuntiva y la fase confirmativa. En la fase
presuntiva el medio de cultivo que se utiliza es el caldo lauril sulfato de sodio el cual permite la
recuperación de los microorganismos dañados que se encuentren presentes en la muestra y que
sean capaces de utilizar a la lactosa como fuente de carbono. Durante la fase confirmativa se
emplea como medio de cultivo caldo lactosado bilis verde brillante el cual es selectivo y solo
permite el desarrollo de aquellos microorganismos capaces de tolerar tanto las sales biliares
como el verde brillante.

Alimentos

Rev. 2 Hoja 2 de 4
La determinación del número más probable de microorganismos coliformes fecales se realiza a

partir de los tubos positivos de la prueba presuntiva y se fundamenta en la capacidad de las
bacterias para fermentar la lactosa y producir
gas cuando son incubados a una temperatura de 44.5 ± 0.1°C por un periodo de
24 a 48 h.
2. OBJETIVO:
Evaluar el contenido de organismos coliformes mediante la técnica del Número Más Probable.
• Estufa de incubación
• Pipetas
• Asa bacteriológica
• Tubos con caldo lactosado
4. PROCEDIMIENTO:
1. Preparación de la muestra por el método seleccionado por el profesor.
2. Pipetear 1 ml de cada dilución en tubos de caldo lactosado, utilizando tres tubos por cada
dilución. Incubar los tubos 35-37° C, durante 24 y 48 hrs.
3. Pasadas las primeras 24 hrs, anotar los tubos que muestren producción de gas. Volver a
la estufa los tubos negativos para su incubación durante 24 hrs más.
4. Pasadas las 48 hrs, anotar los tubos que presenten producción de gas. Elegir la dilución
más alta en la que sean positivos de formación de gas los tres tubos y las diluciones más
próximas. Nota utilizar la tabla.
5. Confirmar los tubos de caldo seleccionado en el paso anterior que son positivos,
transfiriendo por sembrado por estría en placas de agar eosina azul de metileno.
Observar los medios sólidos de confirmación para ver si existen colonias típicas de
coliformes después de 24 y 48 horas de incubación a 35-37 ° C. La formación en el agar
eosina azul de metileno de colonias negras o con el centro negro, o bien de colonias
mucoides de color rosa-naranja confirman la presencia de organismos fecales.
6. Anotar el número de tubos confirmados como positivos de organismos coliformes en cada
dilución.
Alimentos

Rev. 2 Hoja 3 de 4
7. Para obtener el NMP, proceder de la forma siguiente. Ver en cada de las tres diluciones
seleccionadas el número de tubos en los que se confirmó la presencia de coliformes.
Buscar en la tabla del NMP y anotar que el número de tubos positivos de cada dilución.
Para calcular el NMP de organismos coliformes de acuerdo con la tabla 1
Tabla 1 Número más probable (NMP) de bacterias; tres tubos por cada dilución
Numero de tubos positivos Límites de confianza

en cada dilución
Dilución Dilución Dilución NMP por
10-1 10-2 10-3 gramo 99 % 95%
0 1 0 3 <1 23 <1 17
1 0 0 4 <1 28 1 21
1 0 1 7 1 35 2 27
1 1 0 7 1 36 2 28
1 2 0 11 2 44 4 35
2 0 0 9 1 50 2 38
2 0 1 14 3 62 5 48
2 1 0 15 3 65 5 50
2 1 1 20 5 77 8 61
2 2 0 21 5 80 8 63
3 0 0 23 4 177 7 129
3 0 1 40 10 230 10 180
3 1 0 40 10 290 20 210
3 1 1 70 20 370 20 280
3 2 0 90 20 520 30 390
3 2 1 150 30 660 50 510
3 2 2 210 50 820 80 640
3 3 0 200 <100 1900 100 1400
3 3 1 500 100 3200 200 2400
3 3 2 1100 200 6400 300 4800

Alimentos

Rev. 2 Hoja 4 de 4
5. CUESTIONARIO:
1. En qué consiste la técnica de diluciones para el sembrado de distintos tipos de muestras.

2. ¿Cuáles son los métodos alternativos que se pueden utilizar para la identificación y
cuantificaciones de los coliformes fecales?
3. Importancia de los coliformes fecales como un grupo indicador de la calidad sanitaria de
los alimentos
4. ¿A qué se debe la formación de gas en la campana de Durham?
5. ¿Cuál es el valor permisible de organismos coliformes fecales en aguas y bebidas de
acuerdo al estipulado SSA?
6. BIBLIOGRAFIA:
7. ACTUALIZACIONES
Control de cambios


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Manual Laboratorio de Microbiología

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Laboratorio de Ingeniería en

Asignatura: Microbiología General

Fecha de emisión: Febrero 2014

Elaboró: Lorena Luna Guevara.

Los microorganismos presentan grandes diferencias en sus requerimientos nutricionales que

En la microbiología el material gelificante es el agar químicamente es un polisacárido obtenido a

Dependiendo de su composición y su empleo pueden ser: diferenciales, selectivos, de

Conocer el procedimiento para la preparación de los distintos medios de cultivos para el

Aprobaciones: Academia de ……………………

Asignatura: Microbiología General

Fecha de emisión: Febrero 2014

• 10 cajas de petri estériles

Se recomienda la siguiente técnica

1. Utilizar un recipiente de volumen 2.5 veces mayor al que se prepara

1. Autoclave durante 15 min a 121 C ( 15 lbs)

Ejemplo de Preparación de los medios de cultivo:

AGAR PAPA DEXTROSA

Tabla 1: Fórmula aproximada para 1000 ml de agua purificada.

Aprobaciones: Academia de ……………………

Asignatura: Microbiología General

Fecha de emisión: Febrero 2014

Infusión de papa (sólidos) 4.0 g

Tabla 2: Fórmula aproximada para 1000 ml de agua purificada

Peptona de gelatina 5.0 g

pH final 6.8  0.2

AGAR MAC CONKEY

Tabla 3: Fórmula aproximada para 1000 ml de agua purificada.

Peptona de caseína 1.5 g

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Asignatura: Microbiología General

Fecha de emisión: Febrero 2014

Rojo neutro 0.03 g

pH final 7.1  0.2

1.- Diga usted que entiende por: esterilidad, séptico y antiséptico.

2.- Mencione 3 métodos de esterilización.

3.- Defina es un medio enriquecido, selectivo y diferencial.

4.- ¿Por qué se utilizan algodón para tapones?

5.- ¿Qué ventajas presenta el agar?

6.- ¿A quién se debe el empleo del agar en laboratorios?

7.- ¿Qué alteraciones se presenta en los medios por exceso de esterilización?

Zinsser 1994, Microbiología. Ed. Panameriacana. Veinteaba edición.

Tortora G., J.,2007, Introducción a la Microbiología, Ed Médica Panaméricana.

Manual de Medios de Cultivo. Bioxon

Aprobaciones: Academia de ……………………

Asignatura: Microbiología General

Fecha de emisión: Febrero 2014

Nivel de revisión Fecha de la emisión Razón de cambio

1 22 de junio de 2009 Generación de documento

2 X de febrero 2014 …….

Aprobaciones: Academia de ……………………

PRACTICA 4. OBSERVACION DE Asignatura: Microbiología General

Elaboró: Lorena Luna Guevara.

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PRACTICA 4. OBSERVACION DE Asignatura: Microbiología General

4) Leer las morfologías utilizando la hoja de reporte.

Tabla 1: Reporte de Morfología Colonial.

Colonia 1 Colonia 2 Colonia 3

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PRACTICA 4. OBSERVACION DE Asignatura: Microbiología General

8.- Luz reflejada:

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PRACTICA 4. OBSERVACION DE Asignatura: Microbiología General

Fig. 1 Forma y bordes

1.- ¿Por qué es importante leer la morfología colonial?