Manual de Tecnicas - Coloraciones

IPS SEÑOR DE LOS MILAGROS Código: LAB-MTC-008
SBA S.A.S
Proceso Laboratorio Clinico Versión: V-01-00
Fecha: MAYO 2023

Manual De Técnica De Coloración
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MANUAL DE TECNICAS DE COLORACION
IPS SEÑOR DE LOS MILAGROS SBA S.A.S
INTRODUCCIÓN
El tamaño de la mayoría de las células bacterianas es tal que resultan difíciles de ver con el
microscopio óptico. La principal dificultad es la falta de contraste entre la célula y el medio
que la rodea, y el medio más simple de aumentar el contraste entre la célula y el medio que
la rodea es la utilización de colorantes. Estos pueden emplearse también para localizar
estructuras específicas en la célula o para distinguir entre tipos diferentes de células.
Las células generalmente son tratadas para coagular el protoplasma antes de teñirlas,
proceso llamado fijación. Para las bacterias la fijación por el calos es lo más corriente,
aunque también puede fijarse con sustancias químicas como formaldehído, ácidos y
alcoholes. Después de la fijación se realiza habitualmente en células que han sido secadas
sobre un portaobjetos, tratando después éste con el agente fijador y siguiendo
inmediatamente el proceso de tinción. La fijación produce generalmente el encogimiento de
las células, la tinción, por el contrario, hace que las células aparezcan mayores de lo que
son realmente, de manera que las medidas de las células que han sido fijadas o teñidas no
pueden realizarse con mucha precisión.
La mayoría de los colorantes son compuestos orgánicos que tienen alguna afinidad
específica por los materiales celulares. Muchos colorantes utilizados con frecuencia son
moléculas cargadas positivamente (cationes) y se combinan con intensidad con los
constituyentes celulares cargados negativamente, tales como los ácidos nucleicos y los
polisacáridos ácidos. Ejemplos de colorantes catiónicos son el azul de metileno, el cristal
violeta y la safranina. Otros colorantes son moléculas cargadas negativamente (aniones) y
se combinan con los constituyentes celulares cargados positivamente, tales como muchas
proteínas. Esos colorantes incluyen la eosina, la fucsina ácida y el rojo Congo. Otro grupo
de colorantes son sustancias liposolubles. Los colorantes de este grupo se combinan con los
materiales lipídicos de la célula, usándose a menudo para revelar la localización de
depósitos de grasa. Un ejemplo de colorante liposoluble es el negro Sudán. Algunos
colorantes teñirán mejor sólo después de que la célula haya sido tratada con otra sustancia
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química, que no es un colorante por sí mismo. Esta sustancia se denomina mordiente. Un

mordiente habitual es el ácido tánico. El mordiente se
Combina con un constituyente celular y lo altera de modo que ahora sí podrá atacar el
colorante.
Si se desea simplemente incrementar el contraste de las células para la microscopia son

suficientes los procedimientos simples de tinción. El azul de metileno es un buen colorante
simple que actúa sobre todas las células bacterianas rápidamente y que no produce un color
tan intenso que oscurezca los detalles celulares. Es especialmente útil para detectar la
presencia de bacterias en muestras naturales, puesto que la mayor parte del material no
celular no se tiñe.
1. TINCION DE GRAM
PRINCIPIO
La coloración de Gram ha constituido, desde los albores de la Bacteriología, un elemento

fundamental para la taxonomía e identificación.
Luego del descubrimiento casual realizado por el investigador danés Christian Gram,
pasaron muchos años durante los cuales se efectuaron las más variadas especulaciones
sobre el mecanismo de esta coloración.
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Resultaba indudable, sin embargo, su practicidad a los fines de la identificación. El

conocimiento de las estructuras de las membranas bacterianas, tanto en el aspecto físico
como en su composición molecular que fueron logrados a partir de la década del sesenta,
demostraron que la coloración de Gram distingue dos grupos de bacterias totalmente
diferentes. Las bacterias Gram positivas que presentan una gruesa capa de peptidoglicano
como estructura fundamental por sobre la membrana citoplasmática, y las Gram negativas,
que encima de ésta, presentan una delgada capa de peptidoglicano, a la que se superpone
una capa de lipopolisacáridos-lipoproteína, denominada membrana externa. La presencia de
esta membrana diferencia actualmente dos divisiones en sistemática bacteriana: las que no
lo poseen, Firmicutes (Gram +) y las que sí, Gracilicutes (Gram -). La diferencia entre
ambos grupos es pues de enorme importancia taxonómica. El comportamiento como
patógenos y en la sensibilidad antibacteriana difieren sustancialmente; de ahí que la
realización rápida de una coloración de Gram, reviste enorme importancia en Bacteriología
Clínica.
Esta coloración permite la clasificación de las bacterias en GRAM POSITIVAS Y GRAM

NEGATIVAS SEGÚN LA COMPOSICION DE SU PARED CELULAR.
Por esto el complejo de color formado con la pared de las bacterias Gram positivas no
puede ser removido con el agente decolorante que es el alcohol acetona. La célula
permanece de color azul violeta, en cambio las bacterias Gram negativas, al decolorarse
con el alcohol acetona, se dejan colorear con la fuscina ó safranina, quedando de color
rosado.
FUNDAMENTO.
El cristal violeta sirve como colorante básico uniéndose a la pared celular bacteriana, con
ayuda del mordiente que refuerza la unión del colorante. Las bacterias GRAM POSITIVAS
debido a la estructura y composición bioquímica de su pared celular retienen el complejo
cristal violeta-lugol y aún después del tratamiento con el decolorante conserva el colorante
básico, por lo que se observan al microscopio de color azul oscuro o violeta una vez
concluida la técnica de tinción.
Las bacterias GRAM NEGATIVAS pierden el colorante básico cuando son tratadas con el
decolorante debido a que el alcohol disuelve el contenido lipídico de la pared celular lo que
aumenta la permeabilidad celular, dando como resultado la pérdida del complejo cristal
violetalugol. Las bacterias decoloradas captan entonces el colorante de contraste, razón por
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la cual estas células bacterianas se observan al microscopio de color rosado una vez
concluida la técnica de tinción.
La tinción de Gram tiene valor diagnóstico y puede ser aplicada a diversos y múltiples tipos
de especímenes clínicos como líquidos corporales estériles (LCR), exudados, excreciones
(orina), secreciones (esputo), abscesos y tejidos. También puede aplicarse a diferentes tipos
de materiales de uso hospitalario como catéteres y soluciones para el diagnóstico y control
de las enfermedades intrahospitalarias.
REACTIVOS. La tinción de Gram utiliza en orden estricto de primero a cuarto los

siguientes reactivos:
1. CRISTAL VIOLETA o violeta de genciana: COLORANTE BASICO
2. LUGOL DE GRAM: MORDIENTE
3. ALCOHOL - ACETONA: DECOLORANTE
4. FUSCINA (SAFRANINA): COLORANTE DE CONTRASTE
TÉCNICA
1. Marcar y realizar un extendido delgado de la muestra clínica o de una colonia sobre un

portaobjetos (placa) y dejar secar.
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2. Fijar el material a estudio a la placa pasándola 2 o 3 veces por la llama de un mechero

evitando el excesivo calentamiento.
3. Colocar la placa sobre un soporte y cubrirla con cristal violeta durante un minuto.
4. Lavar con agua corriente.
5. Cubrir la placa con lugol de Gram durante un minuto.
7. Cubrir la placa con alcohol-acetona durante 30 segundos.
9. Cubrir la placa con fuscina ( safranina) durante un minuto.
11. Dejar secar al aire
12. Observar al microscopio con aceite de inmersión, objetivo de 100X, condensador

abierto totalmente para que la luz pase y se obtenga buena iluminación.
RESULTADO
Microorganismos Gram Positivos Azul-Violeta
Microorganismos Gram Negativos Rosa-Rojo
CONTROL DE CALIDAD
Los controles puedes realizarse con bacterias Gram Positivas (estafilococos) y bacterias
Gram Negativas (Escherichia Coli). Para ello deben utilizarse cultivos procedentes de
medios de cultivo incubados durante 18-24 horas.
NOTAS SOBRE EL EMPLEO
 La técnica descrita anteriormente puede modificarse de acuerdo con las

preferencias del operador para lograr mayor o menor intensidad de coloración, lo
cual implica variaciones en los tiempos de tinción, decoloración, lavado.
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 Se ha encontrado que el mal uso del ALCOHOL ACETONA Solución decolorante

para GRAM en la fase de decoloración puede llegar a decolorar los gérmenes
GRAM POSITIVOS.
 Cultivos y preparaciones viejas pueden dar resultados atípicos. Es por ello que se
recomienda utilizar cultivos de 18-24 h como máximo o extensiones recientes.
 Asimismo, es importante controlar la fijación por el calor (dos-tres pasos de un
segundo por llama suave); un exceso del mismo puede dar coloraciones erróneas.
 Agua altamente clorada puede debilitar la coloración de contraste.
CONDICIONES DE ALMACENAMIENTO Y ESTABILIDAD
 Las soluciones deben almacenarse entre 15°C y 30°C y protegidos

de la luz. Después de abierto el contenido almacenado entre 15°C y
30°C y protegidos de la luz es estable hasta la fecha de caducidad
Indicada en la etiqueta.
 Temperaturas inferiores a 15°C puede precipitar colorantes de las soluciones
colorantes.
 Los frascos deben mantenerse siempre bien cerrados.
lactobacilos
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Bacterias Gram positivas
Bacterias Gram negativas
Bacterias Gram negativas

intracelulares
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2. TINCIÓN WRIGHT
PRINCIPIO
El típico color de los núcleos celulares, mayoritariamente rojo púrpura, se basa en la

interacción molecular entre eosina y un complejo azur B – ADN. Ambos colorantes forman
el complejo. La intensidad de la coloración depende del contenido de azur B y de la
relación entre azur B y eosina amarilla. El resultado de tinción puede ser influido por
diferentes factores como el valor del pH de la solución y de la solución tampón, las
substancias tampón (amortiguadores), el tiempo de tinción y la fijación.
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MUESTRAS
Se deben usar laminas nuevas y prelavadas con alcohol de 96% para quitar la grasa. Deben
utilizarse frotis frescos de sangre total o frotis frescos procedentes de sangre anti coagulada
con EDTA. Los frotis más gruesos (p.ej., médula ósea) generalmente requieren tiempos de
tinción más largos.
PROCEDIMIENTO
1. Realizar en una placa un extendido de la muestra con el borde de otra placa. Dejar secar.
2. Colocar los frotis de sangre completamente secos, en la gradilla de tinción adecuada.
3. Cubrir el portaobjetos con 1–2 ml de R1 Colorante de Wright Solución.
4. Tras 1 minuto, añadir un volumen igual de BUFFER GIORDANO PH: 7.0 PARA
WRIGHT, soplar para homogenizar hasta permitir que la mezcla adquiera un brillo verde
metálico.
5. Se deja actuar de 3 a 6 minutos.
6. Lavar con agua corriente, dejar secar a temperatura ambiente.
7. Leer al microscopio con objetivo de 40X o 100X y aceite de inmersión.
CONTROL DE CALIDAD
El control de calidad en la microscopia de extendidos sanguíneos depende directamente de

la formación y experiencia del profesional que validará la calidad de los extendidos,
coloración, etc.
 Las soluciones deben almacenarse entre 15°C y 30°C y protegidos de la luz.

Después de abierto el contenido almacenado entre 15°C y 30°C y protegidos de la
luz es estable hasta la fecha de caducidad indicada en la etiqueta.
colorantes.

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3. TINCIÓN DE FIELD
PRINCIPIO
La coloración de FIELD es una coloración acuosa basada en la coloración de Romanovsky

que consiste en dos soluciones (Solución A y Solución B) y una solución tampón
(amortiguadora).
La coloración de FIELD es una coloración rápida para la identificación de Hemoparasitos.

El típico color de los núcleos celulares, mayoritariamente rojo púrpura, se basa en la
interacción molecular entre eosina y un complejo azur A- ADN. La intensidad de la
coloración depende del contenido de azur A y de la relación entre azur A y eosina amarilla.
El resultado de tinción puede ser influido por diferentes factores como el valor del pH de la
solución y de la solución tampón, las substancias tampón (amortiguadores), el tiempo de
tinción y la fijación.
MUESTRAS
Se deben usar láminas nuevas y prelavadas con alcohol de 96% para quitar la grasa.
Se limpia el dedo del paciente con Alcohol, y deja secar. Se realiza la punción, la primera
gota se descarta y con la lámina se recoge una sola gota. (No se debe tocar la piel con la
lámina). Con la ayuda de otra lámina se hace un extendido delgado y corto.
PROCEDIMIENTO
La lamina con el extendido debe estar completamente seca, y se procede de la siguiente

manera:
1. Sumérjase el portaobjeto de 1 a 3 segundos en la SOLUCIÓN A. Escurra sobre un papel.
2. Introduzca suavemente en AGUA AMORTIGUADORA 3 segundos. Escurrir.
3. Sumérjase de 1 a 4 segundos en SOLUCIÓN B. Escurrir.
4. Introduzca en AGUA AMORTIGUADORA 3 segundos. Escurrir.
5. Se seca a temperatura ambiente.
CONTROL DE CALIDAD
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El control de calidad en la microscopia de extendidos sanguíneos depende directamente de

la formación y experiencia del profesional que validara la calidad de los extendidos,
coloración, etc.
El control debe realizarse incluyendo en cada proceso un portaobjetos de control positivo.
 Las soluciones deben almacenarse entre 15°C y 30°C y protegidos de la luz.

Después de abierto el contenido almacenado entre 15°C y 30°C y protegidos de la
luz es estable hasta la fecha de caducidad indicada en la etiqueta.
colorantes.
4. TINCIÓN ÁCIDO ALCOHOL RESISTENCIA ZIEHL-NEELSEN
Esta tinción sirve principalmente para clasificar micobacterias y actinomicetos, que tienen
un alto contenido en lípidos y en ácidos micólicos y que no pueden ser calificadas por la
tinción de Gram. Para empezar se hecha sobre el portaobjetos una mezcla de fucsina –
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fenol, en la que la fucsina hace de colorante rosa y el fenol de mordiente. Las células se
tiñen de rosa, tanto las ácido – alcohol sensibles como las resistentes. Después se usa un
decolorante orgánico que hace que las bacterias ácido – alcohol sensibles se decoloren
mientras que las ácido – alcohol resistentes se quedan rosa. Como en la tinción de Gram se
utiliza un colorante de contraste que en este caso es el azul de metileno que tiñe las células
ácido – alcohol sensibles de color azul quedando las células ácido – alcohol resistentes de
color rosa.
PROCEDIMIENTO
1. Preparación del frotis
2. Extensión de la muestra
3. Fijación
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1. 2. agregar Carbol fucsina
3. Calentar hasta la emisión de

vapor por minutos Mantener el
calor 10 minutos, Evitar la
ebullición, Dejar enfriar
4. 5. Lavar con agua
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6. 7. Decoloración con alcohol ácido

máximo 3 minutos ,lavar con
agua posteriormente
8. 9. Tinción de contraste: azul de

metileno por un minuto
10. 11. Enjuagar
12. 13. Secado
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14. 15. Examen sistemático de la

extensión
16. 17. Coloración con buena calidad
18. 19. Observación microscópicas de

B.A.A.R.
TECNICA DE LECTURA.
Para el examen es necesario microscopio binocular con objetivo de inmersión (1 00 x) y

oculares de aumento moderado.
1. Examinar un mínimo de 100 campos microscópicos. La lectura debe hacerse de

manera sistemática y estandarizada.
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2. Empezar la lectura del frotis en el centro del extremo izquierdo de la lámina.

ajustando levemente con el tomillo micrométrico.
3. Después de haber examinado un campo microscópico. mover la lámina en forma
longitudinal, para examinar el siguiente campo hacia la derecha. De esta manera.
examinar todos los campos microscópicos, desde el principio hasta el fin de la
longitud central del frotis. El número de campos microscópicos que corresponde a
la longitud del frotis es de 100 aproximadamente.
4. Se considera campo microscópico , aquel en el cual se observan elementos
celulares de origen bronquial (leucocitos. fibras mucosas y células). Los campos en
los que no aparezcan dichos elementos, no deben contabilizarse en la lectura.
5. Cuando no se encuentren bacilos ácido-alcohol resistente (BAAR), en 100campos;
se debe hacer una nueva búsqueda más cuidadosa en otros 100 campos. Mover la
lámina unos milímetros hacia atrás y leer una segunda longitud del mismo (de
derecha a izquierda).
6. Los bacilos tuberculosos se observan como bastoncitos delgados y rojos ligeramente
curvos. más o menos granulosos, aislados, pareados o en grupos. estacándose
claramente contra el fondo azul. Calcular el número de bacilos vistos por campo.
7. Al finalizar el examen, separar el objetivo de la lámina. retirarla y verificar la
identificación con el número grabado en la lámina y anotar el resultado en el libro
de registro.
8. Antes de examinar un nuevo frotis. limpiar el lente de inmersión con papel para
limpiar lentes o algodón
9. . Limpiar el aceite de la lámina y guardarla para su envió al control de calidad.
INFORME DE RESULTADOS
NÚMEROS DE B.A.A.R CAMPOS DE REPORTE

ENONTRADOS INMERCION
OBSERVADOS
no se observa B.A.A.R 100 campos
Negativo
De 1-9 B.A.A.R 100 campos
Numero exacto de bacilos
observados en los 100
campos
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+
++
Mas de 10 B.A.A.R 20 campos
+++
26. BIBLIOGRAFIA
Insertos de coloraciones de roldeg
http://analisisaproductoscarnicos.blogspot.com/2012/06/tinciones-utilizadas-en-
microbiologia.html
http://www.medigraphic.com/pdfs/invdis/ir-2014/ir141b.pdf
http://www.ihrdiagnostica.com/tecnicas/pdf/ColoracionWRIGHTv2.pdf
http://www.ihrdiagnostica.com/tecnicas/pdf/ColoracionFIELDv2.pdf
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química, que no es un colorante por sí mismo. Esta sustancia se denomina mordiente. Un

Si se desea simplemente incrementar el contraste de las células para la microscopia son

La coloración de Gram ha constituido, desde los albores de la Bacteriología, un elemento

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Resultaba indudable, sin embargo, su practicidad a los fines de la identificación. El

Esta coloración permite la clasificación de las bacterias en GRAM POSITIVAS Y GRAM

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REACTIVOS. La tinción de Gram utiliza en orden estricto de primero a cuarto los

1. CRISTAL VIOLETA o violeta de genciana: COLORANTE BASICO

2. LUGOL DE GRAM: MORDIENTE

3. ALCOHOL - ACETONA: DECOLORANTE

4. FUSCINA (SAFRANINA): COLORANTE DE CONTRASTE

1. Marcar y realizar un extendido delgado de la muestra clínica o de una colonia sobre un

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2. Fijar el material a estudio a la placa pasándola 2 o 3 veces por la llama de un mechero

4. Lavar con agua corriente.

5. Cubrir la placa con lugol de Gram durante un minuto.

6. Lavar con agua corriente.

7. Cubrir la placa con alcohol-acetona durante 30 segundos.

8. Lavar con agua corriente.

9. Cubrir la placa con fuscina ( safranina) durante un minuto.

10. Lavar con agua corriente.

11. Dejar secar al aire

12. Observar al microscopio con aceite de inmersión, objetivo de 100X, condensador

Microorganismos Gram Positivos Azul-Violeta

Microorganismos Gram Negativos Rosa-Rojo

NOTAS SOBRE EL EMPLEO

 La técnica descrita anteriormente puede modificarse de acuerdo con las

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 Se ha encontrado que el mal uso del ALCOHOL ACETONA Solución decolorante

CONDICIONES DE ALMACENAMIENTO Y ESTABILIDAD

 Las soluciones deben almacenarse entre 15°C y 30°C y protegidos

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Bacterias Gram positivas

Bacterias Gram negativas

Bacterias Gram negativas

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El típico color de los núcleos celulares, mayoritariamente rojo púrpura, se basa en la

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2. Colocar los frotis de sangre completamente secos, en la gradilla de tinción adecuada.

3. Cubrir el portaobjetos con 1–2 ml de R1 Colorante de Wright Solución.

5. Se deja actuar de 3 a 6 minutos.

6. Lavar con agua corriente, dejar secar a temperatura ambiente.

7. Leer al microscopio con objetivo de 40X o 100X y aceite de inmersión.

El control de calidad en la microscopia de extendidos sanguíneos depende directamente de

CONDICIONES DE ALMACENAMIENTO Y ESTABILIDAD

 Las soluciones deben almacenarse entre 15°C y 30°C y protegidos de la luz.

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La coloración de FIELD es una coloración acuosa basada en la coloración de Romanovsky

La coloración de FIELD es una coloración rápida para la identificación de Hemoparasitos.

La lamina con el extendido debe estar completamente seca, y se procede de la siguiente

1. Sumérjase el portaobjeto de 1 a 3 segundos en la SOLUCIÓN A. Escurra sobre un papel.

2. Introduzca suavemente en AGUA AMORTIGUADORA 3 segundos. Escurrir.

3. Sumérjase de 1 a 4 segundos en SOLUCIÓN B. Escurrir.

4. Introduzca en AGUA AMORTIGUADORA 3 segundos. Escurrir.

5. Se seca a temperatura ambiente.

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El control de calidad en la microscopia de extendidos sanguíneos depende directamente de