PONTIFICIA UNIVERSIDAD CATÓLICA DE CHILE

ESCUELA DE INGENIERÍA
DEPARTAMENTO DE INGENIERÍA HIDRÁULICA Y AMBIENTAL
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LABORATORIO 1:
MEDIOS DE CULTIVO Y MICROSCOPÍA
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ICH3350 - MICROBIOLOGÍA APLICADA A LA INGENIERÍA AMBIENTAL

PROFESOR: IGNACIO VARGAS

​GRUPO 4
TRINIDAD GUTIÉRREZ
HEBER HERRERA
TOMÁS KAULEN
MATÍAS LEYTON
ARTURO VIAL

26 DE ABRIL, 2019
Resumen ejecutivo

La corrosión en materiales se presenta en diferentes ámbitos y áreas industriales. En este

contexto, el laboratorio busca identificar y estudiar un problema de este tipo que ha
afectado a una empresa, mostrando pérdidas de carga de agua en tuberías o acueductos.

Como hipótesis de problema planteado, se cree que la corrosión puede deberse a

microorganismos presentes al interior del ducto. Para evidenciar esta idea, se debe analizar
el agua proveniente de un lavado realizado a la tubería dañada, a modo de evaluar la
presencia (o ausencia) de microorganismos que participen en procesos asociados a la
corrosión y la carga bacteriana presente en la muestra.

El trabajo de laboratorio fue guiado por los ayudantes y consistió en la preparación de

medios de cultivo heterotróficos definidos y complejos, el ensayo de muestras mediante
test BART y determinación de carga biológica mediante microscopía epifluorescente de
muestras de agua antes y después del lavado.

Dentro los principales resultados obtenidos se encuentra la dominancia de bacterias

relacionadas al hierro en el test BART - IRT, la presencia de diferentes bacterias anaeróbicas
debido al test BART -SRB y se mostró positivo frente a bacterias pseudomonas y entéricas en
el test BART-SLYM. Por otro lado, el crecimiento microbiano mediante el EPOCH mostró que
los microorganismos en medios de cultivo definido tuvieron un crecimiento microbiano más
rápido que los que se cultivaron en medio complejo. Por último, el conteo de
microorganismos mediante la microscopía epifluorescente mostró un aumento en la
muestra posterior al lavado.

1
Índice

Introducción 3

Metodología 3
Preparación de métodos de cultivo 3
Esterilización del material 4
Inoculación y cultivo en medio definido y complejo 4
Inoculación de test de reactividad biológica asociada a corrosión 4
Microscopía epifluorescente 5
Resultados y Discusión 5
Seguimiento de Test BART 5
Crecimiento microbiano 6
Conclusiones 9

Referencias bibliográficas 13

Droycon Bioconcepts (2004). Biological Activity Reaction Test, BARTTM User Manual. 13

Anexos 14

Anexo 1: Soluciones de medios de cultivo 14

Medio de cultivo heterótrofo definido 14

Anexo 2: Registro fotográfico de los test BART a distintos días tras inoculación 15

2
 1. Introducción

Los procesos de corrosión pueden afectar el funcionamiento de sistemas ingenieriles, por lo

que la caracterización de los microorganismos presentes en estos es indispensable para
prevenir y mitigar los daños producidos. Es por esto que, como objetivo del laboratorio del
curso de Microbiología Aplicada a la Ingeniería Ambiental, se busca aprender y aplicar
técnicas utilizadas actualmente para identificar características del agua y el medio. En
particular, los objetivos de este laboratorio son: (i) identificar y analizar mediante técnicas
de cultivo los metabolismos microbianos presentes en una muestra de agua proveniente de
un acueducto afectado por corrosión y (ii) determinar la carga microbiana de muestras de
agua utilizando microscopía epifluorescente.

Para llevar a cabo la experiencia práctica, se utilizaron técnicas de cultivos microbianos para
detectar la presencia de microorganismos con metabolismos específicos. Estos cultivos
potencian el crecimiento de algunos organismos y restringen el crecimiento de otros. En
cuanto a la herramienta de microscopía epifluorescente, ésta permite caracterizar
morfológica y cuantitativamente la carga microbiana.

2. Metodología

El trabajo de laboratorio se dividió en dos grandes partes, cada una realizada en un módulo
de clases. Dentro de las actividades que se llevaron a cabo, se encuentran las detalladas a
continuación:

2.1. Preparación de métodos de cultivo

Los dos medios de cultivos preparados se referían a medios heterotróficos. Sin embargo, el
primero era definido, mientras que el segundo correspondía a un medio de cultivo
complejo.

1. Medio de cultivo heterotrófico definido​: Se realizó el medio de acuerdo al protocolo

modificado de ​428 Heterotrophic medium H3P​, el cual es un medio para el

3
 crecimiento de un amplio rango de bacterias. Era necesario también ajustar el pH a
7.0, además de esterilizar por medio de un filtro de tamaño de poro igual a 22
micrómetros.

2. Medio de cultivo heterotrófico complejo​: Este sería el Caldo Luria, compuesto de

3,875 g de Difco​TM Luria Broth y 250 mL de agua destilada, según instrucciones del
fabricante. El medio es autoclavado a 121°C por 15 minutos.

Las soluciones utilizadas para cada medio de cultivo se presentan en el ​Anexo 1.

2.2. Esterilización del material

La esterilización de material es fundamental para evitar contaminación del medio de cultivo.

Se debe realizar el procedimiento para cada material a utilizar en la inoculación y cultivo.
Específicamente, se esterilizó una caja con puntas de micropipeta de 1 mL y una caja con
puntas de 100 micrómetros. Los medios de cultivo se mantienen esterilizados bajo una
campanilla.

2.3. Inoculación y cultivo en medio definido y complejo

Para preparar los cultivos, se utilizó una placa de 24 pocillos ​Epoch 2. S​ e empleó la misma
placa para ambos grupos que asistieron a la actividad de laboratorio el mismo día, por lo
que cada uno utilizó en total 12 receptáculos de los 24. Se inocularon tres triplicados de los
medios definidos y complejos con una muestra de 200 microlitros en un medio de 1,8 mL. El
cultivo se realizó una temperatura de 30°C, considerando una agitación orbital, a una
densidad óptica igual a 600 nanómetros.

2.4. Inoculación de test de reactividad biológica asociada a corrosión

Para verificar la existencia de microorganismos en las muestras se utilizó un ​Test BART.​ Este
detecta la existencia de actividad microbiana en una muestra. El ​Test BART realiza este
proceso a través de distintas reacciones químicas. Es importante realizar este ​test,​ puesto
que los microorganismos podrían llegar a causar corrosión o ​biofouling​. Se utilizaron tres

4
test: bacterias relacionadas al hierro (IRB-BART), bacterias reductoras de sulfato (SRB-BART)
y bacterias formadoras de biofilms (slimes) (SLYM-BART).

2.5. Microscopía epifluorescente

A través de la microscopía epifluorescente se determinó la carga biológica existente en el

agua proveniente del acueducto. Se analizó una muestra antes del lavado y otra después del
lavado. La preparación de la muestra se realizó mediante la tinción de la muestra con 4
microlitros de naranja de acridina en 200 microlitros de muestra, se dejó reposar por 15
minutos para posteriormente añadir 10 microlitros de la mezcla en la cámara de Neubauer
utilizando las micropipetas.

3. Resultados y Discusión

3.1. Seguimiento de Test BART

Según indicaciones del manual de test BART, se debe realizar un seguimiento diario del
avance de las reacciones para cada prueba durante al menos 8 días. Por manual de
laboratorio y por experiencia del encargado, se nos informó que el seguimiento se debía
realizar solo hasta que los resultados fueran positivos. Para el caso de nuestra prueba, al
quinto día desde la preparación (22 de abril), se obtuvieron resultados positivos para los 3
test.

El test IRB-BART mostró un color marrón oscuro al tercer día de reacción. De esta manera, el
test resultó positivo frente a presencia de bacterias dominantes relacionadas al hierro. Las
bacterias que pueden ser detectadas en este test incluyen bacterias reductoras y oxidantes
de hierro, bacterias de hierro “envainadas”, ​Gallionell​a y bacterias entéricas. Los
microorganismos generalmente compiten por hierro debido a que este metal tiene un rol
importante en su metabolismo. Muchas bacterias tienen la capacidad de unir iones Fe(+3) a
ligandos dando lugar a reacciones de complexación, y formando estructuras ricas en hierro.

El test SRB-BART mostró un anillo negro en torno a la bola y en la base del test, se mostró de
color “black slime”. Esto quiere decir que, el test mostró una combinación de bacterias

5
anaeróbicas presentes en el agua. Las bacterias reductoras de sulfato podrían ser
Desulfovibrio y/o ​Desulfotomaculum​. Estas bacterias generan ácido sulfídrico (H2S), lo cual
puede ocasionar diversos problemas. Este compuesto está relacionado con el mal olor que
puede presentar una muestra, además de efectos corrosivos. Por otra parte, utilizan
hidrógeno y no oxígeno como el principal motor de actividades metabólicas.

Finalmente el SLYM-BART presentó un color grisáceo en toda la muestra. Por tanto, el test
se mostró positivo frente a bacterias pseudomonas y entéricas. Estas bacterias son capaces
de producir capas de biofilm sin la necesidad de acumular hierro. Es por esta razón que los
colores que determinan si una muestra es positiva para estas bacterias, no son tonos
anaranjados, rojos o marrones. Las bacterias formadoras de biofilms tienden a ser
aeróbicas, y formar capas de biofilm en frentes de reacciones REDOX. El seguimiento
fotográfico de los tres test se encuentra en el ​Anexo 2.

La aplicación del test BART, resulta ventajoso cuando no se tienen los medios para realizar
experimentos de laboratorio. Es un test bastante sencillo, en el que solo se necesita realizar
un seguimiento de las muestras. Resultan fáciles de leer, ya que las señales generadas por
las reacciones dentro de los tubos son observables. Además, este test provee una gran
variedad de ambientes en los cuales los microorganismos pueden crecer. Si bien este test
tiene grandes ventajas, resulta difícil identificar el tipo de bacteria que está presente en la
muestra, sobre todo las bacterias relacionadas con hierro, ya que estas se subdividen en
diversos grupos.

3.2. Crecimiento microbiano

A partir del equipo ​Epoch 2​, se crearon curvas representativas de crecimiento para los
distintos medios de cultivo En la Figura 1, mostrada a continuación, se puede observar
claramente estas curvas de crecimiento. Nótese que se realizaron 3 cultivos en medio
definido y 3 cultivos en medio complejo. Para las curvas del medio complejo,
correspondientes a C1, C2 y C3, se puede observar un período latente menor a 200 minutos,
seguido de un crecimiento exponencial hasta los 1500 minutos aproximadamente, para

6
finalmente entrar en una etapa estacionaria. Para las curvas del medio definido,
correspondientes a D1, D2 y D3, se observa una etapa lag mayor, con un tiempo superior a
1600 minutos; luego comienza el crecimiento exponencial y se extiende aproximadamente
hasta los 2500 minutos, para finalmente entrar en la etapa estacionaria. Comparando las
densidades, se puede decir que la densidad alcanzada por el medio complejo es levemente
mayor gráficamente que las observadas para los medios definidos.

Figura 1:​ Curvas de crecimiento para los distintos cultivos.

Fuente: Elaboración propia.

3.3. Resultados microscopía epifluorescente

Se analizaron las muestras del acueducto dañado antes y después del lavado. Se calcula la
concentración celular utilizando el protocolo disponible en la nota técnica “Fórmula de la
cámara de Neubauer”. La grilla utilizada, y las imágenes de microscopía obtenidas se
encuentran en la sección de anexos.

Para el cálculo se utiliza el cuadrado 3 de la grilla, el cual tiene un área y volumen de:

Área = 0, 2 mm * 0, 2 mm = 0, 04 mm2

7
 V olumen = 0, 04 mm2 * 0, 1 mm = 4 * 10−3 mm3 = 4 * 10−6 ml

Luego, la concentración celular viene dada por:

C [n°células/ml] = T otal células contadas/N úmero de cuadrados * 250000 [1/ml]

Muestra anterior a lavado

Se contaron las células presentes en tres cuadros distintos (ver anexos Figura 6.2, 6.3 y 6.4).
Se utilizaron las imágenes obtenidas de campo claro, debido a que la epifluorescencia no
entregaba resultados nítidos en este caso.

C [n°células/ml] = (3 + 3 + 2)/3 * 250000 [1/ml]

C = 666.667 células/ml

Muestra después de lavado

En las imágenes de campo claro (ver anexos figuras 6.8, 6.9 y 6.10) se pueden observar
moléculas de color naranjo-rojizo, las cuales corresponden a óxidos de hierro. Estas
moléculas se forman debido a que bacterias relacionadas al hierro pueden formar
estructuras complejas uniendo átomos de Fe(+3) presentes en la muestra a ligandos, dando
lugar a incrustaciones, tubérculos y depósitos de minerales de hierro. Estas moléculas no
fueron consideradas en el conteo celular.

C [n°células/ml] = (14 + 25 + 31 )/3 * 250000 [1/ml]

C = 5.833.333 células/ml

Para la muestra obtenida después del lavado, se ocupó con un factor de dilución de 2 (100
ml de volumen total / 50 ml de volumen de la muestra). Por esta razón, la concentración
debe ser multiplicada por este factor.
C = 11.666.667 células/ml

8
En comparación con la muestra antes del lavado, se tiene un aumento de :
(11.666.667 − 666.667)/666.667 = 1650%

4. Conclusiones

Existe un cambio rotundo en la composición del agua antes y después del lavado realizado a
las cañerías corroídas. Al comparar los resultados de la concentración de microorganismos
presentes en el agua antes y después encontramos que la segunda presenta un significativo
aumento de distintos tipos de bacterias. El lavado de la cañería explica el aumento de la
concentración de microorganismos por dos grandes razones. Primero, el diluirla disminuye
la turbidez y permite ver en mejor detalle los microorganismos que no se logran ver a través
del agua. Segundo, y más importante aún: el lavado desprendió bacterias que se
encontraban adheridas a la superficie interna de la tubería en forma de biofilms, así como
óxidos de hierro que se observan en abundancia.

Dado el cambio de concentraciones en el agua tras el lavado, y además considerando las

reacciones positivas que mostraron los test BART frente a bacterias anaeróbicas y asociadas
a hierro, se puede aseverar correctamente que la corrosión presente en las cañerías de la
industria es atribuible a bacterias que han ocasionado este problema.

Respuestas a preguntas de “Problema a resolver”

1. ¿Cuál es la composición de cada uno de los test BART? Considerando la composición,

identificar cual es (son) el (los) donador (es) y aceptor(es) de electrones en cada uno de los
ensayos. Fundamentar la respuesta​.

El test IRB-BART permite detectar bacterias reductoras y bacterias oxidantes de hierro.

Puede oxidarse ión ferroso a ión férrico o puede reducirse ión férrico a ferroso. En el medio
de cultivo, la principal forma de hierro se presenta como citrato de amonio férrico. El

9
donador de electrones puede ser el ión ferroso con el oxígeno funcionando como aceptor
de electrones en presencia de bacterias oxidantes. En el caso de bacterias reductoras el
donante de electrones sería un compuesto orgánico como el citrato con el ion férrico como
aceptor.

El test SRB-BART está compuesto por sulfato y ácidos grasos de cadena corta. Los ácidos
grasos son donantes de electrones con aceptores el sulfato y ácido sulfhídrico. En el mismo
test, el sulfato es reducido a ácido sulfhídrico, liberándose una molécula de ATP. El
producto, al ser reducido, reacciona con hierro ferroso, lo que típicamente forma sulfuros
de hierro en forma de precipitados negros y/o alrededor de la pelota, formando aureolas
irregulares negras (Manual BART, 2004).

Por último, SLYM-BART identifica la existencia de bacterias capaces de producir capas de

biofilm sin tener que acumular hierro. Las bacterias lo forman bajo condiciones aeróbicas
(Manual BART, 2004). En el test realizado, el resultado fue positivo, lo que significa que la
materia orgánica es el dador de electrones, mientras que el oxígeno es el aceptor.

2. De acuerdo a los resultados obtenidos de los ensayos BART, determinar un posible

modelo conceptual de las reacciones que están ocurriendo en el acueducto. Fundamentar
el modelo.

De los resultados obtenidos en los test BART, se tiene la presencia de bacterias IRB
heterotróficas mezcladas de moderada agresividad. Esto significa que reacciones de
reducción y oxidación de Fe se están llevando a cabo. Se pueden formar hidróxidos de
hierro con el producto de estas reacciones.

F e+3 + e− ↔ F e+2
F e+2 + 2(OH)−1 → F e(OH)2
F e+3 + 3(OH)−1 → F e(OH)3

10
Del test SRB-BART se tiene que reacciones de reducción de sulfato a ácido sulfhídrico se
están llevando a cabo mediante bacterias anaeróbicas. Esta reacción libera una molécula de
ATP en el proceso. Además, hay formación de sulfuros de hierro.

Si hay presencia de materia orgánica:

S O4 −2 + M ateria orgánica → S −2 + H 2 O + C O2

Sin presencia de materia orgánica:

S O4 −2 + 4H 2 → S −2 + 4H 2 O
S −2 + 2H + → H 2 S
S −2 + F e+2 → F e S

El test SLYM-BART resultó positivo para la presencia de bacterias formadoras de biofilms,

por lo que en la superficie del acueducto se están llevando a cabo diversas reacciones
REDOX que inducen al asentamiento de moléculas y por ende a la formación de capas o
slimes​ de biofilm.

3. ¿Cuál es la tasa de crecimiento del cultivo en un medio definido y en un medio

complejo? Comparar y discutir considerando la composición de cada uno.

Observando el crecimiento microbiano de la Figura 1 se observa una diferencia notoria

entre los microorganismos en medios definidos versus los medios complejos.

11
 Figura 2. ​Crecimiento microbiano en pocillos con medio complejo y definido

Se aprecia en la Figura 2 que, el crecimiento para un medio complejo se provoca en un

tiempo mucho menor al del medio definido. Comparando el delta de tiempo, se aprecia que
el medio definido comienza a crecer aproximadamente a las 33 horas desde que se inició el
crecimiento del medio complejo, es decir, la etapa de adaptación o lag del medio complejo
es mucho más corta que la del medio definido.

Para ambos medios, la curva de crecimiento se asemeja a una curva logarítmica, cambiado
el punto de partida en el eje x. Se puede dividir la tasa de crecimiento en dos segmentos: El
primero con un crecimiento pronunciado para ambos casos, y el segundo, un estancamiento
en el crecimiento tanto para medio definido como para medio complejo, o período
estacionario. Además, se aprecia que para ambos medios, el máximo valor de densidad
óptica es muy similar, solo teniendo una diferencia en el momento de ocurrencia.

La diferencia entre el tiempo de crecimiento se puede deber a la composición de los medio

de crecimiento. Considerando que, en la preparación de un medio definido se utilizan
soluciones que favorecen el crecimiento de ciertos microorganismos, se dan las condiciones
óptimas para que su proliferación sea más rápida y se produzca antes. Por otro lado, en un
medio complejo, se tienen múltiples compuestos y soluciones que bien pueden favorecer al
crecimiento microbiano, pero están enfocadas a un uso donde no se conoce con claridad la

12
predominancia de ciertas bacterias, por lo que el alimento entregado puede servir para una
amplia gama de microorganismos.

4. Considerando los resultados de microscopía del agua de la cañería antes y después de la

limpieza, ¿Los microorganismos se encuentran formando agregados o en estado
planctónico?, ¿La carga microbiana en la cañería luego de la limpieza es alta o baja en
relación al agua que fluía antes de la limpieza? Explicar las razones que pueden producir
estos resultados.

Luego del análisis por microscopía, podemos notar que los microorganismos que se
observaron en la cañería luego de la limpieza se encuentran presentes en una mayor
cantidad comparado a los microorganismos antes de la limpieza, es decir, la carga
microbiana antes de la limpieza es baja y luego es alta. El hecho de que exista una gran
cantidad de microorganismos después del lavado, puede llevar a la formación de
conglomerados o cadenas de bacterias. Por esta razón los microorganismos se encuentran
formando agregados.

Una de las razones que puede explicar este comportamientos, es que, antes de que la
cañería haya sido limpiada, los microorganismos se encontraban formando estructuras que
se adherían a las paredes de la cañería (biofilms), lo que explica la menor cantidad de
microorganismos observados antes del lavado. Con la limpieza se removieron biofilms
completos o parte de ellos, por lo que microorganismos que antes se encontraban
formando parte de los biofilms, pasaron a formar parte de la muestra de agua, lo que se vió
reflejado en el gran aumento de la cantidad de microorganismos presentes en la medición.

5. Referencias bibliográficas

Droycon Bioconcepts (2004). Biological Activity Reaction Test, BARTTM User Manual.

13
14
6. Anexos
6.1. Anexo 1: Soluciones de medios de cultivo
6.1.1. Medio de cultivo heterótrofo definido

15
 6.1.2. Medios de cultivo heterótrofo complejo

6.2. Anexo 2: Registro fotográfico de los test BART a distintos días tras
inoculación

Fecha 15-04 16-04 17-04 22-04

SRB

IRB

16
SLYM

Anexo 3: Microscopía epifluorescente

Figura 6.1: ​Grilla utilizada para conteo celular

17
Figura 6.2:​ Campo claro, muestra anterior al lavado, cuadro 1

Figura 6.3:​ Campo claro, muestra anterior al lavado, cuadro 2

18
 Figura 6.4:​ Campo claro, muestra anterior al lavado, cuadro 3

Figura 6.5:​ Epifluorescencia, muestra anterior al lavado, cuadro 1

19
Figura 6.6:​ Epifluorescencia, muestra anterior al lavado, cuadro 2

Figura 6.7:​ Epifluorescencia, muestra anterior al lavado, cuadro 3

20
Figura 6.8:​ Campo claro, muestra después de lavado, cuadro 1

Figura 6.9:​ Campo claro, muestra después de lavado, cuadro 2

21
 Figura 6.10:​ Campo claro, muestra después de lavado, cuadro 3

Figura 6.11:​ Epifluorescencia, muestra después de lavado, cuadro 1

22
Figura 6.12:​ Epifluorescencia, muestra después de lavado, cuadro 2

Figura 6.13:​ Epifluorescencia, muestra después de lavado, cuadro 3

23