UNIVERSIDAD NACIONAL MAYOR DE SAN MARCOS

(Universidad del Per, Decana de Amrica) FACULTAD DE MEDICINA

ESCUELA ACADEMICO PROFESIONAL DE TECNOLOGIA MEDICA
LABORATORIO CLINICO Y ANATOMIA PATOLOGICA

VALIDEZ DIAGNSTICA DE LAS TINCIONES HEMATOXILINA-EOSINA, GIEMSA Y TRIPLE DE EL-ZIMAITY EN LA IDENTIFICACIN HISTOLGICA DE HELICOBACTER PYLORI EN BIOPSIAS GSTRICAS.
HOSPITAL CENTRAL DE LA FUERZA AREA DEL PER (HCFAP)
ABRIL - AGOSTO DE 1 999

AUTORES :
Bach. RODRIGUEZ ZAMORA, CHRISTIAN

Bach. ROMERO VALVERDE, CARLOS

INTRODUCCION

INTRODUCCION
La infeccin por Helicobacter pylori
(H. pylori) desempea un papel fundamental en el desarrollo de diversas enfermedades digestivas (gastritis, lcera pptica y cncer), por lo que su identificacin representa un tema relevante.

Antecedentes :
1893, Bizzozero 1906, Kreintz y col (cncer gstrico) 1938, Doenges 1940, Friedberg y Barrn (lcera gstrica) 1954, Palmer 1975, Steer y Colin Jones (coloracin gram) 1983, Warren y Marshall *

* Segundo International Workshop in Campylobacter infection

Helicobacter pylori
Aspectos generales:
Microorganismo gramnegativo , microaerfilo , ligeramente curvado y espirilar, mide de 0.5-1 um x 2.5- 4 um. Muy mvil (3 a 7 flagelos), con una notable capacidad de producir enzimas, en particular la ureasa (ms abundante). Reservorio natural: estomago humano. Mecanismos de transmisin posible: oral-oral (poco frecuente) y fecal oral (va principal)

 En la actualidad, se sabe que ms de la mitad de la poblacin mundial est infectada con este microorganismo.

En nuestro medio se ha reportado que el 50% de los nios de bajo nivel socio econmico y al menos el 75% de adultos estn infectados con esta bacteria.
Los mtodos diagnsticos de la infeccin por H.pylori se dividen tradicionalmente en invasivos y no invasivos. Los primeros se basan en la demostracin directa del microorganismo mediante el estudio de muestras obtenidas por biopsia gstrica. Son, por tanto, tcnicas que

DISTRIBUCION A NIVEL MUNDIAL

precisan una endoscopia y, por ello , resultan agresivas para el paciente. Los mtodos indirectos se basan en el estudio y la deteccin de ciertas caractersticas de la bacteria (test de aliento, serologa y tcnicas de biologa molecular).

Histologa
La histologa es un mtodo invasivo importante que tiene la gran ventaja frente a los dems mtodos de proporcionar simultneamente informacin precisa sobre sobre los cambios morfolgicos de la mucosa gstrica y en la identificacin de H. pylori. Para ello se utilizan tcnicas de tincin, unas son simples y por lo tanto fciles de realizar y otras son ms complejos . Ninguna de las tinciones es especfica para H. pylori, pero si permiten identificarlo reconociendo sus caractersticas y localizacin.

Warthin Starry
Disponible desde 1920 para la coloracin de espiroquetas en secciones histollgicas. Esta tcnica se basa en la impregnacin de las sales de plata (AgNO3) en un pH cido, y su posterior revelado sobre la superficie de la bacteria, que resultan ms engrosados y de negro. Es una tcnica muy buena para visualizar H. pylori, pero es relativamente complicada de realizar, es laboriosa y tiene un elevado costo por el tipo de reactivos utilizados.

Giemsa
Es til para la demostracin de muchos microorganismos patgenos, no solamente en los frotis, sino tambin en los cortes de tejido. Esta tincin especial emplea como colorante fundamental una mezcla de derivados tiacnicos catinicos (Azur A, Azur B y azul de metileno) y de eosina colorante de carcter aninico . Se basa en la disociacin de la sales de eosinato, donde la eosina es liberada y colorea estructuras acidfilas (citoplasma) y los derivados del azur colorean las estructuras de carcter basfilo como por ejemplo el RNA y DNA presentes en protoplasma de la bacteria (H.pylori) ,visualizndose de color azul.

Hematoxilina-eosina
Es la tcnica ms utilizada para el diagnstico de las muestras includas en parafina. Consta de una fase inicial en el que se colorean los ncleos celulares con la hematoxilina y una fase ulterior de contraste citoplasmtico y de los componentes extracelulares con la eosina. Con esta tincin H. pylori es ligeramente basfilo. Su principal ventaja consiste en que permite el diagnstico y la graduacin de la lesin histolgica asociada. Adems es una tcnica fcil de realizar y que no aade costos y tiempo al procesamiento habitual de las biopsias gstricas.

Triple de EL-Zimaity
Desarrollada por El-Zimaity y cols. En 1998. Es una tcnica de tincin triple , basada en la utilizacin de la Carbol fucsina, alcian blue y H-E. La coloracin bacteriana con carbol-fucsina requiere un paso previo de oxidacin con perxido de hidrgeno, formando grupos aldehidos con los carbohidratos de la pared bacteriana, los que forman bases de Schiff con las aminas terciarias del colorante. El alcian blue de pH 2.5 permite colorear mucopolisacaridos cidos sulfatados presentes en el mucus de una metaplasia intestinal a nivel gstrico.

 La tincin de H-E, nos permite realizar una descripcin histolgica de la morfologa gstrica.

Se han propuesto otras muchas tcnicas con diferentes resultados , como la tincin de Brown-Hops, Diff Quick, Waysson, entre otras.
Constituyndose en un constante reto para el profesional del laboratorio de procedimientos histolgicos (histotecnlogo) la validacin de las tcnicas especiales de coloracin, existentes y disponibles para escoger entre las ms convenientes dentro de los criterios costo beneficio.

Objetivo
Determinar la validez diagnstica (sensibilidad, especificidad y valores predictivos positivos y negativos) de las tinciones Hematoxilina-eosina, Giemsa y Triple de EL-Zimaity en la identificacin de H.pylori en biopsias gstricas, comparndolas con la tincin de plata de Warthin Starry como prueba de oro.

MATERIAL Y METODOS

DISEO DE INVESTIGACION:
Estudio retroprospectivo , transversal y analitico .

POBLACION:
Biopsias gstricas includas en parafina (tacos), de 133 casos previamente evaluados con H-E, obtenidos del archivo de patologa del Hospital Central FAP, entre Abril y Agosto de 1 999.

CRITERIOS DE INCLUSION:
Biopsias gstricas con diagnstico histopatolgico e identificacin de H. pylori. Biopsias gstricas con datos de edad y sexo.

CRITERIOS DE EXCLUSION:
Casos con dos o ms inclusiones de biopsia gstrica. Biopsias gstricas mal procesadas(respecto a la fijacin) Inclusiones con escasa cantidad de tejido.

PROCEDIMIENTO OPERATIVO :
Recoleccin Coloracin

Codificacin al azahar
Lectura

RECOLECCIN:
Se seleccionaron consecutivamente 133 biopsias gstricas includas en parafina, de las cuales se obtuvieron secciones histolgicas seriadas de 3 um. , para cada una de las tinciones (Giemsa, Triple de ElZimaity y Warthin Starry) y se rotularon con el cdigo de rutina respectivo

COLORACION:
Se ensayaron previamente cada uno de los protocolos de tincin con lminas positivas a H. pylori (estandarizacin) establecindose los tiempos adecuados de tincin y en algunos casos la proporcin de reactivos a emplear.

PROCEDIMIENTOS DE TINCIN
GIEMSA
1. Desparafinar los cortes en xilol por 5

2. Hidratar desde alcohol absoluto (5), alcohol corriente(5 c/u) hasta agua destilada.
3. Cubrir con la solucin de trabajo de Giemsa por 15. 4. Enjuagar en agua destilada 5. Diferenciar en cido actico 1o/oo y enjuagar inmediatamente en agua destilada*. 6. Deshidratar a medio ambiente o en estufa a 60 oC.

7. Sumergir en xilol y montar en blsamo de Canad.

* Estandarizacin: No se utiliz por que decolora a la bacteria.

TRIPLE DE EL-ZIMAITY
(Carbl fucsina/Alcian blue/Hematoxilina-eosina)
1. Desparafinar e hidratar en agua destilada . 2. Oxidar con perxido de hidrgeno al 15% por 30. 3. Lavar en agua corriente y luego colorear con Carbl fucsina recien preparada por 2. 4. Lavar en agua corriente por 2. 5. Colorear con Alcian blue al 3% en cido actico pH 2.5 ; por 3. 6. Lavar en agua corriente. 7. Teir con hematoxilina de Gills por 5.*

8. Lavar en agua corriente

9. Lavar en agua amoniacal 0.25%.

10. Teir con eosina por 3. 11. Lavar en agua corriente 12. Deshidratar con alcohol absoluto, aclarar en xilol y luego montar.

*Estandarizacin:
En el paso 2, de la tcnica original se utiliz perxido de hidrgeno al 30% . En el paso 3, llevamos a 3 el tiempo de coloracin En el paso 5, la solucin Alcian blue se le midi el pH con papel indicador y el tiempo de coloracin fue de 2. En el paso 7, se utiliz Hematoxilina de Harris, obtenindose similares resultados . En el paso 9, se utiliz agua carbonatada al 1%.

WARTHIN STARRY
1 Desparafinar en xilol e hidratar hasta agua destilada. 2. Lavar en solucin tampn.

3. Impregnar en solucin de plata al 1% (recien preparada) durante 1 h. a 60 oC.

4. Desarrollar (revelar) las secciones en solucin de trabajo por 3 a 60 oC.* 5. Lavar en solucin tampn.* 6. Deshidratar, aclarar y montar * Estandarizacin:

En el paso 4, el tiempo de revelado se redujo a la mitad.

En el paso 5, se utiliz agua destilada a 37 oC.

CODIFICACION AL AZAHAR.
Las lminas teidas con Giemsa y Triple de El-Zimaity se codificaron al azahar con las letras A y B respectivamente, seguida por tres dgitos entre 001 y 133. Las lminas teidas con Warthin Starry mantuvieron sus cdigos con los que fueron originalmente rotuladas. LECTURA. Las lmionas teidas con Giemsa, Triple de El - Zimaity y Warthin Starry fueron ledas en ese orden por un mdico patlogo (lectura a ciegas) . La lectura microcpica se realiz a 100 y 400 aumentos, reportndose la presencia de sta bacteria como H. pylori positivo (Hp +) y su ausencia, como H. pylori negativo (Hp-).

ANALISIS ESTADISTICO
PRUEBA DE ORO PRESENTE + TEST
a (verdadero +) c (falso -) a+c

AUSENTE
b (falso +)

d (verdadero b+ d

-)

S : a / a+c E : d / b +d

VPP : a / a + b VPN : d / d+ c

RESULTADOS

TABLA 2 : PORCENTAJE DE CASOS CASOS POSITIVOS IDENTIFICADOS CON LAS CUATRO TINCIONES HISTOLOGICAS. HCFAP ABRIL-AGOSTO 1999.
TINCION HISTOLOGICA WARTHIN STARRY GIEMSA TRIPLE DE ELZIMAITY HEMATOXILINA EOSINA POSITIVOS (CASOS) 95 93 77 67 PORCENTAJE (%) 71.43 69.92 57.89 50.38

GRAFICO N1 : NUMERO DE CASOS POSITIVOS Y NEGATIVOS A H. PYLORI SEGN LAS CUATRO TINCIONES HISTOLOGICAS. HCFAP. ABRIL-AGOSTO DE 1999.
100 50
0
95

93
77

N DE CASOS

67

56 38 40

66

Warthin Starry

Giemsa

Triple de ELZimaity

Hematoxilina Eosina

TINCIONES HISTOLOGICAS

Positivo

Negativo

GRAFICO N 2: PORCENTAJE DE CASOS POSITIVOS Y NEGATIVOS A H. PYLORI SEGUN LA TINCION DE WARTHIN STARRY. HCFAP. ABRIL-AGOSTO 1999

71.43% (n=95)

28.57% (n=38)
Casos positivos Casos negativos

GRAFICO N 3 : PORCENTAJE DE CASOS POSITIVOS Y NEGATIVOS A H. PYLORI SEGN LA TINCION GIEMSA. HCFAP ABRIL-AGOSTO 1999

30.08% (n=40)

69.92% (n=93)

Casos positivos

Casos negativos

GRAFICO N 4: PORCENTAJE DE CASOS POSITIVOS Y NEGATIVOS A H. PYLORI SEGN LA TINCIN TRIPLE DE EL-ZIMAITY. HCFAP. ABRIL-AGOSTO 1999.

42.11% 57.89%

Casos positivos

Casos negativos

GRAFICO N 5: PORCENTAJE DE CASOS POSITIVOS Y NEGATIVOS A H. PYLORI SEGN LA TINCIN DE HEMATOXILINA -EOSINA. HCFAP ABRIL-AGOSTO 1999

49.62%

50.38%

Casos positivos

Casos negativos

TABLA 3 : VALIDEZ DIAGNOSTICA DE LAS TINCIONES HISTOLOGICAS EN ESTUDIO. HCFAP ABRIL-AGOSTO 1999
VALIDEZ DIAGNOSTICA S(%) 97.89 96.84 81.0 68.42 E (%) 100% 97.36 97.36 94.73 VPP(%) 100 98.92 98.71 97.10 VPN (%) 95 92.5 67.27 54.54

TINCION HISTOLOGICA WARTHIN STARRY GIEMSA TRIPLE DE EL ZIMAITY HEMATOXILIN A EOSINA

GRAFICO N 6: NUMERO DE CASOS POSITIVOS Y NEGATIVOS A H. PYLORI EN LAS PATOLOGIAS GASTRICAS HALLADAS. HCFAP ABRIL-AGOSTO 1999.
50

50
N DE CASOS

41

40
30
22 16

20
10 0
GC

1
GCA GCAtf

1
MI

1
ACG

1
TC

DIAGNOSTICO HISTOPATOLOGICO

POSITIVO

NEGATIVO

GRAFICO N 7: PORCENTAJE DE LAS PATOLOGIAS GASTRICAS POSITIVAS A H. PYLORI. HCFAP ABRIL-AGOSTO 1999.

GASTRITIS CRONICA ACTIVA 53%

GASTRITIS CRONICA 43% TUMOR CARCINOIDE 1% ADENOCARCINOMA GASTRICO 1%

GASTRITIS CRONICA ATROFICA 1% METAPLASIA INTESTINAL 1%

ANEXO 14: DISTRIBUCIN ETAREA DE LOS CASOS POSITIVOS A INFECCIN POR H. PYLORI. HCFAP ABRILAGOSTO 1999.

20
N DE CASOS

18
16

17 14

15
10

14 12

5 0

(10-19)

(20-29)

(30-39)

(40-49)

(50-59)

(60-69)

(70-79)

(80-89)

EDAD

DISCUSION

WARTHIN STARRY
VALIDEZ DIAGNOSTICA :
SENSIBILIDAD ESPECIFICIDAD VALOR PRED. POSITIVO VALOR PRED. NEGATIVO 97.89 % 100 % 100 % 95 %

WARTHIN STARRY
V A L ID E Z D IA G N O S T IC A E S T U D IO S D E R E F E R E N C IA KO LTS B E Y COL (E E U U , 1 9 9 3 ) MONTGOMERY EA Y COL (E E U U , 1 9 8 8 ) CUT LER AF Y COL (E E U U , 1 9 9 5 ) N UESTRO S % E % VPP % VPN % PRU EB A D E ORO

9 5 .7

9 3 .6

H IS T O L O G I A (W -S )

96

100

C U L T IV O

9 3 .1 9 7 .8 9

99 100

9 9 .4 100

8 8 .7 95

CONCOR. DE TEST H IS T O L O G I A (W -S )

GIEMSA
VALIDEZ DIAGNOSTICA :
SENSIBILIDAD ESPECIFICIDAD VALOR PRED. POSITIVO VALOR PRED. NEGATIVO 96.84 % 97.36 % 98.92 % 92.5 %

GIEMSA
V A L ID E Z D IA G N O S T IC A E S T U D IO S D E R E F E R E N C IA S A L IN A S MENDEZ (P E R U , 2 0 0 0 ) T H IJ S J C Y COL (E E U U , 1 9 9 6 ) KASSA T SEG A Y G EBR E (K E N Y A , 1 9 9 6 ) N UESTRO S % E % VPP % VPN % PRU EB A D E ORO

9 8 .5 3

100

9 8 .5 3

8 7 .5

H IS T O L O G I A (G IE M S A ) CONCOR. DE TEST C U L T IV O H IS T O L O G I A (W -S )

96 100

9 8 .8 97

9 9 .2 99

9 4 .5 100 9 2 .5

9 6 .8 4 9 7 .3 6 9 8 .9 2

TRIPLE DE EL-ZIMAITY
VALIDEZ DIAGNOSTICA:
SENSIBILIDAD ESPECIFICIDAD VALOR PRED. POSITIVO VALOR PRED. NEGATIVO 81.0 % 97.36 % 98.71 % 67.27 %

EL - ZIMAITY
EL-ZIMAITY y COL (EE UU 1998); refieren una sensibilidad de 91%; especificidad de 100% y valores predictivos positivo y negativo del 100 y 85.7 %, comparndolo con los test de ureasa y cultivo (GOLD STANDARD).

HEMATOXILINA - EOSINA
VALIDEZ DIAGNOSTICA :
SENSIBILIDAD ESPECIFICIDAD VALOR PRED. POSITIVO VALOR PRED. NEGATIVO 68.42 % 94.73 % 97.1 % 54.54 %

HEMATOXILINA - EOSINA
E S T U D IO S D E R E F E R E N C IA FALLO N E CO L (C A N A D A 1 9 9 7 ) MONTGOMERY EA Y COL (E E U U , 1 9 8 8 ) S A L IN A S MENDEZ (P E R U , 2 0 0 0 ) N UESTRO V A L ID E Z D IA G N O S T IC A S % E % VPP % VPN % PRU EB A D E ORO C U L T IV O

93 67

87 100

C U L T IV O H IS T O L O G I A (G IE M S A ) H IS T O L O G I A (W -S )

9 0 .4 4 7 8 .5 7 9 7 .6 2 4 5 .8 5 6 8 .4 2 9 4 .7 3 9 7 .1 5 4 .5 4

CONCLUSIONES

CONCLUSIONES:
La tincin de Warthin Starry es una tcnica relativamente laboriosa, que nos proporcion una excelente visualizacin del microrganismo en el mucus gstrico, lo cual sumado a su validez diagnstica (S: 97.89%; E: 100%; VPP: 100% y VPN: 95%), justifica su empleo como prueba de oro en el diagnstico de H. pylori en biopsias gstricas. La tincin de Giemsa reprenta una tcnica simple y facil de realizar, cuya validez diagnstica (S: 96.84%; E: 97.36%; VPP:98.92% y VPN:92.5%). comparable a la de Warthin Starry, hacen de sta tcnica una alternativa confiable para identificar H. pylori en biopsias gstricas.

 La tincin Triple de El-Zimaity , segn los resultados obtenidos en ste estudio, es bastante especfica (97.36%), pero no muy sensible (81%), lo cual le resta utilidad como posible tincin especial para la identificacin de H. pylori.
La tincin de H-E, en este estudio, mostr una sensibilidad y valor predictivo negativo muy bajos (S: 68.9% y VPN: 54.54%) con respecto a las otras tinciones. Por lo tanto, tendra na validez diagnstica baja en la identificacin de H. pylori. La infeccin por H.pylori diagnsticada por el mtodo de tincin histolgica (W-S) presenta una alta frecuencia (71.43%) en la poblacin estudiada, siendo la primera dcada de vida (10-19) la ms afectada de todas.

 La presencia de H.pylori tuvo como patologa ms frecuente a la gastritis crnica con 96.80% del total de casos positivos, hallazgo histolgico al que etiolgica y epidemiolgicamente se asocia.

RECOMENDACIONES

RECOMENDACIONES:
1. Para el mtodo de tincin de Warthin Starry, sugerimos que los reactivos sean recien preparados. El tampn acetato de sodio-cido actico,puede prepararse con das de anticipacin, y almacenarse en refrigeracin a 4 oC. Otra pauta importante, es la de evitar la sequedad de la lmina entre la impregnacin y el revelado, ya que puede causar precipitaciones que dificulten la identificacin de H. pylori en el tejido. 2. Con respecto al mtodo de tincin Giemsa, sugerimos no exponer las lminas previamente coloreadas a un exceso de lavado en agua corriente, ni a una deshidratacin en alcoholes, ya que el tejido

y a su vez la bacteria tienden a decolorarse. 3. Para el mtodo de tincin Triple de El-Zimaity, , sugerimos que se evite su paso por el agua acidulada (coloracin H-E) . 4. En presente trabajo empleamos Alcian blue alcohol soluble cuya desventaja fue el decolorar el tejido y a su vez la bacteria, por lo tanto sugerimos el empleo de Alcian blue soluble en agua. 5. Para la lectura deberan emplearse los objetivos de inmersin (100 x) para confirmar aquellos casos en que las bacterias sean difciles de identificar .

6. Dejamos abierta la posibilidad de utilizar en estudios posteriores, todas las biopsias gstricas de un mismo paciente, includas en parafina, con la finalidad de aumentar la probabilidad de encontrar H. pylori.