INSTITUTO TECNOLOGICO DE ACAPULCO

PRACTICAS DE LABORATORIO

Carrera:
Ingeniería bioquímica

Asignatura:
Microbiología General

Profesor:
M. C. Díaz Alday Miguel Ángel

Diseño experimental:
Tinciones

Grupo:
A

Alumno:
Cuevas Linares Neftalí

Número de control:
14320542
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PRACTICAS DE LABORATORIO

INVESTIGACIÓN
La tinción es una técnica mediante el cual las moléculas de un colorante se
adhieren a una superficie, lo cual mejora el contraste en la imagen vista al
microscopio.
Dado que las bacterias son casi incoloras, no presentan contraste con el medio en
el cual se encuentran suspendidas y no pueden observarse claramente sin algún
tratamiento previo. De acuerdo a la reacción que ocurre, existen diferentes tipos
de tinción:
 Simple: el colorante utilizado sirve solo para denotar la morfología celular.
 Diferencial: el colorante utilizado pone de manifiesto diferencias entre
células bacterianas o entre partes de una misma célula, estas técnicas
utilizan más de un colorante o bien ciertos reactivos complementarios para
la tinción. Las dos tinciones más importantes que se aplican en
bacteriología son la Gram y la Ziehl- Neelsen
 Selectivas: Son aquéllas que permiten observar un organelo celular
determinado, porque el colorante se combina selectivamente con él; en
algunos casos, se requieren mordentes, agentes acidificantes o
precipitantes para lograr la combinación específica colorante-organelo,
también suelen usarse colorantes de contraste para distinguir el resto de la
célula.

Los colorantes más usados son: azul de metileno, cristal violeta, safranina, estos
son catiónicos y se combinan fuertemente con componentes celulares cargados
negativamente, como los ácidos nucleicos y los polisacáridos ácidos.
Las células generalmente son tratadas para coagular el protoplasma antes de
teñirlas, proceso conocido como fijación. Después de esta habitualmente se
realiza la tinción. La fijación produce generalmente encogimiento de las células, la
tinción por el contrario, hace que las células parezcan mayores de lo que son
realmente.

Algunos colorantes teñirán mejor solo después de que la célula haya sido tratada
con otra sustancia química, que no es un colorante por sí mismo. El mordiente
(sustancia química que sirve para fijar el color) se combina con un constituyente
celular y lo altera de manera que ahora sí podrá atacar el colorante.

Los métodos de tinciones se utilizan ya sea en forma directa con las muestras del
paciente o se aplican a los preparados a partir del desarrollo de los
microorganismos en cultivos.
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Tinción de Gram

Fue desarrollada hacia 1884 por el danés Christian Gram, posteriormente se

determinó que se basa en la composición de la pared celular y la presencia en uno
de los grupos de bacterias de una membrana externa (adicional a la membrana
citoplasmática).

USO
Separar las especies bacterianas en dos grupos grandes, Gram-positivas o Gram-
negativas

PRINCIPIO
Consiste en aplicar 4 reactivos, el cristal es el primer reactivo de la serie de Gram;
éste imparte color a todos los microorganismos del frotis; el segundo reactivo es
una solución de yodo denominada yodo de Gram o lugol, ésta actúa como
mordente (aumenta o refuerza la unión entre el colorante primario y el sustrato), el
tercer reactivo es el alcohol-acetona, actúa como decolorante disolviendo y
arrastrando fuera de las células el colorante primario. Sin embargo las bacterias
Gram-positivas cuya pared es relativamente gruesa con un mayor contenido de
peptidoglicano y con numerosos enlaces transversales peptídicos entre las
cadenas del polisacárido no pierden el complejo cristal
violeta-yodo, pues la pared al deshidratarse reduce
únicamente su permeabilidad con el decolorante y aún
queda con un grosor suficiente para evitar la difusión o
salida del complejo. En cambio, las bacterias Gram-
negativas cuya pared es más delgada y contienen poco
peptidoglicano con pocos enlaces transversales, se
deshidrata adelgazando aún más la pared. Además de la
deshidratación que sufre la pared celular, en las bacterias
Gram-negativas, el alcohol-acetona disuelve los
abundantes lípidos que conforman la bicapa lipídica de la
membrana externa.

Con ambos efectos los poros se abren y se facilita la salida del complejo cristal-
violeta yodo y la decoloración de este tipo de bacterias, por lo que se tornan
translúcidas y reaccionan con el último colorante de la tinción de Gram, la
safranina siendo el colorante de contraste. Las bacterias que retienen el colorante
primario a lo largo de todo el proceso son llamadas Gram-positivas, éstas se ven
teñidas de morado, el segundo grupo de bacterias pierden el colorante primario
después de la decoloración y se tiñen con el colorante de contraste y se
denominan Gram-negativas, éstas se tiñen de rojo.
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Tinción acido-alcohol resistentes (Ziehl- Neelsen)

USO
Detección de bacterias cuyas paredes celulares contienen ácidos grasos de
cadenas largas (micólicos), como la mycobacterium tuberculosis, Nocardia sp.

PRINCIPIO
Los ácidos micólicos permiten que las células
resistan la decoloración, incluso con el decolorante
ácido-alcohol. En consecuencia, estas bacterias se
denominan ácido-alcohol resistentes. Las bacterias
que carecen de pared celular con alto contenido de
ácidos micólicos no pueden resistir la decoloración
con ácido-alcohol se clasifican como no ácido-
alcohol resistentes.

Tinción de Wirtz-Conklin

USO
Detección de género bacterianos que en su interior producen formas de
resistencias denominadas endoesporas.

PRINCIPIO
Por la composición de la cubierta externa, es muy
difícil penetren para teñir la espora, por eso en las
tinciones simples suelen verse como cuerpos
incoloros o refráctiles dentro de las bacterias. Para
teñirlas es necesario emplear métodos muy
drásticos y similares a los empleados en la tinción
de ácido-resistentes. En la tinción de endospora se
tiñe en caliente con verde de malaquita, una vez
que la espora ha tomado este colorante no se
puede decolorar ni siquiera con un colorante de
contraste que permite distinguir a la espora de la célula vegetativa.

Tinción Negativa

USO
Detección de células levaduriformes capsuladas

PRINCIPIO
Los polisacáridos capsulares rechazan la tinta china
y la cápsula aparece como un halo claro alrededor
de los microorganismos. Este organelo es una
cubierta extracelular constituida por polisacáridos,
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generalmente dextranas, alginatos o glicopéptidos que se acumulan alrededor de

la célula; su composición depende de la especie y de la composición del medio de
cultivo. La cápsula puede llegar a medir varias veces el diámetro del
microorganismo; el desarrollo de microorganismos capsulados en medios líquidos
produce viscosidad como sucede en el pulque y alimentos deteriorados por
microorganismos capsulados

Bibliografía
“Biología de los miroorganismos”
T. Madigan Michael, M. Martinko John, Jack Parker: Pearson Prentice Hall: 2004
“Diagnóstico microbiológico”
Forbes Betty A., Sahm Daniel F., Weissfeld S.: Ed. Panamericana: 2004
http://microbiologia3bequipo5.blogspot.mx/2014/10/metodos-y-tecnicas-de-
tincion.html
http://www.academia.edu/19526827/Pra_ctica_4_Tinciones_diferenciales_y_select
ivas
http://www.microinmuno.qb.fcen.uba.ar/SeminarioTinciones.htm

PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA

Los microorganismos en esencia son transparentes, debido a sus dimensiones
microscópicas y su elevado contenido de agua, no pueden detectarse con facilidad
entre los materiales y detritos del fondo en las muestras del paciente. La falta de
contraste es un problema para el examen microscópico de los microorganismos.

HIPÓTESIS
El contraste se puede lograr mediante técnicas de coloración que resaltan los
microorganismos y les permiten diferenciarse entre sí y de los materiales del
fondo.

PROCEDIMIENTO
Materiales:

 Mechero de bunsen
 Portaobjetos
 cubreobjetos
 Pinzas de madera
 Cerillos o encendedor
 Asa bacteriológica
 Microscopio óptico
 Agua destilada
 Muestra de gargajo
 Muestra de excremento de bebé
 Muestra excremento de vaca
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Fijación

1.- Encender el
mechero de bunsen

2.-Colocar una gota de solución

salina fisiológica sobre el
portaobjetos

3.-Flamear asa a rojo vivo

para esterilizar

4.-Tomar muestra y
extender sobre la gota de
ssf

5.-Esterilizar asa
nuevamente

6.-Secar al aire o con

el mechero

7.-Fijar muestra sobre la

base de la llama pasando
sobre la misma 3 o 4
veces
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Tinción de Gram

1.- Realizar el procedimiento

de fijación

2.- Teñir con violeta de cristal

durante un minuto y enjuagar
con agua

3.-Utilizar el lugol como

mordiente, dejar actuar
durante un minuto y enjuagar
con agua destilada

4.- Decolorar con solucion de

alcohol-acetona entre 10 y 15
segundos y enjuagar

5.-Teñir con safranina

durante un minuto como
colorante de contraste y
enjuagar con agua destilada

6.-Secar la muestra al aire

7.-Añadir una gota de aceite

de inmersion y observar al
microscopio.

Nota: para enjuagar se debe tener en cuenta que el chorro de agua no caiga
directamente sobre la muestra, esta debe caer desde la parte superior del porta
objetos poniéndolo en posición inclinada.
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Tinción de Ziehl-Neelsen

1.-Realizar el
procedimiento de fijación

2.-añadir fucsina sobre la

muestra

3.-Aplicar calor a la muestra

con fucsina durante 10
minutos y escurrir.

4.-Agregar la solución Acido-

alcohol para descolorar durante
20 segundos y enjuagar con
agua

5.-aplicar azul de metileno

durante 1 minuto y
enjuagar con agua

6.- Secar portaobjeto al aire

7.-Añadir una gota de

aceite de inmersión y
observar en microscopio
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Tinción de Wirtz-Conklin (verde malaquita)

1.-Realizar el
procedimiento de
fijación

2.-Añadir el verde
malaquita a la muestra

3.-Aplicar calor durante

10 minutos y enjuagar
con agua

4.-Teñir con safranina

durante 1 minuto y
enjuagar

5.-Secar al aire

6.-Agregar una gota de

aceite de inmersión y
observar en
microscopio
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Tinción Negativa

1.-colocar una gota de

agua

2.-Esterilizar el asa

3.-Agregar una gota

de tinta china

4.-Esterilizar el asa y
la boca del tubo
donde se encuentra la
muestra

5.-Colocar una gota

de la muestra y
mezclar hasta
homogneizar

6.-colocar cubre
objeto y observar en
el microscopio