LABORATORIO DE

SALUD AMBIENTAL

PROCEDIMIENTO DE RECUENTO DE BACTERIAS HETEROTRÓFICAS

LSA P5.4-MG01

INDICE

1. OBJETIVO........................................................................................................... 2

2. ALCANCE ...................................................................................................... 2

3. DOCUMENTOS RELACIONADOS………... ……………………………………….……. 2

4. DEFINICIONES………………………..…………….….…………………………………... 2

5. RESUMEN …………………………………………………………………………………… 2

6. DESARROLLO……………………………….…………..…….……………………..……… 2

7. REFERENCIAS………………………………………………….…………………………… 5

8. ANEXOS …………..……………………………………………………………………...… 6

FECHA DE APROBACION: 02 de julio de 2008

FECHA DE REVISION: 01 de julio de 2008

REVISION: 01

NOMBRE CARGO FIRMA

Directora del Laboratorio de Salud

APROBO
Blga. Soledad Osorio Alva. Ambiental - DIGESA

Aseguramiento de calidad.
Blga. Edith Villanueva Laboratorio de Salud Ambiental –
Huamán DIGESA.
REVISO
Jefa del área de microbiología de
Blga. Ivonne Loayza
aguas. Laboratorio de Salud
Ramos.
Ambiental – DIGESA.
Analista del area de microbiologia
Blgo. Rafael Huapaya
ELABORO de águas. Laboratorio de Salud
Porras.
Ambiental – DIGESA.

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I OBJETIVO

Describir el método de ensayo para calcular el número de bacterias vivas heterótrofas en

muestras de agua de acuerdo a lo indicado en el Standard Methods for the Examination of Water
and Wastewater, 21th edition, 2005, sección 9215 B.

II ALCANCE

Este método se aplica a muestras de aguas de consumo humano, pozos.

III DOCUMENTOS RELACIONADOS

Instructivo de Preparación y control de medios de cultivo.

Instructivo de Evaluación de la calidad de los medios de cultivo
Procedimiento de Aseguramiento de la calidad de los Resultados.
Instructivo de Monitoreo Ambiental.

IV DEFINICIONES

a) Bacterias Heterotróficas: también se les conoce como heterótrofas, son aquellas bacterias que
usan compuestos del carbono orgánico como fuente de energía y el carbono para su
crecimiento, en contraposición con las bacterias autotróficas que utilizan los compuestos
inorgánicos como fuente de energía y el CO2 como fuente de carbono. Esta definición de
bacteria heterótrofa es amplia e incluye tanto a las bacterias saprofiticas como a las patógenas.

b) Recuento de bacterias heterotróficas: calculo del número de bacterias vivas heterótrofas que
existen en los diferentes tipos de agua para consumo humano.

c) Unidades formadoras de colonias (UFC). Es el número mínimo de células separables sobre la

superficie, o dentro de un medio de agar que da lugar al desarrollo de una colonia visible del
orden de decenas de millones de células descendientes. Las UFC pueden ser pares, cadena o
racimos, así como células individuales. Las “Unidades Formadoras de Colonias” (UFC) se miden
en UFC/mL, UFC por mililitro.

V RESUMEN

El recuento de bacterias heterotróficas en placa, anteriormente denominado recuento estándar

en placa, consiste en agregar un mililitro de muestra o de la dilución de la muestra a una placa
petri estéril, por duplicado, y verter un volumen adecuado de agar plate count; el cuál debe estar
a una temperatura de 45º a 46º C, luego se realiza la homogenización, se deja solidificar e
incuba a 35 ± 0,5º C por 48 horas. El conteo de las colonias se expresa como UFC / mL.

VI DESARROLLO

6.1 Medios de cultivo

6.1.1 Agar Plate Count (triptona glucosa extracto de levadura agar)

Composición:
Triptona 5,0 g
Extracto de lavadura 2,5 g
Glucosa 1,0 g
Agar 15,0 g
Agua destilada 1 L.

Preparación

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Disolver el medio deshidratado de acuerdo a lo indicado por el fabricante, calentar hasta su

completa disolución, agitar en forma frecuente, evitando que hierva. Repartir en frascos o tubos,
tapar y esterilizar en autoclave durante 15 minutos a 15 lbs de presión y 121ºC el pH final debe
ser de 7,2 ± 0,2 a 25ºC.

6.1.2 Agua de dilución (Solución tampón de fosfato)

Para preparar el agua de dilución (solución de tampón de fosfato), es necesaria la preparación

de soluciones Stock A y B.

Solución Stock A: Disolver 34 g de fosfato monopotásico (fosfato di hidrogeno de potasio)

(KH2PO4) en 500ml. de agua destilada, ajustar el pH a 7,2 ± 0,5 con hidróxido de sodio (NaOH)
al 1N, y completar el volumen a un litro con agua destilada. Autoclavar por 15 minutos a 121°C.
Solución Stock B: Disolver 81.1 g de cloruro de magnesio (MgCl26H2O) en un litro de agua
destilada. Autoclavar por 15 minutos a 121°C.
Agregar 1.25 mL. de la dilución Stock A y 5 ml. de la solución Stock B a un litro de agua
destilada. Distribuir en frascos en cantidades adecuadas 9 ± 0,2 mL 0 90 ± 2 mL, y autoclavar
por 15 minutos a 121°C.

6.2 Equipos y Materiales.

Adicionalmente a lo requerido en el Instructivo de preparación de medios de cultivo y reactivos.

6.2.1 Incubadora de aire caliente a 35 ± 0,5 ºC

6.2.2 Frascos con agua de dilución, Con una capacidad de 100 ml., autoclavables.
6.2.3 Pipetas serológicas de 10 mL. Deben ser exactas dentro de una tolerancia de ± 2.5%.
6.2.4 Placas petri de vidrio 100 x15mm esterilizables.

6.3 Preparación de la muestra

6.3.1 Luego de colectar la muestra como lo indica el procedimiento de toma de muestra. Iniciar el
análisis lo antes posible para reducir al mínimo las alteraciones de la población microbiana. El
tiempo máximo recomendado que puede transcurrir entre la toma de muestra y el análisis es de
8 horas (tiempo máximo de traslado 6 horas y 2 horas de tiempo de procesamiento). Si el
análisis no puede iniciarse en las primeras 8 horas, mantener la muestra a una temperatura
inferior a 4 ° C, pero sin congelarla. No debe permitirse que el intervalo máximo entre la toma de
muestra y el análisis supere las 24 horas.

6.3.2 Antes de proceder al análisis, marcar cada placa con el código de la muestra, fecha y la dilución.

6.3.3 Mezclar cuidadosamente todas las muestras o diluciones mediante movimientos completos de
arriba abajo (y de adelante a atrás). También se puede utilizar un agitador mecánico durante 15
segundos para agitar la muestra o las diluciones.

6.4 Diluciones de la muestra

6.4.1 Disponer del agua de dilución previamente preparado como se señala en el numeral 6.1.2

6.4.2 Las diluciones se realizaran de forma que el número de colonias en una placa sea 30 a 300
colonias. Por ejemplo si se sospecha que el recuento de heterótrofos en placa alcanzará 3000,
-2
se prepararán placas con diluciones de 10 . En la mayoría de muestras de agua de consumo
humano se obtendrán placas adecuadas para realizar el recuento, sembrando 1 ml y 0,1 ml de la
-2
muestra no diluida y 1 ml de una dilución 10 .

6.4.3 Para realizar las diluciones, utilizar una pipeta esterilizada, la cual debe ser cambiada para cada
dilución que se prepare. Si la pipeta se contamina antes de haber acabado el pase, substituirla
por otra esterilizada.
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6.4.4 No preparar diluciones y/o efectuar el plaqueado (vertido del agar) bajo luz solar directa. Se
deberá tener cuidado al sacar las pipetas esterilizadas del envase, sin pasar el extremo de la
pipeta a través de los extremos expuestos de las pipetas del envase o por la boca o el cuello de
los frascos de dilución. Cuando se tome la muestra, no insertar la pipeta más de 2 ó 3 cm del
nivel de la superficie de la muestra o de la dilución.

6.4.5 Cuando se transfiera la muestra utilizar una pipeta de 1 mL, la cual debe mantenerse en un
ángulo de alrededor de 45º C con la punta tocando el fondo de la placa petri o dentro del cuello
del frasco de dilución. Levantar la tapa de la placa petri lo suficiente para introducir la pipeta. Se
dejará que el líquido drene en su totalidad, tocar una vez con la punta de la pipeta en un punto
seco del fondo de la placa. Cuando se midan cantidades de 0,1 mL, déjese que la muestra drene
desde la graduación elegida como referencia hasta que se haya vertido 0,1 mL, retirando la
pipeta sin que toque la placa. Utilizar diluciones decimales para preparar las muestras de
volúmenes inferiores a 0,1 mL. Al analizar aguas residuales o turbias, no se medirá el inoculo de
0,1 mL de la muestra original, si no que se preparará una dilución adecuada.

6.4.6 Preparar dos placas por dilución. Después de depositar el inoculo verter el medio de cultivo y
mezclar cuidadosamente. No dejar transcurrir más de 20 minutos entre el inicio del pipeteado y la
adición del medio a las placas.

6.5 Plaqueo

6.5.1 Licuar el agar plate count, con mucho cuidado evitando que hierva, mantener el medio líquido en
un baño de agua entre 44 y 46 ° C hasta que llegue el momento de usarlo. No se debe confiar en
el tacto como un indicador de la temperatura del medio cuando vaya a añadirse al agar. No se re
esterilizará el medio. Desechar el agar líquido que contenga precipitado.

6.5.2 Limitar el número de muestras a ser plaquedas a una serie, de manera que no transcurran más de
20 minutos (preferiblemente 10 minutos) entre la dilución de la primera muestra y la adición del
medio a la última placa de la serie. Verter de 15 a 20 mL del medio licuado mantenido de 44 a
46º C en cada placa petri levantando suavemente la tapa de la placa lo suficiente para agregar el
agar. Evitar el vertido del medio fuera del envase o en el borde de la placa. Cuando se vierte el
agar de frascos o tubos que han sido mantenidos en agua, secar con un papel toalla y flamear el
cuello del frasco antes de verter el agar. Una vez añadido el medio a todas las placas, mezclar
cuidadosamente el medio líquido con la porción de muestra previamente colocada en la placa,
con cuidado de no proyectar la mezcla contra el borde, girando primero la placa en una dirección
y después en dirección opuesta o haciendo girar la placa en forma de ocho varias veces. Dejar
solidificar la placa durante 10 minutos e inviértanse y colóquense en la incubadora.

6.5.3 Controles: comprobar la esterilidad del medio y de los blancos de agua de dilución preparando
con ellos placas fluidas en cada serie de muestras. Preparar controles adicionales para
determinar la contaminación de las placas, las pipetas y del ambiente.

6.5 Incubación

6.5.1 Incubar a 35ºC x 48 horas.

6.6 Recuento de colonias.

6.6.1 Inmediatamente después de la incubación, contar todas las colonias de las placas seleccionadas
haciendo uso del contador de colonias. Cuando no se disponga de este tipo de instrumento,
utilizar cualquier otro contador, siempre que proporcione aumento e iluminación equivalente.
Registrar en el reporte de los resultados los controles realizados por cada lote de muestra.

6.6.2 Considerar solo las placas que tienen entre 30 y 300 colonias. Calcular el recuento bacteriano
por mililitro, multiplicando el número promedio de colonias de las dos placas seleccionadas
perteneciente a la misma dilución por el inverso de la dilución utilizada. Reportar UFC/ mL.
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6.6.3 Si ninguna de las placas de una muestra tiene colonias, reportar un recuento inferior a una vez el
recíproco de la dilución mas baja (<1).

6.6.4 Cuando el número de colonias por placa supere ampliamente las 300, no reportar resultados del
2
tipo “Demasiados numerosas para el recuento” (DNPR). Para menos de 10 colonias /cm , contar
las que existen en 13 cuadrados (del contador de colonias) representativos de la distribución de
las colonias. Si es posible seleccionar 7 cuadrados consecutivos horizontales a través de la placa
y 6 cuadrados consecutivos verticales, con la precaución de no contar más de una vez un mismo
2
cuadrante. Multiplicar la suma del número de colonias de los 13 cm representativos por 5, para
3
calcular el número de colonias por placa, cuando el área de esta sea de 65 cm .
2 2
6.6.5 Si hay mas de 10 colonias/ cm , contar 4 cuadrados significativos, calcular el promedio por cm
y multiplicar por el factor adecuado para obtener el número de colonias por placa. El factor es de
57 para las placas desechables de plástico y de 65 para las de vidrio. Cuando los recuentos
bacterianos superen las 100 colonias reporte el resultado mayor de (>) 6500 veces el inverso de
la dilución mas alta, en el caso de placas de vidrio, y mayor de 5,700 veces el recíproco, en el de
las placas de plástico. Reportar como recuento estimado de UFC/mL.

6.6.6 Cuando aparezcan colonias expansivas en la placa seleccionada, contar como una unidad cada
uno de los siguientes tipos: cadenas de colonias que parezcan ser consecuencia de la
desintegración de un grupo de bacterias al mezclar el agar y la muestra; expansiones que se
desarrollen como placas de crecimiento entre el agar y la base de la placa petri. Contar como
colonias individuales aquellas que posean aspecto de colonias y crezcan muy cerca unas de
otras, aunque sin tocarse, siempre que la distancia entre ellas sea al menos igual al diámetro de
la colonia más pequeña. También se contaran como colonias individuales las adyacentes con
aspecto distinto en lo que se refiere a forma color etc.

6.6.7 Si hay exceso de crecimiento expansivo en una placa, considerar como “diseminantes”. En caso
de que las placas resulten incontables por que se haya perdido el factor de dilución, se hayan
caído accidentalmente; estén contaminadas o las placas de control indiquen que el medio, otros
materiales o el instrumental estén contaminados, se referirán en el reporte como “accidente de
laboratorio”

6.7 Reporte

6.7.1 Cuando se hace un recuento de colonias en placas duplicadas y/o en diluciones consecutivas y
se obtiene una media de los resultados antes de informar, solo se presentaran los recuentos con
dos cifras significativas al convertirlos en unidades formadoras de colonias.

6.7.2 Evitar una precisión y seguridad ficticia al calcular las unidades formadoras de colonias
registrando solo los dos primeros dígitos de la izquierda. Cuando el tercer dígito de la izquierda
es 5, 6, 7,8 o 9, se aumentar en una unidad el segundo dígito de la izquierda; utilizar ceros para
cada uno de los dígitos hacia la derecha a partir del segundo. Por ejemplo reporte un recuento
de 142 como 140 y uno de 155 como 160, mientras que uno de 35 se reportara como 35.

VII REFERENCIAS
th
7.1 Standard Methods for the Examination of water and wastewater, 21 Edition, 2005. (9215 B).
Recuento de Bacterias Heterotróficas en placa.

VIII ANEXOS

N ° ANEXO TITULO
1 Diagrama de Flujo del Procedimiento

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ANEXO 1: Diagrama de flujo del Procedimiento

10 mL

Muestra

1 ml 10-1 1 ml

Agar Plate Count Control

Blanco

Incubar a 35º C
48 hrs.

Recuento de colonias

UFC Bacterias Heterotróficas / ml

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