|CLASES Y MTODOS DE COLORACION

PRACTICA N2

JORGE DAVID MENDIVIL GARAY

JORGE ENRIQUE PAYARES PEREZ
MARIA ALEJANDRA SALGADO LOZANO
KAREN MARGARITA SEA RAMBAUTH

CARLOS GARCIA MOGOLLON

INGENIERO DE ALIMENTOS

UNIVERSIDAD DE SUCRE
FACULTAD DE INGENIERIA
PROGRAMA DE INGENIERIA AGROINDUSTRIAL
LABORATORIO DE MICROBIOLOGIA INDUSTRIAL
SINCELEJO-SUCRE
2015.
1

Laboratorio De Microbiologa Industrial, Universidad de Sucre.

RESUMEN
Esta prctica consiste en aplicar las clases y mtodos de coloracin para la
identificacin y caracterizacin de bacterias en el laboratorio de Microbiologa. La
observacin puede realizarse por diferentes procedimientos como son la
observacin directa de microorganismos in vivo o el tratamiento mediante
tinciones. Estos procesos van dirigidos a incrementar el contraste y por
consiguiente a optimizar el resultado. S realiz tincin Simple para identificar
morfolgicamente las bacterias y Diferencial para observar los dos tipos de
divisin en Gram positivas y Gram negativas; ms adelante se describen los
mtodos y las tcnicas ms mencionados para la observacin de las muestras as
como procedimientos de observacin en el microscopio.

Palabras Claves: Tincin, Grampositivas, Gram negativas, Diferencial, Simple.

ABSTRACT
This practice is to apply the lessons and staining methods for the identification and
characterization of bacteria in the microbiology laboratory. The observation can be
performed by different methods as are the direct observation of microorganisms "in
vivo" or treatment by staining. These processes are intended to increase the
contrast and thus to optimize the result. Be Simple staining performed to
morphologically identify bacteria and Differential to observe the two types of
division in Gram positive and Gram negative; later more methods and techniques
mentioned observation of samples and procedures for microscopic observation
described.

Keywords: staining, Gram-positive, Gram negative, Differential, Simple.

Laboratorio De Microbiologa Industrial, Universidad de Sucre.

1. OBJETIVOS
GENERAL
Aplicar los mtodos de coloracin para el reconocimiento de bacterias.

ESPECIFICOS

Identificar las diferentes morfologas bacterianas mediante la observacin

microscpica como primer parmetro de identificacin microbiolgica

Realizar coloraciones simples y diferenciales mediante las tcnicas

convencionales de tinciones bacterianas para una caracterizacin celular
adecuada.

Adquirir destreza en la diferenciacin de bacterias Gram positivas y Gram

negativas mediante la tincin de Gram.

2. INTRODUCCIN
Las bacterias se observan mediante microscopio ya que son microorganismos. Su
observacin morfolgica sin teir es confusa debido a que sus clulas y
estructuras no pueden diferenciarse. As al realizar un reconocimiento morfolgico
no podramos solo observaramos su movimiento.
El estudio microscpico de las bacterias se facilitara notablemente al tratarlas con
colorantes o tintes. Con ms facilidad de apreciar la forma y tamao relativo de los
microorganismos teidos. El colorante tambin permite la observacin de
estructuras celulares. Pero antes de la tincin debido a que estos se encuentran
en medios acuosos y para una mejor fijacin se realiza un frotis.
Para teir los microorganismos se dispone de un gran nmero de compuestos
orgnicos coloreados (colorantes). En general son un tanto complejos en su
estructura molecular. Una clasificacin prctica de estos compuestos es de
acuerdo a su comportamiento qumico, es decir, cida, bsica y neutra. Las
coloraciones pueden ser simples y diferenciales, debido a que la morfologa de
las bacterias es amplia y dependiendo que queramos reconocer, diferenciar
utilizarnos un tipo de tincin especifica.
3

Laboratorio De Microbiologa Industrial, Universidad de Sucre.

3. PROCEDIMIENTO
Diagrama de flujo.

CLASES Y METODOS DE COLORACION

Elaboracin de un
frotis

En un portaobjetos limpio se coloc

una gota de solucin salina, se
tom una porcin de colonia
bacteriana de un cultivo y se diluyo,
luego se dejo secar al aire y se fijo

Coloracin

Se cubri el frotis
con el colorante
(azul de metileno)
durante 3 minutos.
Se elimin el exceso
de colorante
Se dejo secar al aire

Se llev al Microscopio
y se observaron los
resultados.

Coloracin

Se cubri el frotis con el colorante

cristal violeta, durante 2 minutos.
Posteriormente se lav con agua
suavemente.
Se cubri la lmina con solucin de
lugol, durante 1-2 minutos, luego se
enjuag suavemente.
Se decolor con solucin alcoholcetona, durante 15 segundos y se
enjuag suavemente.
Se cubri la lmina con el colorante
de contraste safranina o fushina,
durante 30 segundos. Despus se
enjuag suavemente.
Se dejo secar al aire.
Muestra

de

de

Laboratorio De Microbiologa Industrial, Universidad de Sucre.

4. RESULTADOS
4.1 TINCION SIMPLE: se observaron bacterias Redondas y ovaladas.
Figura 1.1

Figura 1.2

Fuente: estudiantes de ingeniera agroindustrial 4to semestre.

4.2 TINCION DIFERENCIAL:
Gramnegativas y Grampositivas.
Figura 2.1

En

esta

tincin

se

observaron

Bacterias

Figura 2.2

Fuente: estudiantes de ingeniera agroindustrial 4to semestre.

4.3 BACTERIAS DEL KUMIS: se observaron Bacterias en formas de Bacilos.
Figura 1.1

Figura 1.2

Fuente: estudiantes de ingeniera agroindustrial 4to semestre.

5

Laboratorio De Microbiologa Industrial, Universidad de Sucre.

5. ANALISIS DE RESULTADOS
5.1 TINCION SIMPLE.

5.2 TINCION DIFERENCIAL.

Las clulas fijadas al calor sobre un portaobjetos se tien, primero con una
solucin de Cristal Violeta (otros colorantes bsicos no son tan efectivos) y son
lavadas despus para quitar el exceso de colorante. En este estado, todas las
clulas, tanto las Gram positivas como las Gram negativas, estn teidas de azul.
El portaobjetos se cubre entonces con una solucin de Lugol (yodo-yoduro
potsico). El ingrediente activo es aqu el I2; el KI simplemente hace soluble el I2
en agua. El I2 entra en las clulas y forma un complejo insoluble en agua con el
Cristal Violeta. De nuevo tanto las clulas Gram positivas como las Gram
negativas se encuentran en la misma situacin. Se lleva a cabo despus la
decoloracin, usando una mezcla de Alcohol - Cetona, sustancias en las que es
soluble el complejo I2-cristal violeta. Algunos organismos (Gram positivos) no se
decoloran, mientras que otros (Gram negativos) lo hacen. La diferencia esencial
entre esos dos tipos de clulas est por tanto en su resistencia a la decoloracin;
esta resistencia se debe probablemente al hecho de que en el caso de bacterias
Gram negativas, la mezcla de alcohol/acetona es un solvente lipdico y disuelve la
membrana exterior de la pared de la clula (y tambin puede daar la membrana
citoplasmtica a la que se une peptidoglicano). La delgada capa de peptidoglicano
es incapaz de retener el de complejo cristal violeta-yodo y la clula se decolora.
Las clulas Gram positivas, a causa de sus paredes celulares ms espesas
(tienen ms peptidoglicano y menos lpido), no son permeables al disolvente,
provocando que el de complejo cristal violeta-yodo quede atrapado dentro de la
pared celular. Despus de la decoloracin las clulas Gram positivas son todava
azules, pero las Gram negativas son incoloras. Para poner de manifiesto las
clulas Gramnegativas se utiliza una coloracin de contraste. Habitualmente es un
colorante de color rojo, como la safranina o la fucsina bsica. Despus de la
coloracin de contraste las clulas Gram negativas son rojas, mientras que las
Gram positivas permanecen azules.[2]

6. CONCLUSINES
6

Laboratorio De Microbiologa Industrial, Universidad de Sucre.

Se identific mediante coloracin simple la forma de las bacterias presentes en

la muestra.

Se realizaron coloraciones simples y diferenciales mediante las tcnicas

convencionales de tinciones bacterianas y se logr observar una
caracterizacin celular adecuada.

Se realiz coloracin diferencial para determinar si las bacterias de la muestra

eran Gram positivas o Gram negativas.

7. CUESTIONARIO
a. Describa sintticamente el fundamento cientfico de la tincin de Gram.
Es la tincin diferencial ms utilizada de forma rutinaria y prcticamente la primera
prueba a la que se someten las muestras de cualquier origen antes de su estudio.
Proporciona una informacin esencial, adems de sobre la forma, tamao y
agrupacin celular, como es el tipo y composicin de la pared que presentan las
bacterias. La tincin de Gram divide a las bacterias con pared del Dominio
Bacteria en dos grandes grupos: bacterias con pared de tipo Gram positiva y
bacterias con pared de tipo Gram negativa. [3]
b. Describa una tcnica de tincin para observar endosporas bacterianas.
Tincin de esporas. Esta tincin permite poner de manifiesto la endospora
bacteriana, una forma de resistencia producida por algunos gneros de bacterias
Gram positivas. Las endosporas aseguran la supervivencia de estas bacterias en
condiciones desfavorables (altas temperaturas, desecacin, radiaciones
ultravioletas, gamma y agentes qumicos), durante largos periodos de tiempo. Se
conocen como endosporas bacterianas porque se originan en el interior de los
microorganismos. [3]
c. Describa una tcnica para observar cpsulas bacterianas.
La mejor tcnica para visualizar cpsulas se basa en realizar una tincin negativa
utilizando tinta china o nigrosina, colorantes que no penetran en la clula sino que
ennegrecen el medio. Las clulas se observan brillantes, sin teir y se aprecia una
zona clara alrededor de las mismas. En ocasiones se utiliza un colorante posterior
para resaltar las clulas. [4]
d. Describa una tcnica para observar flagelos bacterianos.

Laboratorio De Microbiologa Industrial, Universidad de Sucre.

La tincin de flagelos de Leifson es una tincin simple que usa un colorante, la

rosanilina y cido tnico que engrosa los flagelos para que puedan verse. Es
imprescindible fijar las clulas con formol y realizar la tincin muy cuidadosamente
para poder observar los flagelos. [4]
e. Describa una tcnica para observar mohos y levaduras.
Las paredes celulares de los hongos fijan el colorante blanco de calcoflor
aumentando considerablemente su visibilidad en los tejidos y otras muestras.
Segn fue descrito por Hageage y Harrington, este colorante se emplea en lugar
de KOH al 10% para el examen inicial de los materiales clnicos. Tambin se
emplea para aumentar la visualizacin de los elementos morfolgicos de los
cultivos puros de los hongos. En algunos laboratorios ha suplantado al azul de
lactofenol en muchas aplicaciones. Los organismos fluorescen con luz blancoazulada o verde manzana, segn la fuente luminosa que se utilice.
f. Describa la
micobacterias.

tcnica

de

coloracin

cido-alcohol

resistente

para

Tincin de cido-alcohol resistencia Se trata de un procedimiento de tincin

diferencial, conocido como mtodo de Ziehl-Neelsen, que tiene gran relevancia por
su aplicacin clnica. Permite poder distinguir aquellos microorganismos cuya
coloracin resiste la accin de alcoholes y cidos suaves (cido-alcohol resistente)
de otros que no resisten la decoloracin (no cido-alcohol resistente). [3]

Laboratorio De Microbiologa Industrial, Universidad de Sucre.

REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS

[2]http://www.frro.utn.edu.ar/repositorio/catedras/quimica/5_anio/biotecnolog
ia/practico4.pdf
[3]http://revistareduca.es/index.php/biologia/article/viewFile/819/834
[4]http://aulavirtual.usal.es/aulavirtual/demos/microbiologia/unidades/curso/
UNI_02/u2c1s3.htm

Laboratorio De Microbiologa Industrial, Universidad de Sucre.