FUNDACIÓN UNIVERSITARIA SAN MARTÍN

FACULTAD CIENCIAS DE LA SALUD

PROGRAMA DE MEDICINA

Laboratorio de Biología Molecular y Estructural. 2024-I

PRÁCTICA DE LABORATORIO N°8: TÉCNICAS DE TINCIÓN BACTERIANA II:
TINCIÓN DIFERENCIAL

INTRODUCCIÓN
Las tinciones diferenciales son aquellas que se usan para diferenciar de manera más explícita los
microorganismos. Las tinciones diferenciales más importantes que se emplean en bacteriología son
las de Gram y la tinción ácido-resistente. Ambas tinciones se utilizan para obtener información acerca
de la composición de las capas de la pared celular de las células bacterianas.
Tinción de Gram: El bacteriólogo Danés Christian Gram, descubrió en 1884 un método de
coloración el cual ha dividido a las bacterias en dos grupos, el de las gram positivas y el de las gram
negativas. La técnica está basada en Ia capa gruesa de peptidoglicano que poseen las bacterias gran
positivas que es capaz de retener el complejo colorante- mordiente (cristal violeta- durante Ia
decoloración con el alcohol acetona, que provoca una deshidratación de esta gruesa pared y se reduce
la porosidad, atrapando entonces el complejo en el interior de la célula. Las bacterias Gram negativas,
poseen una delgada capa de peptidoglicano pero rica en lípidos como el lipopolisacarido o LPS que
son disueltos y se permite la salida del complejo colorante-mordiente (cristal violeta-yodo), perdiendo
el color purpura propio del cristal violeta y deben ser coloreadas nuevamente con el colorante
secundario o de contraste como la safranina, que es un colorante de contraste de color rojo, dicho
colorante da un color rojo claro a las células decoloradas. Este método de coloración diferencial
constituye una de las técnicas más importantes en el trabajo bacteriológico, pues Ia información que
da, ayuda a Ia identificación bacteriana.
Tinción de Ziehl-Neels: Esta coloración fue desarrollada inicialmente por Paul Ehrlich para
demostrar la presencia de los bacilos causantes de tuberculosois en muestras clínicas de pacientes. La
técnica es capaz de diferenciar dos grandes grupos de bacterias: bacilos ácido alcohol resistentes
(BAAR) positivas y BAAR negativas.
Las paredes celulares de ciertos microorganismos contienen ácidos grasos (ácidos micólicos) de
cadena larga (50 a 90 átomos de carbono) que les confieren la propiedad de resistir la decoloracíón
con alcohol ácido, después de la tinción con colorantes básicos. Por esto se denominan ácido-alcohol
resistentes. Las micobacterias como M. tuberculosis y M. marinum y los parásitos coccídeas como
Cryptosporidium parvun se caracterizan por sus propiedades de ácido-alcohol resistencia.
La coloración clásica de Ziehl-Neelsen requiere calentamiento para que el colorante atraviese la pared
bacteriana que contiene lípidos como el colesterol y ceras. Al suspender el calentamiento y enfriar
con agua, provoca una nueva solidificación de los ácidos grasos de modo que el colorante ya no puede
salir de las bacterias.
Por otro lado, el calentamiento aumenta la energía cinética de las moléculas del colorante lo cual
también facilita su entrada a las bacterias. Las bacterias que resisten la decoloración son de color rojo
y la que no se ven de color azul.

OBJETIVOS
1. Adquirir destreza en Ia técnica de coloración de Gram.
2. Diferenciar con base en Ia aplicación de esta técnica las bacterias gram positivas de las gram
negativas.
3. Conocer los diferentes campos de aplicación de esta técnica.

MATERIALES
✓ Portaobjetos
✓ Papel absorbente (PROVEER LOS ESTUDIANTES)
✓ Puente de coloración
✓ Mechero de alcohol
✓ Aceite de inmersión
✓ Reactivos requeridos para la coloración de Gram: Cristal violeta, Safranina, Lugol y alcohol
acetona.
✓ Asas bacteriológicas
✓ Microscopio
✓ Alcohol

PROCEDIMIENTO
1. Prepare, seque y fije la muestra que se realizó en laboratorio anterior.
2. Cubra el extendido con cristal violeta. Déjelo actuar durante un minuto. Lave el exceso de colorante
con agua.

3. Cubra el extendido con solución yodada de Gram (Lugol) durante un minuto. Este actúa como un
mordiente. Lave con agua.
4. Decolore con alcohol acetona durante 20 a 30 segundos aproximadamente y lave con agua.
5. Cubra el extendido con safranina. Déjela actuar durante un minuto.
6. Lave con agua, seque y observe al microscopio con el objetivo de inmersión.
7. Dibuje un campo representativo de cada microorganismo.
8. Describa la forma y arreglo de cada microorganismo.
PREGUNTAS
1. Dibuje y explique las diferencias entre la pared celular de bacterias Gram positivas y la de
bacterias Gram negativas
2. ¿Cuál es la ventaja de la técnica de tinción diferencial frente a la de tinción simple?
3. Diga cuál es la función de Cada uno de los siguientes reactivos en una tinción diferencial:
tinte primario, contratinte, agente decolorante, mordiente.
4. ¿Cuál cree usted que es el paso más crucial en la coloración de Gram? explique.

BIBLIOGRAFÍA

• CURTIS – BARNES- SCHNEK. BIOLOGÍA. 7ª Edición. Editorial Médica Panamericana

2008
• PURVES. Vida. La ciencia de la Biología. 8ª Edición. Editorial Médica Panamericana. 2009
• LODISH – BERK – MATSUDAIRA. Biología Celular y Molecular. 5ª Edición. Editorial
Médica Panamericana. 2005
• Jiménez, Luis F., Merchant, Horacio, BIOLOGIA CELULAR Y MOLECULAR, Prentice-
Hall, 2003
• Karp, Gerald, BIOLOGIA CELULAR Y MOLECULAR. Segunda edición, Mac Graw-Hill
Panamericana. 2008.
• Tortora G, Funke B, Case C. Introducción a la microbiología. Novena Edición. Mac Graw-
Hill Panamericana. 2016