PRÁCTICA Nº 5

CÉLULA PROCARIONTE: BACTERIAS

I. INTRODUCCIÓN

Son seres generalmente unicelulares que pertenecen al reino Monera. Su tamaño varía
entre 1 - 2 m por 1 – 4 m o menos. Las bacterias tienen una estructura menos compleja
que la de las células de los organismos superiores. Son células procariotas, que presentan
un cromosoma circular y carecen de membrana nuclear.

Las bacterias juegan un papel fundamental en la naturaleza y en el hombre: la presencia

de una flora bacteriana normal es indispensable, aunque algunos gérmenes son patógenos.

Análogamente tienen un papel importante en la industria y permiten desarrollar

importantes progresos en la investigación, concretamente en fisiología celular y en genética.

El examen microscópico de las bacterias nos permite identificarlas, ya que existen pocos
tipos morfológicos, cocos (esféricos), bacilos (bastón), espirilos (espiras), vibrios (coma). El
estudio mediante la microscopia óptica y electrónica de las bacterias revela la estructura de
éstas.

OBJETIVO
• Demostrar la presencia de microorganismos que reencuentran en diversos hábitats, usando
para ello indicadores químicos y técnicas de coloración.

II. MATERIALES Y MÉTODOS

• Muestras de leche (fresca, fresca hervida, fresca destapada, guardada varios días)
• Tubos de ensayo con tapa rosca
• Pipetas de 1, 5 y 10 ml
• Goteros
• Láminas y laminillas
• Batería GRAM: Cristal Violeta, lugol, alcohol-acetona, safranina o fucsina
• Azul de metileno al 1%
• Aceite de inmersión
• Baño maría
• Microscopio compuesto
• Mechero de alcohol
• Papel lente
• Marcador
• Mondadientes
• Fósforos o encendedor

III. DESARROLLO EXPERIMENTAL

A) PRUEBA DE LA REDUCTASA

1.1. FUNDAMENTO
Las bacterias poseen enzimas (reductasas). La deshidrogenasa, actúa sobre el substrato (leche)
liberando hidrógenos que son captados por el azul de metileno, este se reduce pasando a
incoloro.
 1.2. PROCEDIMIENTO
- Colocar 5 ml de cada muestra de leche
- Agregar 3 gotas de azul de metileno
- Tapar los tubos y llevarlos a 37ºC
- Observar las muestras e interpretar, considerando la decoloración producida en las
muestras de acuerdo a la siguiente tabla.

PRUEBA DE LA REDUCTASA
Menos de 20 minutos Altamente contaminado
De 20 minutos a 2 horas Poco contaminado
De 2 horas a 5 ½ horas Limpia
De 5 ½ horas a 8 horas Buena
Más de 8 horas Excelente

MUESTRA PROCEDENCIA RESULTADO

1
2
3
4
5

B) COLORACIÓN GRAM

1.1 FUNDAMENTO
El método se basa en la capacidad tintorial de las bacterias y las divide en dos grandes
grupos, GRAM (+) y GRAM (-). Cuando las bacterias toman el colorante cristal violeta o violeta
de genciana o cristal violeta y si retienen este colorante después del tratamiento con lugol y
lavado con alcohol-acetona, se les denomina bacterias GRAM POSITIVAS y presentan una
coloración púrpura. Si las bacterias no retienen el colorante después del tratamiento con lugol y
lavado con alcohol-acetona y por tanto toman el colorante de contraste fucsina básica o
safranina, dando un color rojo-grosella, se les denomina bacterias GRAM NEGATIVAS.

El fundamento de la reacción se basa en que el colorante cristal violeta o violeta de genciana

se mezcla con el lugol (mordiente) y forma el complejo CV-I el cual queda retenido en la malla
que forma el peptidoglucano en la pared celular y luego éste, al ser tratado con el alcohol -
acetona (diferenciador) no cede el colorante, que queda retenido en esta malla y se mantiene el
color violeta.

En cambio, las bacterias gram negativas presentan un peptidoglucano más delgado y una
capa gruesa de lipopolisacáridos, estos son solubilizados el tratamiento con el decolorante y
requieren de un colorante de contraste como la fucsina o safranina dando una coloración rojo
grosella, pudiendo ser observadas. Estudios recientes comparativos atribuyen el carácter de gran
positividad a la estructura química de las paredes celulares; entre otras, principalmente, al
contenido de lípidos. En las gram positivas la permeabilidad de las paredes resistentes puede
decrecer por el efecto deshidratante del alcohol, mientras que en las gram negativas el alcohol
extrae de sus paredes el gran contenido de lípidos aumentando la permeabilidad. De esta
manera, fácilmente escapa el complejo cristal violeta-yodo o violeta de genciana-yodo

1.2 PROCEDIMIENTO
1. Con el mondadientes obtenga una muestra de sarro dentario
2. Extienda la muestra en la lámina
3. Secar la muestra al mechero
4. Adicionar violeta de genciana y dejar actuar por 2 minutos
 5. Lavar con agua corriente
6. Cubrir con lugol por un minuto
7. Lavar con alcohol-acetona (cuidadosamente)
8. Lavar con agua corriente
9. Cubrir con fucsina básica por un minuto
10. Secar la muestra
11. Adicionar una gota de aceite de inmersión
12. Examinar al microscopio utilizando el objetivo de inmersión
13. Identifique las diferentes formas de los microorganismos y esquematice.

IV. CUESTIONARIO

1. Haga un esquema de la pared celular de un microorganismo y de una planta y establezca

diferencias y semejanzas
2. ¿Qué es el sarro y que ocasiona su presencia?
3. ¿Cuál es la acción que cumple el lugol en la coloración Gram?
4. ¿Cuál es la razón del uso de alcohol-acetona?
5. ¿Qué tipo de colorantes son los utilizados en la coloración Gram?
6. ¿Qué es un peptidoglucano y cuál es su importancia en las bacterias?
7. Establezca las semejanzas y diferencias de la pared celular entre las bacterias gram positivas
y negativas
8. ¿Cuál es la razón de utilizar el mechero en la preparación de las muestras para la coloración?
9. ¿Cuál es el procedimiento de la coloración GRAM?

Vídeo: https://www.youtube.com/watch?v=FceD8FFhuew
MORFOLOGÍA DE BACTERIAS
Comparación de las envolturas celulares bacterianas.
Arriba: Bacteria Gram-positiva. 1-membrana citoplasmática, 2-péptidoglicano, 3-fosfolípidos, 4-
proteínas, 5-ácido lipoteicoico.
Abajo: Bacteria Gram-negativa. 1-membrana citoplasmática (membrana interna), 2- espacio
periplasmático, 3-membrana externa, 4-fosfolípidos, 5-péptidoglicano, 6-lipoproteína, 7-
proteínas, 8- lipopolisacáridos, 9-porinas.

Bacilos Gram Positivos Cocos Gram Negativos