- Las bacterias son demasiado pequeñas para ser observadas a simple vista, por lo que es necesario

emplear un microscopio.

- Las técnicas in vivo (preparación en fresco) permiten observar la movilidad, color, tamaño, forma y
agrupación de los microorganismos en condiciones naturales, sin alteraciones.

- La tinción simple solo nos sirve para hacer más fácilmente visible a las bacterias sin resaltar ninguna
característica en especial, pues la muestra se tiñe de manera homogénea. Se lleva a cabo cubriendo con
un único colorante básico (como la safranina o el azul de metileno) un frotis seco y fijado al calor.

- La tinción compuesta o diferencial requiere el uso de al menos 3 reactivos químicos que se aplican en
secuencia a un frotis fijado por calor.

- El primer reactivo es llamado tinción primaria o colorante primario. Su función es impartir color a todas
las células. Con el objetivo de establecer un contraste de color.

- El segundo reactivo usado es un agente decolorante, el cual puede decolorar la célula completa o solo
parte de ella.

- El reactivo final, el colorante de contraste, le da a las células decoloradas un color que contrasta con el del
colorante primario. De esta manera, tipos de células o sus estructuras (flagelo, cápsula, endoespora...) se
pueden distinguir unas de otras en función del colorante que es absorbido.

- El método de tinción diferencial más importante usado en bacteriología es la tinción de sinant-papada as

en honor al Dr: Hans Christian Gram. Este método divide las bacterias en dos grandes grupos, las Gram
negativas y las Gram- positivas. Esto es esencial para la clasificación y diferenciación de microorganismos,
La reacción a la tinción de Gram está basada en la diferencia en la composición química de la pared celular
bacteriana.

- Mordiente: Yodo o lugol. El yodo, aparte de matar bacterias, incrementa la afinidad del colorante primario
con la célula, formando complejos insolubles con este. El complejo cristal violeta-yodo sirve para intensificar
y fijar el color del teñido.

- Morfología bacteriana y de levaduras: En este experimento, usted se familiarizará con el uso del
microscopio (particularmente con la microscopia con aceite de inmersión) y comparará el tamaño relativo y
la forma de varios microorganismos, sobre todo bacterias y levaduras, comparando el tamaño de manera
cualitativa con un cabello humano, que es algo visible a simple vista.

- Las bacterias son microorganismos unicelulares procariotas que se dividen por fisión binaria, un
proceso en el cual una bacteria se divide en dos células de igual tamaño. Las 3 formas más comunes de
bacterias son: cocos, bacilos, y formas helicoidales. Se define la morfología individual de la bacteria y la
asociación entre ellas. (Morfología y arreglo)

- Cocos: Una bacteria en forma de coco es usualmente esférica aunque algunas aparecen ovaladas,
elongadas O aplanadas en un lado. La mayoría de los cocos tienen aproximadamente 0.5 - 1.0 micrómetros
(um).
- Bacilos: Un bacilo es una bacteria en forma de bastoncillo que puede formar uno de los siguientes
arreglos: a. Bacilo: un bacilo sencillo. (Morfología) b. Estreptobacilo: bacilos en cadenas. (Arreglo) c.
Cocobacilos: ovalados y similares a cocos. (Morfología) Un bacilo mide normalmente 0.5-1.0 um de ancho y
de 1- 4 um de largo. Bacilos pequeños o que se acaban de dividir pueden ser confundidos con cocos, por lo
que deben ser observados cuidadosamente. No hay que confundir estreptobacilos con bacilos en proceso
de división.

- El cultivo de microorganismos consiste en proporcionarles las condiciones físicas, químicas y nutritivas

adecuadas para que puedan multiplicarse de forma controlada. En general, podemos distinguir cultivos
líquidos y sólidos en función de las características del medio; y cultivos discontinuos (monofásicos) y
continuos en función de la disponibilidad de nutrientes en el medio.

- Un cultivo conteniendo una sola especie de células se llama cultivo puro. Para aislar y estudiar
microorganismos en cultivos puros, se requieren una serie de instrumentos básicos de laboratorio y la
aplicación de técnicas específicas.

- Medios: La supervivencia y crecimiento continuo de microorganismos depende de un suministro adecuado

de nutrientes y un ambiente favorable al crecimiento. Como nutrientes, la mayoría de los microorganismos
necesita de sustancias solubles de bajo peso molecular que se derivan frecuentemente de la degradación
enzimática de nutrientes complejos. Una solución conteniendo estos nutrientes es un medio de cultivo.
Básicamente, los medios de cultivo son líquidos, sólidos o semisólidos. Un medio líquido carece de un
agente solidificante y se denomina caldo de cultivo. Si a un caldo se le adiciona un agente solidificante
como agar, se forma un medio semisólido o sólido. El agar se licúa a 100 °C y solidifica a 40 °C. El medio
sólido tiene la ventaja que sobre su superficie endurecida crecen microorganismos que pueden ser aislados
en colonias discretas usando técnicas especializadas. Cada colonia es un aglomerado de células que se
originan por la multiplicación de una única célula viable y representa el crecimiento de una única specie de
microorganismo (cultivo puro).

- Los medios sólidos se pueden tener en placas especiales, tipo plato, llamadas placas de Petri, así como
en tubos de cultivo, en posición inclinada (agar slant), para siembra de microorganismos en la superficie.
Los tubos inclinados son muy buenos para almacenar cultivos puros. Tubos similares, pero en los que el
medio se solidifica en posición recta, se utilizan para siembra de microorganismos a lo interno del medio
(agar deep tube), para estudiar los requerimientos de oxígeno de los microorganismos. Las placas de Petri
ofrecen una gran superficie de cultivo, lo cual permite un mejor aislamiento y estudio de microorganismos
respectivamente sus colonias.

- Los microorganismos deben ser cultivados a su temperatura óptima de crecimiento.

- Los microorganismos son transferidos de un medio a otro por el proceso de inoculación para formar un
subcultivo. (to have a stock to be able to run many other tests)

- Las placas de Petri se incuban en posición invertida, para evitar que la condensación que se forma en la
tapa gotee en la superficie del agar solidificado.

- Para satisfacer las necesidades nutricionales de bacterias, los bacteriólogos utilizan dos categorías de
medios para el cultivo rutinario.

- Diferenciamos medios líquidos, denominados caldos, y medios semisólidos y sólidos que consisten en un
caldo o medio líquido al que se le ha añadido un agente espesante, principalmente agar, que no contiene
 nutrientes. El agar se extrae de un alga marina, se disuelve a temperaturas elevadas, y se vuelve
gelatinoso al disminuir la temperatura de nuevo.

- Medios Definidos: Están compuestos de cantidades conocidas de sustancias químicamente puras,

inorgánicas y/u orgánicas. Se requiere conocimiento de las necesidades nutricionales de un organismo
específico.

- Medios Complejos: La composición química exacta de estos medios no es conocida. Se preparan con
extractos de tejidos animales y vegetales y son variables en su composición.

- Medios Selectivos: Estos medios se utilizan para seleccionar (aislar) grupos específicos de bacterias.
Contienen sustancias químicas que inhiben el crecimiento de algunos tipos de bacterias, permitiendo el
crecimiento de otras, facilitando así el aislamiento bacteriano.

- Agar Feniletanol (PEA Agar, Phenylethyl alcohol agar): Este medio es usado para aislar organismos
gram-positivos. El alcohol feniletílico es parcialmente inhibitorio de organismos gram-negativos, que pueden
formar colonias visibles cuyo tamaño y número son mucho menores que en otros medios.

- Agar Cristal Violeta: Este medio es selectivo para organismos gram-negativos. El cristal violeta inhibe la
mayoría de organismos gram-positivos.

- Agar 7.5% NaC1: Este medio es inhibitorio para la mayoría de los organismos, excepto los halófilos. Muy
útil en la detección de miembros del género Staphylococcus.

- Medios Diferenciales/Selectivos: Estos pueden distinguir entre grupos de microorganismos relacionados

morfológica y bioquímicamente.

- Agar Manitol Sal: este medio contiene una alta concentración de cloruro de sodio, 7.5%, que es inhibitorio
del crecimiento de la mayoría, pero no todas, las bacterias diferentes de los estafilococos.

- Agar MacConkey: La acción inhibidora del cristal violeta y las sales biliares en el crecimiento de
organismos gram-positivos permite el aislamiento de bacterias gram-negativas. La incorporación de lactosa
y el indicador de pH rojo neutro permite la diferenciación de bacterias entéricas, basados en su habilidad de
fermentar lactosa.

- Agar Levine o EMB (Eosin-methylene blue agar): La lactosa y los colorantes eosin y azul de metileno
permiten diferenciación entre las bacterias entéricas fermentadoras y no fermentadoras de lactosa, así
como la identificación de Escherichia coli.

- Hidrólisis de Almidón: La hidrólisis del almidón ocurre por medio de la enzima amilasa, que lo degrada a
dextrinas y, posteriormente, a maltosa. La enzima maltasa lego hidroliza la maltosa en glucosa. En este
experimento, se utiliza agar almidón (agar nutriente con almidón añadido), el cual es un medio diferencial
utilizado para distinguir las bacterias que pueden hidrolizar almidón de aquellas que no lo pueden hacer.
Luego de incubar un organismo en agar almidón, la placa es inundada con yodo (lugol), el cual tenirá de
azul negruzco aquellas áreas de la placa en las cuales el almidón no ha sido hidrolizado. Una zona clara
alrededor del crecimiento microbiano indica que el almidón ha sido hidrolizado. Esto representa un
 resultado positivo. La ausencia de dicha zona clara de hidrólisis alrededor de las colonias es indicativa de
un resultado negativo.

- Hidrólisis de lípidos: La degradación de lípidos como los triglicéridos se lleva a cabo por enzimas
extracelulares llamadas lipasas (esterasas), que rompen el enlace éster entre el glicerol y los ácidos grasos.
En este experimento, se utiliza Spirit Blue agar, que contiene tributirina, el triglicérido más sencillo, además
del colorante spirit blue, el cual se utiliza para indicar la lipólisis. Las placas con Spirit Blue agar se inoculan
con un simple rayado e incubadas por 24 a 48 horas. Luego de la incubación, organismos lipasa-positivos
tendrán una coloración azul dentro de la bacteria y estarán rodeadas de un halo claro por la ausencia de
grasa en el medio. Las bacterias lipasa negativas no exhiben el halo ni la coloración azul en el crecimiento
de la bacteria. Un cambio en la coloración del agar no indica un resultado positivo.

- Hidrólisis de la caseína: La degradación de proteínas se lleva a cabo por enzimas llamadas proteasas,
que rompen los enlaces peptídicos produciendo peptonas, polipéptidos, dipéptidos y, en última instancia,
aminoácidos. Cuando la caseína de la leche es hidrolizada, pierde su color y su opacidad, tornándose
translúcida. Algunas bacterias produce la enzima caseasa, que es exportada de la célula y utilizada para
hidrolizar la caseína en péptidos y aminoácidos que puedan ser transportados más fácilmente al interior de
la célula a través de la membrana citoplasmática. El test de hidrólisis de caseína utiliza agar leche
descremada como medio diferencial para distinguir bacterias que pueden hidrolizar la caseína de aquellas
que no pueden. Luego de la incubación, las colonias de organismos capaces de hidrolizar caseína
aparecerán rodeadas de un halo claro donde la proteína, normalmente opaca, ha sido digerida. Los
organismos incapaces de hidrolizar caseína no tendrán dicho halo. El agar leche descremada se utiliza
comúnmente para la enumeración (conteo) de bacterias en leche líquida, leche en polvo, helados y suero
de leche.