BIOLOGÍA
Informe de laboratorio 1 - Coloración Gram
Caren Suzana Cardenas Cardenas
Sindy Tatiana Avila Tabares
Jenny Alejandra Galindo Orrego
Jhony Asdrubal Soto Osorio
Instructora
Sandra Milena Pardo Orozco
SERVICIO NACIONAL DE APRENDIZAJE
REGIONAL ANTIOQUIA
CENTRO DE SERVICIOS DE SALUD
TECNOLOGÍA EN REGENCIA DE FARMACIA
Medellín 2021
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TABLA DE CONTENIDO
1: TRODUCCION----------------------------------------------------------------------------------------3
2: OBJETIVOS ------------------------------------------------------------------------------------------4
3: MARCO TEORICO
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3.1: MATERIALES --------------------------------------------------------------------------------------7
4: PROCEDIMIENTO ---------------------------------------------------------------------------------8
5: RESULTADOS --------------------------------------------------------------------------------------9
6: ANALISIS DE RESULTADOS-------------------------------------------------------------------10
7: CUESTIONARIO ----------------------------------------------------------------------------------12
8: CONCLUSION ------------------------------------------------------------------------------------14
9: BIBLIOGRAFIA -----------------------------------------------------------------------------------14
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INTRODUCCIÓN
La tinción Gram, también conocida como coloración Gram, es una técnica de
laboratorio que también se utiliza rutinariamente en los estudios microbiológicos de la
materia y fue diseñada por Christian Gram, un científico danés en el año 1884.
El objetivo de Gram era conseguir una prueba con la cual fuera posible diferenciar los
grupos de bacterias, para así poder estudiarlas y clasificarlas. La prueba resultó todo
un éxito y pronto se convirtió en una técnica muy útil no solo para el estudio de las
bacterias sino también para poder identificarlas rápidamente en una infección y
seleccionar el antibiótico más adecuado para tratarla.
Este método ha sido y es en la actualidad, constantemente usado en microbiología,
pues es un proceso básico en la caracterización de bacterias convirtiéndolo así en una
herramienta fundamental en el desarrollo de la academia y en el avance de la
microbiología, tanto así que a través de este proceso de tinción se han realizado
clasificaciones serias de microorganismos utilizadas a nivel clínico e industrial. En la
cotidianidad es el método de mayor facilidad técnica, además más rápido y económico,
comparado frente a métodos como medios de cultivo cromógenos, pruebas antígeno-
anticuerpo (ELISA), PCR (Polymerase Chain Reaction) y electroforesis que aunque
más específicos, requieren mayores inversiones de tiempo, económicas, y técnicas.
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OBJETIVOS
Con el desarrollo de esta práctica se pretende:
❏ -Reconocer en el microscopio la composición y diferencia estructural de la pared
celular de Gram positivas y Gram negativas.
❏ -Clasificar algunas especies bacterianas en Gram positivas o Gram negativas
según la coloración de Gram.
❏ - Conocer diferentes coloraciones utilizadas en bacteriología.
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MARCO TEÓRICO
La tinción o coloración de Gram, consiste en un método de identificación de
microorganismos mediante un tratamiento con colorantes determinados. Este método
permite la diferenciación de los microorganismos en dos grupos: Gram positivos y
Gram negativos. Se basa en la diferencia del color de las membranas de las células
sometidas al proceso de tinción.
La tinción de Gram fue desarrollada en un intento por diferenciar las bacterias dentro
de las secciones de tejido. El fundamento de este protocolo de tinción, es que ciertas
bacterias retienen un colorante complejo (Azul de Metileno, Cristal Violeta) cuando son
expuestos a disolventes orgánicos como la Acetona o el Alcohol. El complejo está
formado entre el yodo (Lugol) y un colorante de anilina (Cristal Violeta). Los tejidos no
retienen este complejo y necesitan de una contratinción, o tinción de contraste, con un
tinte rojo para ayudar a la visualización. Pronto se dieron cuenta que no todas las
bacterias retenían el complejo Lugol-Cristal violeta cuando se sometían a la
decoloración con Acetona o Alcohol. Aquellas bacterias que retienen el complejo son
llamadas Gram-positivas y aquellas que no lo retienen son llamadas Gram-negativas.
Esta reacción demuestra una diferencia fundamental en la estructura de las bacterias
Gram-positivas y las bacterias Gram-negativas, particularmente respecto a las
estructuras de sus paredes celulares, y esto forma la base de muchos esquemas de
identificación de bacterias
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A pesar del hecho de que la tinción de Gram fue desarrollada hace más de 100 años,
su mecanismo de funcionamiento aún no está completamente comprendido.
Sin embargo, las bacterias Gram positivas son células que poseen una membrana
citoplasmática con fosfolípidos y proteínas, con una pared gruesa de peptidoglicano, la
cual es una macromolécula formada por cadenas de un dímero compuesto por N-acetil
glucosamina y N-acetil murámico, y a su vez estas cadenas se encuentran unidas entre
sí mediante péptidos, que son pequeñas cadenas de aminoácidos que se entrecruzan.
Estos puentes peptídicos son característicos de las distintas bacterias y presentan
mayor rigidez cuanto más completo sea el entrecruzamiento, las bacterias gram
positivas toman un color morado al realizarse este tipo de tinción.
Por otro lado las bacterias Gram negativas son células con una delgada capa de
peptidoglicano y una segunda envoltura en la membrana externa compuesta por
Proteínas, Fosfolipidos y Lipopolisacáridos.
Las bacterias gram negativas toman un color rosado con este tipo de tinción. Por lo
tanto, ambos tipos de bacterias se tiñen diferencialmente debido a estas diferencias
constitutivas de su pared. La clave en la tinción es el peptidoglicano, ya que es el
material que confiere su rigidez a la pared celular bacteriana por tanto las Gram
positivas como lo describíamos posee mayor grosor en esta capa en proporción a las
Gram negativas
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MATERIALES
● Mechero: es un instrumento utilizado en laboratorios para calentar muestras y
sustancias químicas.
● Lamina porta objeto: es una pieza delgada plana de vidrio de diferentes
dimensiones (típicamente 75 por 25 mm y aproximadamente 1 mm de espesor),
se utiliza para fijar muestras que posteriormente serán examinadas con un
microscopio.
● Asa bacteriológica: Se emplea para transportar, arrastrar, trasvasar inóculos
(pequeño volumen que contiene microorganismos en suspensión) desde la
solución de trabajo también llamada “solución madre” al medio de cultivo (sólido
o líquido) o de un medio a otro (resiembra). También sirve para la realización de
frotis.
● Microscopio compuesto: Este aparato permite observar lo que es invisible a
simple vista
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● Cultivo bacteriológico: es empleado como un método fundamental para el
estudio de las bacterias y otros microorganismos que causan enfermedades en
medicina humana y veterinaria.
● Cristal violeta: El violeta de metilo, comúnmente denominado cristal violeta o
violeta de genciana, es el nombre dado a un grupo de compuestos químicos
empleados como indicadores de pH y colorantes.
Los violetas de metilo son mezclas de: N-tetra, N-penta y N-hexametil p-
rosanilinas.
● Acetona: es un compuesto químico que se encuentra naturalmente en el medio
ambiente. A temperatura ambiente se presenta como un líquido incoloro de olor
característico. Se evapora fácilmente, es inflamable y es soluble en agua. La
acetona sintetizada se usa en la fabricación de plásticos, fibras, medicamentos y
otros productos químicos, así como disolvente de otras sustancias químicas.
● Lugol: El lugol o disolución de Lugol es una disolución de yodo molecular I 2 y
yoduro potásico KI en agua destilada. Este producto se emplea frecuentemente
como desinfectante y antiséptico, para la desinfección de agua en emergencias
y como un reactivo para la prueba del yodo en análisis médicos y de laboratorio.
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● Safranina: es un colorante biológico, de contraste que se utiliza en la Tinción de
Gram para proporcionar un color violeta más intenso a las bacterias Gram + y
tiñe de rosa a las bacterias G- ; en histología y en citología.
● Aceite de inmersión: En general el aceite de inmersión sirve para aumentar la
resolución de un microscopio mediante la inmersión de la lente objetivo y el
espécimen en un aceite transparente de alto índice de refracción.
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PROCEDIMIENTO
Una vez que la instructora nos hace entrega de los materiales procedemos a calentar
en el mechero el asa, con este ya frio tomamos la muestra que se encuentra en la
placa de Petri una pequeña cantidad de cultivo la cual extiendimos en la laminas porta
objetos previamente limpias; La muestra en la placa se dejó secar y fijar, luego
agregamos el cristal violeta, cubriendo toda muestra y dejando actual por un minuto
posteriormente se enjuagó. Seguidamente agregamos Lugol y de igual forma cubrimos
con esta toda la muestra dejando actuar por otro minuto. Posteriormente pasamos a
enjuagar de nuevo. Sobre la placa se aplica el alcohol acetona dejandolo actuar por 30
segundos y se vuelve a enjuagar. Pasados 30 segundos se aplica safranina cubriendo
toda la muestra y dejando actuar por otro minuto y por ultima vez se enjuaga. Dejamos
secar a temperatura ambiente por 15 minutos y por último pasamos a observar los
resultados en el microscopio .
Con el asa tomamos de la placa de
Petri una pequeña cantidad de cultivo
que se extiende en la lámina porta
objetos la cual debe estar limpia,
donde se deja secar y fijar.
Agregamos el cristal violeta cubriendo
toda muestra, dejando actuar por un
minuto, luego se enjuagó.
Después agregamos lugol cubriendo
toda la muestra y dejamos actuar por
otro minuto.
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Aplicamos el alcohol acetona, se dejó
actuar por 30 segundos y volvimos a
enjuagar.
Aplicamos safranina cubriendo toda la
muestra y dejamos actuar por un
minuto y por ultimas vez se enjuaga,
dejándola secar a temperatura
ambiente por 15 minutos
Por último pasamos a observar
los resultados en el microscopio
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RESULTADOS
Del procedimiento anterior obtuvimos el siguiente resultado visualizado en el
microscopio electrónico con una lente 40X .
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ANÁLISIS DEL RESULTADO
De las imágenes anteriores las cuales observamos en esta práctica de laboratorio
podemos deducir lo siguiente:
Se logró identificar en el cultivo bacterias gram negativas caracterizadas luego
de tincion por su color rosa, esto quiere decir que poseen una membrana
delgada la cual no retuvo la tinción dado que las bacterias Gram negativas
como lo expresábamos en el marco teorico contienen una membrana externa
rica en lipopolisacáridos que forma parte de su pared celular. Las grasas fueron
destruidas por el contacto con el alcohol acetona, por lo que la membrana
externa se desestabiliza, siendo liberado el cristal violeta y quedando
impregnada la tinción realizada con safranina obteniendo el característico color
rosa
En esta muestra logramos identificar con el uso del microscopio una estructura
alargada de forma cilíndrica, lo que deducimos según lo estudiado con la
instructora que indicaría pertenecer a bacilos.
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Se logra identificar mediante microscopio otra estructura bacterial que por su
forma esférica pertenecería a cocos.
La agrupación identificada mediante microscopio correspondería a
estreptobacilos, teniendo en cuenta su forma alineada.
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Por último otra agrupación identificada son los estafilococos, dado que se
visualizaban concentradas en un solo plano.
CUESTIONARIO
1. Describa el tipo de coloración, la forma y el tipo de agrupación de las bacterias
observadas.
Al momento de observar en el microscopio alcanzamos a identificar que la bacteria es
gram negativa, ya que el color que resulto después de terminar el proceso o
preparación fue de aspecto rosado, esto quiere decir que tiene una pared fina, no
retuvo el colorante durante la tinción de Gram.
La forma que logramos identificar fue de bacilos por su forma cilíndrica alargada y con
una agrupación de estreptobacilos por su agrupación alineada.
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También identificamos cocos pos su forma esférica y con agrupación de estafilo por
estar agrupadas en un plano.
2. Cuál es el fundamento de la coloración de Gram.
El cristal violeta es el primer colorante utilizado. El mismo tiene afinidad por el
peptidoglicano y teñirá de morado a todas las bacterias presentes, posteriormente se
coloca el lugol, que actúa como mordiente, es decir, inducirá a la formación de
complejos insolubles de cristal violeta - yodo – proteínas ribonucleases dentro de la
célula.
Las bacterias Gram positivas, al tener una pared gruesa de peptidoglicano, forman más
complejos (cristal violeta-yodo), por tanto retienen el colorante, demás también influye
que la pared de las bacterias Gram positivas contienen mayor cantidad de ácidos no
saturados, los cuales muestran gran afinidad por los agentes oxidantes (Lugol),
mientras las bacterias Gram negativas poseen una capa delgada de peptidoglicano, lo
que hace que las bacterias formen menos complejos que las Gram positivas.
Posteriormente viene el paso de la decoloración, donde las bacterias Gram positivas y
Gram negativas se comportan de manera diferente, así pues las bacterias Gram
negativas que contienen una membrana externa rica en lipopolisacáridos forman una
pared celular más delgada. Po tanto las grasas son destruidas por el contacto con el
alcohol acetona y la membrana externa se desestabiliza, siendo liberado el cristal
violeta, es así como luego se debe contra teñir con la safranina o fucsina básica, y
toma el característico color rosa.
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Cabe anotar en el caso de las bacterias Gram positivas, que estas resisten la
decoloración, porque el decolorante actúa cerrando los poros, lo que impide que el
complejo cristal violeta/yodo pueda salirse por tanto se conserva estable la coloración
con el cristal violeta y no hay cabida para la safranina o la fucsina tornándose de su
característico color de tinción de azul intenso o morado.
3. Describa brevemente otras dos técnicas de coloración usadas en bacteriología
diferentes a la de Gram.
Tinción de Wright
La tinción de Wright es una técnica que se emplea generalmente para la diferenciación
de elementos celulares de la sangre y es clasificada como una tinción policromática,
dado que puede teñir compuestos ácidos o básicos presentes en una célula.
Esta tinción tiene diversos usos en microbiología; en la parasitología, se le emplea en
la búsqueda de hematozoarios como Plasmodium spp. El reactivo de Wright está
compuesto por eosina y azul de metileno, cuando éste se oxida se conoce como azur B
a una concentración de 0.8 g/L empleando como solvente alcohol metílico.
Tinción de azul algodón de lactofenol
El examen microscópico es de gran importancia en micología para la observación de
las diferentes especies de hongos de interés clínico. Se deben utilizar tinciones que
logren preservar la integridad de las estructuras fúngicas.
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Para la correcta identificación de hongos de interés clínico, ya sea con fines de
diagnóstico o estudios taxonómicos, es necesario observar las estructuras fúngicas con
una alta calidad y contraste; para ello se utilizan diversos compuestos químicos que
permitan la tinción entre la pared y el citoplasma de las células fúngicas.
La tinción de azul algodón de lactofenol no es considerada una tinción diferencial, sin
embargo, posee características tintoriales que permiten observar cada uno de los
componentes fúngicos y apreciar fácilmente las estructuras para una adecuada
identificación.
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CONCLUSIÓN
Finalmente podemos concluir en este informe de laboratorio que hemos logrado el
objetivo de diferenciar, clasificar y definir los diferentes microorganismos haciendo uso
de técnicas aprendidas y llevadas a la practica en el ámbito del laboratorio, mediante
un tratamiento determinado y ordenado con colorantes usando químicos sumamente
importantes para estas técnicas como lo son el cristal violeta, la acetona, el lugol y la
safranina.
También logramos avances en el conocimiento y aplicación de estas técnicas o
métodos con el objeto de lograr distinguir microorganismos que dependiendo de los
resultados en su coloración podrán ser gram positivos y/o gram negativo situación tal
que es sumamente importante en el ámbito clínico para la identificación de patógenos
y su respuesta en el control antimicrobiano.
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BIBLIOGRAFIA
https://www.salud.mapfre.es/pruebas-diagnosticas/otras-pruebas-diagnosticas/tincion-
de-gram/#:~:text=La%20tinci%C3%B3n%20de%20Gram%20es%20un%20tipo%20de
%20tinci%C3%B3n%20que,t%C3%A9cnica%20se%20denominan%20Gram
%20negativas.
DR. Eva Ormaechea. (Especialista en Medicina intensiva) 11/12/2017. Bogotá
https://repository.javeriana.edu.co/bitstream/handle/10554/7011/tesis459.pdf?
sequence=1&isAllowed=y Noviembre 2010.
https://aprenderly.com/doc/574945/tinci%C3%B3n-gram?page=3 29/03/2017. México.
