Tinciones Diferenciales

Q.F.B. JOSE FRANCISCO IBARRA RAZURA

Tinciones diferenciales
Como su nombre lo indica, nos permiten
diferenciar entre grupos de bacterias que
tienen distintas propiedades tintoriales
Las
tinciones
diferenciales
ms
comnmente utilizadas son la tincin de
Gram y la tincin de Ziehl-Neelsen

Tincin de Gram

La
tincin
de
Gram.
Fue
desarrollada
empricamente por Christian Gram en 1884, a
pesar del tiempo transcurrido la tincin apenas se
ha modificado y es uno de los primeros pasos
que se realiza para cualquier identificacin
bacteriana.

La tcnica es capaz de diferenciar dos grandes

grupos de eubacterias: Gram positivas y Gram
negativas.

Fundamento de la Tcnica
La diferenciacin entre las bacterias Gram positivas y Gram
negativas se establece en la naturaleza y caractersticas de
la pared celular bacteriana.
Las bacterias Gram positivas poseen una gruesa capa de
peptidoglicano que es capaz de retener al complejo
colorante-mordiente (cristal violeta-yodo). Durante la
decoloracin con alcohol acetona se provoca una
deshidratacin de esta gruesa pared y se reduce la
porosidad, atrapando entonces al complejo en el interior de
la clula.
Las bacterias Gram negativas, poseen una delgada capa de
peptidoglicano no puede impedir la salida del complejo
colorante-mordiente (cristal violeta-yodo) y es entonces
fcilmente teida por el colorante secundario o de
contraste.

Resultados de la coloracin
Los dos grupos bacterianos a los que anteriormente se
refiere difieren en el color con el que finalmente se tien las
bacterias. Gram positivas se observarn de azul por el
cristal violeta y no perdern esta coloracin durante los
pasos sucesivos. Las bacterias Gram negativas perdern
la coloracin inicial con los siguientes pasos y se teirn
de rosa debido a la Safranina.
La diferencia esta determinada por la composicin de su
envoltura celular, las bacterias Gram. positivas poseen una
malla de
pptido glicano en su parte mas externa
,mientras que las Gram. negativas recubriendo una fina
capa de peptidoglicano y presentan una membrana externa
.

Reactivos y Colorantes
La tincin de Gram. requiere cuatro soluciones:
1. Primer colorante. Un colorante bsico (+) que en
contacto con las clulas cargadas negativamente, reacciona
con ellas colorendolas. El mas utilizado es el cristal
violeta.
2. Solucin mordiente. Fija las tinciones y aumenta la
afinidad entre el colorante y las clulas. Los mordientes
usados suelen ser sales metlicas, cidos o bases, como
por ejemplo, una sol. diluida de yodo.
3. Agente decolorante. Es un disolvente orgnico; por
ejemplo alcohol acetona (1:1).

4. Colorante de contraste. Es un colorante bsico de

distinto color que el primer colorante, como por ejemplo, la
Safranina.

Procedimiento Tcnico
1)
2)

Realizar el extendido de la muestra

Fijacin del extendido
Mtodos fsicos: accin del calor
Mtodos qumicos: metanol

3)
4)
5)
6)

Primer colorante: cristal violeta

Mordiente: Lugol (sc I2/KI)
Decoloracin: mezcla alcohol-acetona
1:1
Segundo colorante: safranina

Procedimiento Tcnico

Diferencias entre Gram (+) y (-)

Morfologa Bacteriana

Tincin de Ziehl-Neelsen

La tincin de Ziehl_Neelsen desarrollada

inicalmente por Paul Ehrlich para poner de
manifiesto la presencia de los bacilos causantes
de tuberculosois en muestras clnicas de
pacientes es otra muy importante tincin
diferencial.

La tcnica es capaz de diferenciar dos grandes

grupos de eubacterias: BAAR positivas y BAAR
negativas.
BAAR: bacilos cido alcohol resistentes

Fundamento de la Tcnica
Las paredes celulares de ciertos parsitos y bacterias.
contienen cidos grasos (cidos miclicos) de cadena larga
(50 a 90 tomos de carbono) que les confieren la propiedad
de resistir la decoloracn con alcohol-cido, despus de la
tincin con colorantes bsicos. Por esto se denominan
cido-alcohol resistentes. Las micobacterias como M.
tuberculosis y M. marinum y los parsitos coccdeos
como
Cryptosporidium
se
caracterizan
por
sus
propiedades de cido-alcohol resistencia.

Fundamento de la Tcnica

La coloracin clsica de Ziehl-Neelsen

requiere calentamiento para que el colorante
atraviese la pared bacteriana que contiene
ceras. Al suspender el calentamiento y enfriar
con agua, provoca una nueva solidificacin de
lo cidos grasos de modo que el colorante ya
no puede salir de las bacterias. Por otro lado,
el calentamiento aumenta la energa cintica
de las molculas del colorante lo cual
tambin facilita su entrada a las bacterias.
Las bacterias que resisten la decoloracin son
de color rojo y la que no se ven de color azul.

Procedimiento Tcnico
1)
2)
3)
4)
5)
6)
7)
8)
9)
10)
11)

Hacer un frotis
Secar al aire y fijar por calor
Cubrir todo el porta-objetos con fucsina fenicada
Calentar suavemente con el mechero hasta la emisin de
vapores.
El colorante no debe secarse ni hervir, aadir ms si es
necesario.
Mantener la emisin de vapores durante 5 minutos.
Lavar con un chorro suave de agua.
Decolorar con alcohol cido
Lavar con agua
Cubrir el frotis con azul de metileno y dejarlo actuar
durante un minuto.
Lavar con agua, escurrir y dejar secar al aire Observar al
microscopio con el objetivo de inmersin

Las bacterias ZN+ o BAAR se observarn teidas intensamente

de color rojo.

Mycobacterium tuberculosis

Tinciones Selectivas

Las tinciones selectivas nos permiten

observar estructuras de las clulas gracias a
su mayor afinidad por los colorantes
utilizados

Se pueden observar estructuras como la

pared celular, cpsula, flagelos, material
nuclear, e inclusiones como depsitos de
materiales de reserva de poli-hidroxibutirato, glucgeno y grnulos
metacromticos

Coloracin de esporas
Algunas bacterias son capaces de desarrollar formas de
resistencia denominadas esporas como mecanismo de
defensa a agresiones ambientales. Son estructuras de pared
gruesa en las que el microorganismo logra soportar las
condiciones desfavorables de calor, desecacin, acidez, etc.
Cuando las condiciones ambientales vuelven a ser favorables
las esporas "germinan" y vuelven a generarse formas
vegetativas. Por ese motivo, las endosporas son
impermeables a los colorantes, por lo que cuando se
hace una tincin, se observan al microscopio como cuerpos
altamente refringentes y sin teir.
Sin embargo, las endosporas se pueden teir aplicando calor a
la preparacin previamente cubierta con una solucin de
colorante que en la tcnica de Shaeffer y Fulton es el verde
de malaquita. El lavado con agua elimina este colorante de
las clulas vegetativas y la aplicacin de un colorante de
contraste permitir distinguir claramente a las esporas de
color verde.

Endosporas en las bacterias

Coloracin de la cpsula
Algunas bacterias presentan una capa externa a la pared
denominada cpsula. Est compuesta de azcares y
protenas. No es una estructura vital para la bacteria, de
modo que es posible que bajo determinadas condiciones
ambientales o del propio desarrollo genere cpsula y bajo
otras no lo haga. Se ha comprobado que la presencia de
cpsula dificulta de algn modo la fagocitosis de las
bacterias, es decir las cpsulas constituyen un factor de
virulencia de los microorganismos.

La tincin de cpsula se denomina tincin negativa porque

tie el fondo de la preparacin y no el microorganismo.
Desde el punto de vista formal no es una tincin
propiamente dicha, porque no fija los microorganismos. Se
parece ms a una preparacin en fresco. Su realizacin es
sencillsima, consiste en colocar la muestra hmeda sobre
el porta objetos y mezclarla con tinta china. La tinta cubre
toda la preparacin a excepcin de las cpsulas. En el
microscopio
se
observa
el
fondo
negro
y
los
microorganismos con cpsula sin color.

Procedimiento Tcnico
Mtodo de la tinta china para cpsula
1.-En el centro de un portaobjetos se coloca una gota de
agua, otra de tinta china y un poco del cultivo de una cepa
capsulada. Se mezcla suavemente sin extender.
2.-Se coloca un cubreobjetos sobre la suspensin y se
presiona suavemente evitando que queden burbujas.
3.-Observar inmediatamente al microscopio.
4.-Desechar la preparacin en un recipiente con antisptico.
La cpsula se observa como una gran estructura alrededor
de la clula delimitada por los pequeos fragmentos de
carbn de la tinta china.

Cpsulas bacterianas