GUIA DE LABORATORIO No.

TÉCNICAS DE TINCIÓN E IDENTIFICACIÓN:

TINCIONES SIMPLES Y DIFERENCIALES

FACULTAD: Ciencias Básicas y Biomédicas

PROGRAMA: Medicina

SEMESTRE: IV Microbiología

PROFESOR ANORIS FERNANDEZ

OBJETIVOS

1. Conocer la composición e importancia de la coloración de Gram.

2. Diferenciar bacterias Gram positivas y Gram negativas.
3. Conocer las diferentes formas de la célula procariota

RESULTADOS DE APRENDIZAJE ESPERADOS

Que los estudiantes aprendan cual es la importancia de la coloración de Gram e identifiquen

morfológicamente las diferentes estructuras bacterianas.

MATERIALES/RECURSOS Y EQUIPOS
MATERIALES
Bata
Tapabocas
Gorro
Guantes
Laminas
Asa Microbiológica en aro
Palillo
Mechero
Papel absorbente

EQUIPOS
Microscopio compuesto eléctrico

REACTIVOS
Aceite de inmersión.
Agua destilada
Colorante de Gram
Azul de metileno
MUESTRAS
Cepas de bacterias Gram Positivas y Gram negativas

ACTIVIDAD FORMATIVA

INTRODUCCION

Las células bacterianas (procariota) típicamente son muy pequeñas, la mayoría son
organismos unicelulares, sin membrana nuclear, es decir cuyo ADN no se encuentra
confinado dentro de un compartimiento limitado por membranas, sino libremente en el
citoplasma, en forma de una sola hebra circular, división celular por fisión binaria, contienen
ribosomas, pero carecen de orgánulos membranosos en el citoplasma. La mayoría de las
enzimas necesarias para las actividades metabólicas se localizan en el citoplasma.

La mayoría de las células procariotas tienen una pared celular alrededor de la membrana
plasmática, dichas estructuras constituyen una armazón rígida que soporta a la célula,
mantiene su forma e impide que estalle a causa de la presión osmótica. La pared celular
bacteriana está formada por Peptidoglucano, una molécula orgánica compleja.

Las diferencias en composición de la pared celular de las bacterias son de gran interés. La
tinción de Gram permite diferenciar las bacterias según su composición de la pared celular.
Las bacterias que absorben y retienen el pigmento llamado violeta de cresilo se denominan
grampositivas, en tanto que las que no lo retienen son gramnegativas. La pared celular
de las bacterias grampositivas es muy gruesas y consisten sobre todo en Peptidoglucano;
la pared celular de las gramnegativas consiste en dos capas, una muy delgada de
Peptidoglucano y una gruesa membrana externa que contiene carbohidratos unidos a
lípidos. Dicha coloración también nos permite observa y diferenciar la morfología bacteriana
en sus tres formas principales: esférica, cilíndricas y espiral.

Para la identificación de la morfología de los microorganismos existen diferentes tipos de

tinciones, entres la que encontramos:

TINCION DE GRAM:

1. Colorante Básico: En contacto con las células cargadas negativamente, reacciona

con ellas coloreándolas. El más utilizado es el cristal violeta.

2. Colorante Mordiente: Fija las tinciones y aumenta la afinidad entre el colorante y

las células. Los mordientes empleados suelen ser sales metálicas, ácidos o bases,
como, el Lugol.

3. Agente Decolorante: Es un disolvente orgánico, como el alcohol-acetona (1:1).

 4. Colorante de Contraste: Es un colorante básico de distinto color que el primer
colorante, como la safranina o la fucsina.

1. Realización de la extensión
a. Producto líquido: Depositar en el centro de un portaobjetos una pequeña cantidad del
producto a examinar y extenderlo con la ayuda de un asa de platino o una pipeta de modo
que la extensión sea lo más fina y homogénea posible. Un producto denso puede ser
diluido antes ligeramente.
b. cultivo en medio sólido: depositar en un portaobjetos una gotita de agua ó solución
salina estéril y disociar en ella una pequeña cantidad de cultivo. Extender para obtener un
frotis fino y homogéneo.
c. yogurt: depositar en un portaobjetos una gotita de agua ó solución salina estéril y
disociar en ella una pequeña cantidad de yogurt. Extender para obtener un frotis fino y
homogéneo.

Preparación de frotis en medios sólidos y líquidos

https://www.youtube.com/watch?v=O9bUs7UuS10

2. Secado
Dejar secar por sí solo el frotis. Se puede acelerar la desecación calentando ligeramente
con un mechero Bunsen, pero sin calentar jamás brutalmente.

3. Fijación

Cuando la extensión esté bien seca, proceder a la fijación. Sólo algunas coloraciones
especiales no deben ir precedidas de una fijación. Él motivo de la misma es hacer adherir
el frotis al portaobjetos y fijar la morfología de las bacterias, células, por coagulación
rápida de las proteínas.
Puede ser por:
- Alcohol flameado: Es la técnica más general. Se Vierte sobre la preparación algunas
gotas de alcohol absoluto. Después de algunos segundos de contacto, escurrir lo mejor
posible e inflamar después el alcohol restante.
-Por el calor: Aplastar la llama de un mechero Bunsen 2 a 3 veces contra la parte inferior
de la preparación, que sujetaremos con unas pinzas. Este método debe rechazarse para
los productos patológicos puesto que altera la morfología de los elementos celulares.
-Por el alcohol en frío: Recubrir la preparación con alcohol etílico absoluto o metílico.
Dejar actuar 1 o 2 minutos. Escurrir y dejar secar.
-Por el ácido ósmico: Ciertas coloraciones necesitan una fijación previa por el ácido
ósmico en solución acuosa al 1 por 100. Exponer la extensión húmeda a los vapores de
ácido ósmico durante algunas decenas de segundos. Fijar seguidamente con alcohol
flameado o con alcohol metílico.

Fijación por calor

https://www.youtube.com/watch?v=CeI5nA3UIkQ

4. COLORACION DIFERENCIAL (COLORACION DE GRAM)

1. Agregue Cristal Violeta hasta cubrir la muestra y deje actuar el colorante por un
minuto, lave la muestra con agua del chorro.
2. Cubra la preparación con Lugol durante un minuto y lave suavemente.
3. Agregue Alcohol Acetona por diez segundos, cuando la preparación no desprenda
más colorante, lave con agua
4. Cubra la preparación con Fucsina Básica o Safranina durante un minuto, lave con
agua y deje que se escurra el exceso sobre el papel absorbente. Seque la muestra
al aire libre.

https://www.youtube.com/watch?v=bdlKR0BBczE

6. Examen de las preparaciones teñidas

Las preparaciones coloreadas se examinan con el objetivo de inmersión (100x) sin
usar cubreobjetos.
Depositar sobre el frotis una gota de un aceite especial (aceite de inmersión).
Descender primero el objetivo de 10 x, una vez enfocado pasar al lente de 100 x
sumergiéndolo en la gota, comprobar el enfoque microscópico con el tornillo
micrométrico

7. DIBUJA:

Bacterias Gram positivas

Tinción diferencial, fotografía de lo Descripción de la forma, agrupación y Gram
observado (Gram)
Bacterias Gram negativas

Tinción diferencial, fotografía de lo Descripción de la forma, agrupación y Gram

observado (Gram)

CUESTIONARIO

1. Investiga que coloraciones simples se pueden utilizar el laboratorio de

Microbiología y cuál es su utilidad.
2. Porque se recomienda fijar las muestras de cultivo liquido con alcohol y no con
calor
3. Porque se deben colocar varias veces muestras para la realización de un frotis de
un cultivo en medio líquido y una de muestra en cultivo en medio solido
4. Cuáles son las ventajas y desventajas de las coloraciones simples
5. Cuáles son los errores que se pueden cometer al realizar un frotis
6. Cuáles son los reactivos y tiempos empleados para la coloración Gram y que
sucede en cada paso. Realice un cuadro
7. Que otras coloraciones diferenciales hay además de la de Gram
8. Realice un cuadro general las técnicas de diagnóstico directo (tinciones y cultivos)
para bacterias y hongos

REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS
1. PATRICK R. MURRAY, Microbiología Medica, 8va Edición, Editorial Elsevier. 2017
2. BAILEY SCOTT, Diagnostico microbiológico, 11ª Edición, Editorial panamericana,
Buenos aires, 2004.
3. ALBRECHT Thomas, Medical Microbiology; 4ª Edition, Baron Samuel, editor.
Galveston (TX): University of Texas Medical Branch; c1996
4. MADIGAN, Martinko and Parker Biology of Microorganisms 8th edition, 2000 -
Southern Illinois University, Carbondale
5. The Blue Book, Guidelines for the control of infectious diseases Victorian State
Government, Australia 2005.
6. Mark S. Smolinski, Margaret A. Hamburg, and Joshua Lederberg Microbial Threats
to Health:Emergence, Detection, and Response 2003 - National Academy of
Sciences, 367 pp
7. Richard Hunt et al.Microbiology, Virology, Immunology, Bacteriology, Parasitology,
Mycology Online 2004 - The Board of Trustees of the University of South Carolina
8. GARCÍA, Alfonso Leopoldo. “La Investigación Biomédica, los Ensayos Clínicos”,
Edit. Bio, Madrid, 1999