UNIVERSIDAD NACIONAL DE INGENIERIA

FACULTAD DE INGENIERÍA AMBIENTAL

ESCUELA PROFESIONAL DE INGENIERÍA AMBIENTAL

PREPARACION DE MEDIOS DE CULTIVO

SEGUNDO LABORATORIO DEL CURSO MICROBIOLOGIA AMBIENTAL BO-112

ESPINOZA QUIÑONES FRANKLIN-20171233D

SANCHEZ CHAVEZ MIGUEL- 20174535A
DE LA CRUZ OSORIO DANIEL -20172621H

DOCENTE: MSc. Blgo. ALVARO MARTÍN MARTÍNEZ VILA

Lima, Perú
27 de abril de 2018
1. RESUMEN
Las prácticas en el desarrollo de la experiencia en los análisis químicos, son
irreemplazables e ilustran, los procesos biológicos que se pretende alcanzar
mediante guías o instrucciones a seguir. El laboratorio de microbiología,
permite seguir con esta idea del conocimiento práctico. Hace parte esencial,
tener claro los procesos que se necesitan en este tipo de práctica, que en
claridad no son las mismas precauciones que se toman en un laboratorio de
química orgánica e inorgánica. En este tipo de prácticas es necesario que el
ambiente y los objetos estén esterilizados, esto, para permitir un ambiente
libre de bacterias o microorganismos, puesto que en sí, el desarrollo de las
actividades se basan en inocular organismos específicos, en medios de
cultivos ricos en sustancias nutricionales. Se desarrolló la interiorización
conceptual sobre términos del entorno del laboratorio microbiológico, como
parte de los objetivos a alcanzar en la práctica, como lo que, los principios
generales de la preparación y técnicas de esterilización de los materiales y
los medios de cultivo. La orientación que a partir del conocimiento del
profesor, que ilustró acerca del uso de la autoclave, este es un equipo de uso
común en la esterilización puesto que con su proceso de calor húmedo, en el
que se ve afectada la estabilidad de estructuras celulares y de sus proteínas,
es pertinente para la esterilización de medios de cultivo, materiales de vidrio
y cultivos bacterianos que se desechen. También se comprendió el concepto
de medio de cultivo. Este, constituye al aporte de nutrientes indispensables
para el crecimiento de los microorganismos. Este, permite que la especie
que se quiera cultivar, crezca dependiendo de su grupo microbiano, su
estado físico, su complejidad química y su aplicación.
2. INTRODUCCION

Uno de los sistemas más importantes para la identificación de

microorganismos es observar su crecimiento en sustancias alimenticias
artificiales preparadas en el laboratorio. El material alimenticio en el que
crecen los microorganismos es el medio de cultivo y el crecimiento de los
microorganismos es el cultivo. Para que las bacterias crezcan
adecuadamente en un medio de cultivo artificial debe reunir una serie de
 condiciones como son: temperatura, grado de humedad y presión de
oxígeno adecuado, así como un grado correcto de acidez o alcalinidad. Un
medio de cultivo debe contener los nutrientes y factores de crecimiento
necesarios y debe estar exento de todo microorganismo contaminante. La
mayoría de las bacterias patógenas requieren nutrientes complejos similares
en composición a los líquidos orgánicos del cuerpo humano. Por eso, la base
de muchos medios de cultivo es una infusión de extractos de carne y
peptona a la que se añadirán otros ingredientes. El agar es un elemento
solidificarte muy empleado para la preparación de medios de cultivo. Se licúa
completamente a la temperatura del agua hirviendo y se solidifica al enfriarse
a 40 grados. Con mínimas excepciones no tiene efecto sobre el crecimiento
de las bacterias y no es atacado por aquellas que crecen en él. La gelatina
es otro agente solidificarte pero se emplea mucho menos ya que bastantes
bacterias provocan su licuación. En los diferentes medios de cultivo
se encuentran numerosos materiales de enriquecimiento como hidratos de
carbono, suero, sangre completa, bilis, etc. Los hidratos de carbono se
adicionan por dos motivos fundamentales: para incrementar el valor nutritivo
del medio y para detectar reacciones de fermentación de los
microorganismos que ayuden a identificarlos.
El desarrollo adecuado de los microorganismos en un medio de cultivo se ve
afectado por una serie de factores de gran importancia y que, en algunos
casos, son ajenos por completo al propio medio.

3. OBJETIVOS:
 Preparar medios de cultivo como soporte y fuente de nutrientes para
el desarrollo de los microorganismos in vitro.
 Manejar los instrumentos de uso rutinario, a la vez que
imprescindibles, en el laboratorio de microbiología.
 Hacer un primer acercamiento a la manipulación de
microorganismos. Adquirir la idea de la importancia del trabajo en
condiciones de esterilidad y las técnicas más comunes para
realizarlo.
  Diferenciar los diversos tipos de medios y su aplicación adecuada de
acuerdo al tipo de microorgaanismo a cultivar.

4. MARCO TEORICO

Un medio de cultivo es un sustrato o una solución de nutrientes que permite

el desarrollo de microorganismos. En las condiciones de laboratorio para
realizar un cultivo, se debe sembrar sobre el medio de cultivo elegido las
muestras en las que los microorganismos van a crecer y multiplicarse para
dar colonias.
Los microorganismos son los seres más abundantes de la tierra, pueden vivir
en condiciones extremas de pH, temperatura y tensión de oxígeno,
colonizando una amplia diversidad de nichos ecológicos. Entre los
requerimientos más importantes para su desarrollo están el carbono, el
oxígeno, nitrógeno, dióxido de carbono e hidrógeno. Muchas bacterias sin
embargo necesitan del aporte extra de factores de crecimiento específicos
en forma de suero, sangre y extracto de levadura entre otros.
Clasificación de los medios de cultivo
Según su origen:
a) NATURALES: son los preparados a partir de sustancias naturales de
origen animal o vegetal como ser extractos de tejidos o infusiones y cuya
composición química no se conoce exactamente.
b) SINTÉTICOS: son los medios que contienen una composición química
definida cuali y cuantitativamente. Se utilizan para obtener resultados
reproducibles.
c) SEMISINTÉTICOS: son los sintéticos a los que se les añaden factores de
crecimiento bajo una forma de un extracto orgánico complejo, como por
ejemplo extracto de levadura.
Según su consistencia
a) LÍQUIDOS: se denominan caldos y contienen los nutrientes en solución
acuosa.
b) SÓLIDOS: se preparan añadiendo un agar a un medio líquido (caldo) a
razón de 15g/litro. El agar es una sustancia inerte polisacárida (hidrato de
carbono) que se extrae de las algas. Como esta sustancia no es digerida por
las bacterias no constituye ningún elemento nutritivo. Este conjunto
convenientemente esterilizado puede ser vertido en placas de Petri o en
tubos de ensayo y presentan la posibilidad de aislar
y diferenciar bacterias, "procesos que antes no eran posibles en medio
líquido".
c) SEMISÓLIDOS: contienen 7,5 g de agar /litro de caldo. Se utilizan para
determinar la motilidad de las
especies en estudio.
Actualmente se encuentran disponibles comercialmente con el agregado de
agar.
Según su composición: A causa de los requerimientos químicos del mundo
microbiano, a veces es necesario agregar o eliminar componentes químicos
del medio.
a) COMUNES O UNIVERSALES: su finalidad es el crecimiento de la mayor
parte de los microorganismos poco existentes. Es el medio más
frecuentemente utilizado para mantener colonias microbianas. Por ejemlo:
agar común o caldo común.
b) ENRIQUECIDOS: están compuestos de un medio base como apoyo del
crecimiento al cual se le puede agregar un gran exceso de nutrientes como
suplementos nutritivos, por ejemplo: sangre, suero, líquido ascítico, etc. Se
utiliza para microorganismos que tienen grandes exigencias nutricionales.
c) SELECTIVOS: son sólidos en los que la selectividad se consigue
alterando las condiciones físicas del medio o añadiendo o suprimiendo
componentes químicos específicos con el fin de inhibir el crecimiento de
especies químicas cuyo crecimiento no interesa. Este tipo de medio sólo
permite el crecimiento de un grupo de microorganismos e inhibiendo el de
otros. Se utiliza para seleccionar y aislar microorganismos a partir de
poblaciones mixtas. Por ejemplo Agar salado-manitol o Chapman (permite el
crecimiento de ciertos estafilococos).
Entre los factores selectivos que alteran las condiciones del medio tenemos:
Cambio de pH: por ejemplo agregando ácido acético para favorecer el
crecimiento de Lactobacillus (pH final: 5,4 que es hostil par la mayoría de las
especies que crecen entre 6,5 y 7,2). Los hongos crecen entre pH 4 y 6 y S.
faecalis a pH 9,6.
Cambio de temperatura: la mayoría de las bacterias crece óptimamente
entre 20º C y 40º C. Los cultivos típicos de S. Faecalis requieren 60º C de
temperatura y los de Listeria son capaces de desarrollarse y crecer a 4º C.
Alteraciones osmóticas: se acrecientan las propiedades osmóticas un
medio con el agregado de cloruro de sodio. Estos medios intensifican la
selección de bacterias halófilas como Staphylococcus spp. (7,5%).
Ajuste en la tensión de oxígeno: es importante en la selección de aerobios
y anaerobios.
Ajuste en la tensión de anhídrido carbónico: muchos patógenos
importantes pueden ser cultivados a menos que se eleve la tensión más allá
de la atmosférica.
Entre los factores que inhiben el crecimiento de bacterias indeseables
tenemos:
Antisépticos: sustancias antibacterianas inespecíficas que pueden actuar
como inhibidores. Por ejemplo:
el medio de cultivo comercial S - S (Salmonella - Shigella) que contiene
verde brillante (inhibe las bacterias grampositivas) y sales biliares (que
inhiben un gran número de gramnegativas menos enterobacterias). Otro
ejemplo es el medio de Mc Conkey que contiene cristal violeta (inhibe las
grampositivas pero no las enterobacterias)
Antibióticos: sustancias antibacterianas específicas que impiden el
crecimiento de aquellos microorganismos que no nos interesa que crezcan
en ese medio. Un ejemplo es el medio de Thayer - Martin con VCN
(vancomicina, colistina y nistatina) que se utiliza para el aislamiento de
gonococos. La penicilina en una concentración de 5,50 unidades/ ml inhibe
la mayoría de las grampositivas. Otro ejemplo es el medio de Sabourand -
cloranfenicol para el aislamiento de Cándida albicans.
d) DIFERENCIALES: son medios de cultivos que nos permiten distinguir
entre varios géneros y especies de microorganismos. Por ejemplo si al
medio se le ha añadido un carbohidrato y un indicador y la bacteria que se
cultiva es capaz de fermentar dicho carbohidrato, se produce una
acidificación del medio con el consiguiente viraje de color del indicador por el
cambio de pH. El citrato de Simmons es un medio cuya única fuente de
carbono es el citrato sódico, entonces en él solo crecerán las bacterias
capaces de desarrollarse utilizando como única fuente de carbono ese
componente. A menudo la separación se basa en la diferencia de color de
las colonias aisladas, como en el agar con azul de metileno - eosina que
permite diferenciar E. coli (colonias oscuras y de brillo metálico) de
Enterobacter aerogenes (colonias rosadas de centro azul sin brillo). Estos
dos microorganismos en agar nutritivo producen colonias de color gris
blancuzco.
Suelen ser a la vez selectivos, por lo tanto solo crecerán determinadas
bacterias (pueden ser dos o más tipos) que al actuar sobre alguno de los
componentes específicos del medio, demuestran algunas de sus
propiedades o características y nos permite diferenciar entre ambos tipos.
e)DE ENRIQUECIMIENTO: son medios líquidos que contienen un agente
que inhibe las especies no deseadas pero que favorece el crecimiento
irrestricto del agente infeccioso. El medio de Muller - Kauffman, permite el
crecimiento de Salmonella inhibiendo a su vez el de numerosos coliformes.
Esto es de gran importancia ya que en ciertas muestras, por ejemplo fecales,
el agente infeccioso (Salmonella) es frágil y puede ser superado en número
por agente bacterianos indígenas como E. coli; por lo tanto antes de realizar
las pruebas de laboratorio es necesario aumentar su número con respecto a
ésta en un caldo de enriquecimiento. Ejemplo de este tipo son los caldo de
tetrationato y selenito. El agua de peptona alcalina se utiliza para Vibrio
cholerae.
El enriquecimiento es una técnica que utiliza un medio selectivo líquido para
permitir el desarrollo de un microorganismo a partir de una muestra que
contiene una gran variedad de microorganismos. Así, aquellos
microorganismos para los que el ambiente sea más favorable crecerán más
que los otros y finalmente serán predominantes
f)DE TRANSPORTE: son utilizados para asegurar la viabilidad de la bacteria
sin multiplicación significativa de los microorganismos desde el momento de
su extracción hasta su posterior estudio. Se utilizan generalmente cuando las
muestras deben ser enviadas de un laboratorio a otro. Se recomienda un
límite de dos horas desde la recolección de las muestras y su estudio en el
laboratorio, pero este límite de tiempo es superado (frecuentemente cuando
se trata de muestras tomadas en un consultorio). Esta demora hace
necesario el uso de medios de transporte adecuados. Los medios de
transporte más frecuentemente utilizados son los de Stuart, Amies y Carey -
Blair. Existe una unidad descartable de cultivo de transporte llamada
Culterette que consiste en un tapón estéril de poliestireno y un ampolla en la
parte inferior que se rompe cuando se ejerce presión liberando el medio de
transporte de Stuart alrededor del extremo del tapón impregnado en la
muestra.
Hasta hace algunos años los componentes orgánicos mencionados debían
ser obtenidos por el microbiólogo y el medio de cultivo se preparaba en el
laboratorio. Actualmente se dispone comercialmente de la mayor parte de los
medios e incluso de sus componentes adicionales.
Un gran número de medios de cultivo usados en el laboratorio de
microbiología son mixtos, es decir que tienen como finalidad la de varios
grupos de los mencionados, por ejemplo, el agar S- S es selectivo (pues
tiene un inhibidor: el verde brillante) y es a la vez un medio diferencial (lleva
lactosa y un indicador) que permite diferenciar las bacterias fermentadoras o
no de dicho polisacárido. El medio de Thayer y Martin para Neisseria es un
medio enriquecido (contiene plasma) y es selectivo (tiene 3 antibióticos
inhibidores de la flora bacteriana y fúngica: colistina, vancomicina y
nistatina).

Los medios de cultivo que se realizaron fueron los siguienetes:

Agar Plate Count: No es un medio selectivo. Es un medio de cultivo
recomendado para el recuento de bacterias aerobicas en aguas, aguas
residuales productos lacteos y otros alimentos. Tambien es recomendado
como medio general paara determinar poblaciones microbianas. Esta
compesto por extracto de levadura, glucosa, tripteina como la fuente de
peptidos (moleculas formadas por la union de varios aminoacidos),
aminoacidos y nitrogeno. Tiene un ph aproximado de 7.
Agua Peptonada: Es un medio usado como diluyentepara enriquecimiento
bacteriano a partir de alimentos y otros materiales de interes sanitario. No es
selectivo, recomendado para ser utilizado en lugar de solucion fisiologica
para recuperar celulas de enterobacterias dañadas por procesos
fisicoquimicos, a los que ha sido sometido el aimento. Si es utilizado coomo
medio base para la fermantacion de hidratos de carbono, se debe adicionar
el indicador de Andrade y el hidrato de carbono en cuestion. Contiene
peptona de carne y cloruro de sodio. Su ph final es de 7.2.
 Caldo Nutritivo: Medio de cultivo utilizado para propósitos generales, para
el desarrollo de microorganismos con escasos requerimientos nutricionales.
Está descripto en muchos procedimientos para el análisis de alimentos,
aguas y otros materiales de importancia sanitaria. Medio no selectivo,
contiene pluripeptona (una mezcla de partes iguales de peptona de carne y
de caseína) y extracto de carne que constituyen la fuente de carbono y
nitrógeno necesarias para el adecuado desarrollo bacteriano. Puede ser
utilizado además, como pre enriquecimiento en la búsqueda de Salmonella
spp. a partir de alimentos, ya que permite recuperar células dañadas, diluir
metabolitos tóxicos y sustancias inhibitorias.
Caldo BHI: Brain Heart Infusion (B.H.I) , Infusión Cerebro Corazón, es un
medio líquido , de enriquecimiento indicado su uso para el cultivo de una
gran variedad de microorganismos exigentes nutricionalmente, tanto
aerobios como anaeróbios, así como de hongos y levaduras, tanto de
muestras clínicas como no clínicas. El caldo BHI es un medio de cultivo
nutritivo tamponado, que contiene infusiones de tejidos de cerebro y corazón
además de peptonas, que suministran proteínas y otros nutrientes
necesarios para favorecer el crecimiento de microorganismos exigentes y no
exigentes.

5. PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL
MATERIALES

Es un recipiente redondo, de cristal o

plástico, con una cubierta de la misma
forma que la placa, pero algo más
Placa Petri grande de diámetro, para que se pueda
colocar encima y cerrar el recipiente,
aunque no de forma hermética. .
Es un frasco cilíndrico de plástico o
Piceta vidrio con una abertura parecida a la de
una pajita. Se utiliza para contener
algún solvente, por lo general agua
destilada
 Gradillas Utilizada para sostener y
almacenar gran cantidad de
tubos de ensayo

Instrumento volumétrico que consiste en

Probeta
Tubos un cilindro Permite
de ensayo graduadocontener
de vidrio pírex que
pequeñas
permite contener
muestraslíquidos y sirve para
liquidas y realizar
medir volúmenes de forma
reacciones aproximada
a pequeña escala

Es un frasco transparente de
forma cónica con una abertura en el
Vaso de precipitado
Erlenmeyer extremo Recipiente
angosto, cilíndrico de vidrio
generalmente
prolongadoutilizad
con un comúnmente enqueel
cuello cilíndrico,
laboratorio,
suele incluir algunas sobre
marcas. todo,
Porpara
su
preparar
forma es útil o calentar
para realizar sustancias
mezclas por
y traspasar líquidos
agitación y para la evaporación
Estos dos elementos sirven
controlada de líquidos.
Papel craft y pabilo
La Rejilla paradeasegurar
Asbesto, los Erlenmeyer
en los
Rejilla de y no
laboratorios, esentre ni salga nada.
la encargada de repartir
asbesto la temperatura de manera uniforme
cuando se calienta con un mechero,
Pipetas Instrumento
evitando que volumétrico
entre en contacto de
directo
laboratorio
con la llama que permite
y que el envase medir
de vidrio se
rompa porla los
alícuota de unbruscos
cambios líquido con
de
mucha precisión. Suelen ser
temperatura.
de vidrio
Instrumento utilizado en los
laboratorios científicos para
calentar, esterilizar o proceder
Mechero de Bunsen a la combustión de muestras o
reactivos químicos
EQUIPOS
Aparato cuya función común es
crear un ambiente con la
Incubadora humedad y temperatura
adecuados para el crecimiento
o reproducción de seres vivos.

Recipiente de presión metálico

Autoclave de paredes gruesas con un
cierre hermético que permite
trabajar a alta presión para
realizar una reacción industrial,
una cocción o una
esterilización con vapor de
agua.
Se utilizan para conservar
Frigorífico tanto materiales (medios de
cultivo, reactivos) como
microorganismos.
Generalmente están a una
temperatura fija de 4ºC.
Una cocina eléctrica es una
Hornilla eléctrica variación de la cocina que
convierte la electricidad en
calor para cocinar y hornear.
 Se utiliza para medir la masa
Balanza de una sustancia

METODOLOGIA
AGAR DE PLATA COUNT

6.75 gramos de APC Disolver con 300ml de agua destilada

Hasta Fundir el agar Calentar en la hornilla eléctrica la solución

Llevar al autoclave (esterilizar) 121oC x 15´ Conservar a 4oC

AGUA PEPTONADA

0.15 g de peptonada Disolver en 150mililitro de agua destilada

90ml (matraz de 250) 9ml (en 5 tubos de ensayo)

Todo el material al autoclave (121o x 15´)

Conservar en la refrigeradora ( 4oC)

CALDO NUTRITIVO (CN)

4.81 g del medio Disolver en 130 ml de agua destilada

Todo el material a la autoclave (121o x 15´) Colocar 10ml del caldo en 12 tubos

Conservar a 4oC
CALDO BHI

4.81 g de caldo BHI Disolver en 130ml de agua destilada

Todo el material a la autoclave (121o x 15´) Conservar a 4oC

6. RESULTADOS
El resultado principal es que los medios de cultivos se realizaron en
condiciones optimas por lo que sern muy buenas para cultivar
microorganismosy observar las colonias que se formaaran en ella y poder
contabilizarlas facilmente.
7. CONCLUSIONES
Al concluir la práctica se concluyó en lo siguiente: Se logró conocer los
diferentes medios de cultivos para sembrar microorganismos. Aprendimos
los pasos para elaborar un medio de cultivo, sus cálculos respectivos de las
cantidades necesarias para su preparación. Se determinó la importancia que
tiene los medios de cultivo en una investigación en el campo agrícola como
en la medicina, industria alimentaria ya que gracias a ello se puede hacer el
aislamiento de microorganismos tanto patógenos como benéficos y así
identificarlos para su posterior uso. Como estudiantes de agronomía gracias
a la práctica en el laboratorio de microbiología desarrollamos nuestros
conocimientos en lo que respecta a medios de cultivo y así poder aplicar en
nuestra vida profesional.
8. RECOMENDACIONES
 Al hacer este laboratorio debemos estar con los EPP del laboratorio
de microbiología como los lentes, bata, guantes, mascarilla, que nos
servirán para este y los próximos laboratorios, en cuidar mejor
nuestro medio de cultivo ya que sin estos EPP, sería más vulnerable
nuestros medios de cultivo a otros microorganismos.
 Tener los materiales de uso esterilizados para un mejor manejo y
resultado del laboratorio.
 Al preparar las soluciones usar las cantidades indicadas para no
desperdiciarasi como para lograr el rendimiento requerido.
9. FUENTES DE INFORMACION
 Clavell L. Pedrique de Aulacio. 1992. Manual de Metodos Generales.
Segunda edicion.
 Difcol y BBL. 2003. Manuel de Medios de Cultivo Microbilogicos.

10. ANEXOS
 Autoclave Licuadora

Microscopio Horno esturilizador

Materiales de pirex Estufa

Contador de colonias