“AÑO DEL BICENTENARIO DEL PERÚ: 200 AÑOS DE INDEPENDENCIA”

Universidad Nacional de Piura

Facultad de Ingeniería Industrial
Escuela Profesional de Ingeniería Agroindustrial e Industrias Alimentarias

INFORME PRÁCTICA: 2DO TALLER VIRTUAL

COLORACIONES Y CARACTERÍSTICAS MORFOLÓGICAS
DE LAS BACTERIAS COMUNES
Microbiología General

Harold Robert Valle Campoverde – CU 0522015019

Fátima Anthonelly Castillo Zapata - CU 0522014015
Maria Teresa Sosa Echevarria – CU 0522013048
Pool Jefry Piedra Ruiz – CU 05220019059

Encargado de la materia
María Dorothy Torres de León

Piura – Perú
Enero de 2021
 INTRODUCCIÓN

Una de las características más importante de las bacterias es su morfología, definida por el
tamaño, la forma, el arreglo y la estructura. Existen bacterias en forma redondeada
denominadas cocos, en forma cilíndrica, denominadas bacilos y una tercera morfología
como son las que tienen forma de espirales, denominadas espirilos. A su vez cada categoría
puede subclasificarse con base a diferentes arreglos.

Estas características pueden determinarse examinando muestras al microscopio. Las

células no teñidas son prácticamente transparentes, pero pueden observarse al
microscopio de luz haciendo preparaciones entre lámina y laminilla o con microscopios
especiales como, por ejemplo: de contraste de fases o de campo oscuro.

Cuando se dispone de un microscopio de luz, se pueden teñir las bacterias para facilitar su
visualización. Si se tiñe una muestra del cultivo extendida y fijada en una lámina portaobjeto
con un colorante dado, las células adquirirán el color del colorante añadido y podrá
observarse la forma, tamaño y el arreglo de las mismas. Este tipo de coloración se conoce
con el nombre de coloración simple.
 OBJETIVOS

GENERAL:

• Realizar diferentes técnicas de tinción para la visualización de estructuras celulares

de bacterias.

ESPECÍFICO:

• Adquirir destreza en el montaje y observación de preparados microbiológicos

empleando técnicas de tinción simple y diferencial.

• Comprender los principios teóricos en los cuales se basan las técnicas de tinción
en microbiología.

• Comprender la importancia De las Buenas Prácticas de Laboratorio y aplicación

de normas de bioseguridad en el laboratorio de microbiología.
 MARCOTEÓRICO

COLORACIÓN

GENERALIDADES

Debido a la naturaleza química de la célula bacteriana, su afinidad por los colorantes, su propiedad
ha sido aprovechada para estudiar los diferentes tipos morfológicos y estructuras (capsulas,
esporas, flagelos, etc.) que ayudan a la identificación de una especie o grupo en partículas. Los
colorantes de mayor aplicación son: cristal violeta, violeta de genciana, fucsina básica, safranina,
azul de metileno y verde de malaquita. Actúan mejor mediante la adición de mordientes, porque
aumentan la permeabilidad de la pared celular y membrana citoplasmática.

• Tinción de Gram o coloración Gram:

Es un tipo de tinción diferencial empleado en microbiología para la visualización de bacterias, que
desarrolló la técnica para poder referirse a la morfología celular bacteriana como para poder realizar
una primera aproximación a la diferenciación bacteriana, considerándose Bacteria Gram positiva a
las bacterias que se visualizan de color violeta y Bacteria Gram negativa a las que se visualizan de
color rosa.

• ¿Qué es una coloración Gram, y para qué sirve?:

Se usa para diferenciar características de la bacteria el colorante (es un color violeta casi azul),
entonces esas son GRAM +. Hay otras bacterias que no tienen casi pared celular (es muy pobre),
y en virtud de eso, no retienen el colorante (y son de color rosadito), entonces esas son GRAM.
Fundamentos de diferenciación de Gram positivo y Gran negativo:
Los fundamentos de la técnica se basan en las diferencias entre las paredes celulares de las
bacterias Gram positivas y Gram negativas. Por el contrario, la capa de peptidoglucano de las Gram
negativas es delgada, y se encuentra unida a una segunda membrana plasmática exterior

• Bacteria Gram negativa:

Las bacterias Gram negativas, aquellas bacterias que no se tiñen de azul oscuro o violeta por la
tinción de Gram, y lo hacen de un color rosado tenue: de ahí el nombre de "Gram-negativas" o
también "gramnegativos”.
Bacteria Gram-negativa. 1-membrana citoplasmática (membrana interna), 2-espacio
periplasmático, 3-membrana externa, 4-fosfolípidos, 5-peptidoglicano, 6-lipoproteína, 7-proteínas,
8-lipopolisacáridos, 9-porinas.

• Bacterias Gram positivas y Gram negativas

Otro sistema de clasificación de las bacterias utiliza las diferencias en la composición de su pared
celular. El empleo de una técnica llamada tinción de Gram pone de relieve estas diferencias
identificando las bacterias como Gram positivas y Gram negativas. Tras la tinción, las bacterias
Gram positivas retienen el tinte y se colorean de violeta, mientras que las bacterias Gram negativas
liberan el tinte y se tiñen de color rosado. Las especies

• Enterobacter (Enterobacterias)
Enterobacterias, nombre común de una familia de bacterias Gram negativas que reciben este
nombre porque suelen encontrarse en el intestino de los mamíferos. Las especies que poseen
flagelos son móviles; el resto, inmóviles.
 • Estreptococo
Bacteria Gram positiva de forma esférica. Los estreptococos aparecen en pares o cadenas, y
algunas especies son patógenas en los seres humanos. Las infecciones estreptocócicas
comprenden la faringitis, la escarlatina, erisipelas, fiebre puerperal y algunas neumonías.

TINCIÓN DE GRAM

Esta tinción desarrollada por el doctor Cristian Gram en 1884, es hoy la más utilizada en los
laboratorios de bacteriología y permite, de acuerdo con la estructura y grosor de la pared bacteriana,
agrupar las bacterias en gran positivas y en gran negativa. La gran positiva poseen una capa gruesa
de peptidoglucano y carecen de membrana externa, mientras que las gram negativas tienen una
capa más delgada de peptidoglucano y poseen una membrana externa.

Algunas bacterias se clasifican como gram variables, pues simultáneamente presentan tinción se
gram positivas y de gram negativas, aun bajo condiciones óptimas de cultivo. Sin embargo, en su
estructura estas bacterias poseen una pared de gran positivas, aunque la capa de peptidoglucano
es más delgada que la mayoría de las bacterias gran positivas.

Esta tinción además, correlaciona con otras propiedades como endotoxinas, susceptibilidad a
antibióticos, sensibilidades resistencia a sales biliares, punto isoeléctrico y tención superficial.

La tinción de gran involucra varios pasos:

✓ Tinción inicial: Las células con cristal violeta, el cual es el colorante primario. En este paso
todas las células se tiñen de morado.
✓ Mordente: Se adiciona yoduro (lugol) que reacciona con el cristal violeta y forma un
complejo cristal violeta – yoduro. En este punto toda la célula continúa de color morado.
✓ Decoloración: Se adiciona un solvente no polar, el cual actúa lavando el complejo cristal
violeta – yoduro de las células gran negativas. De manera las bacterias gran positivas
continúan moradas y las negativas quedan incoloras. Este es el paso critico de esta tinción,
pues si se exagera, decolora las gran positivas y si se hace muy débil no decolora a las
gram negativas.
✓ Contratincion: Se vuelve a teñir con safarina o fucsina, de manera que las bacterias gram
negativas, que habían sido decoloradas, se tiñen de rosado a fucsia según el colorante
empleado; en tanto, las bacterias gran positivas no se afectan con la contratincion y
permanecen moradas debido a lo intenso de esta coloración.
 ✓ Además de una excesiva decoloración, otro factor que puede influir en que las bacterias
gran positivas se observen parcial o completamente rosadas, es la edad del cultivo; las
células viejas tienden a perder su capacidad de retener el complejo cristal violeta – yoduro
y por lo tanto las bacterias se verán rosadas. Otro factor de variabilidad podría ser
condiciones de estrés durante el cultivo, que genera formas gran negativas no viables,

TINCIÓN SIMPLE

Esto es, utilizando solo un colorante. El valor de esta clase de tensión radica en su simplicidad y
facilidad de empleo. El frotis, previamente fijado, se cubre con un colorante durante el tiempo
adecuado, se lava el exceso de colorante con agua y se seca el portaobjetos, los colorantes básicos
como el cristal violeta, azul de metileno y carbolfucsina se emplean con frecuencia para determinar
el tamaño, la forma y la organización de las bacterias

Las tinciones más simples se realizan sobre preparaciones previamente secadas. Sobre un porta
con una suspensiones de microorganismos previamente secada y fijada, se derrama una pequeña
cantidad de una solución diluida del colorante y se mantiene el contacto durante uno o dos minutos;
a continuación se lava variaras veces con agua y se seca. Este tipo de preparación suele
observarse con un objetivo de 100X y aceite de inmersión.

TINCIONES. - El microscopio de campo claro es más útil para la observación de especímenes

teñidos. Los colorantes son compuestos químicos utilizados para aumentar el contraste existen
algunos llamados:

✓ COLORANTES VITALES. -Que pueden añadirse directamente a una preparación en

fresco; por tanto, colorean células vivas. No obstante, la mayoría de colorantes son
efectivos después de que los microrganismos hayan sido fijados, es decir se encuentren
murtos y adheridos al portaobjetos. Para la fijación del calor se realiza una fina extensión
de una gota d muestra líquida en el portaobjetos y se deja secar al aire libre o sobre la llama
del mechero, el calor de la llama mata las células microbianas por des se utiliza la fijación
química, ya que es menos lesiva que el calor.

TIPOS DE COLORANTES. - Casi todos los colorantes son sales, compuestos formados por iones
cargados.

✓ LOS COLORANTES BÁSICOS. - Son aquellos en los cuales el agente que tiñe es el ion
cargado positivamente ya que estos son los más utilizados, ya que la mayor parte de células
microbianas poseen cargas débilmente negativas en la superficie lo cual facilita su unión.
Entré los colorantes más comunes se encuentran la safranina, la fucsina básica, el cristal
violeta y el azul de metileno.

✓ LOS COLORANTES ACIDOS. - El colorante es el ion cargado negativamente, estos

colorantes se unen a las partes de las células cargados positivamente. Sé utilizan para teñir
tejidos animales infectados con microrganismos. Entré los más frecuentes tenemos a la
eosina, la fucsina acida y el rojo Congo.

TIPOS DE TINCIONES:

✓ TINCIONES SIMPLES. -Se usa un único colorante, de tipo básico usado solo para
incrementar el contraste, mejorando la observación de la célula completa.
 ✓ TINCIONES DIFERENCIALES. -Se utilizan para distinguir entre tipos de microrganismos,
esta técnica primero se hace con una tinción simple seguido de una de contraste en donde
se usa otro colorante. Estas tinciones son muy usadas en microbiología por ej. La tinción
gran y la tinción de ácido-alcohol, ambas aplicadas a bacterias.

LA TECNICA DE TINCIONES GRAM. -

Desarrollado por el bacteriólogo Danés Cristian Gram en 1884, clasificando las bacterias en dos
grupos:

✓ GRAM POSITIVO. -La técnica incluye tinción primaria, decoloración y de contraste, se tiñe
el espécimen de cristal violeta añadiendo el mordiente, aplicando el agente decolorante
(acetona), en donde las bacterias retienen el colorante, añadiendo safranina
proporcionándolo un color violeta más intenso. Los bacilos y cocos gran positivos
formadores de endospora consta de siete géneros entre ellos Bacillus y Clostridium
ampliamente distribuidos y son de gran importancia clínica. Ambos son bacilos y algunas
especies son móviles por flagelos periticos. Todas las especies Clostridium son anaerobios
y de hábitat en el suelo. Todos los Bacillus realizan una respiración aeróbica y algunas
anaeróbicas facultativas capaces también de fermentar. Debido a su bajo contenido de
agua, las endosporas no teñidas son fácilmente visibles al microscopio.

✓ GRAM NEGATIVO. -Con esta misma técnica pierden su tinción violeta durante la
decoloración y se han teñido de rosa con el colorante en contraste. En su variedad se
encuentran helicoidales, vibroides, aerobias, microaerofilas todos los miembros crecen en
mejores concentraciones de oxígeno inferiores a la del aire. Este grupo comprende varios
organismos interesantes como el Campylobacter (agente causante de diarreas),
azospillirium (importantes para el mantenimiento de la fertilidad de los suelos tropicales)
viven en estrecha asociación con las raíces de las plantas. Este grupo incluye especies que
afecta en gran medida a la salud humana y a nuestro medio ambiente.

COLORACIÓN GRAM: La tinción de Gram o coloración de Gram es un tipo de tinción diferencial

empleado en microbiología para la visualización de bacterias, sobre todo en muestras clínicas. Se
utiliza tanto para poder referirse a la morfología celular bacteriana como para poder realizar una
primera aproximación a la diferenciación bacteriana, considerándose Bacteria Gram positiva a las
bacterias que se visualizan de color moradas y Bacteria Gram negativa a las que se visualizan de
color rosa o rojo o grosella.

CORPÚSCULOS METACROMATICOS: Estas inclusiones se tiñen de rojo con algunos colorantes

azules, como el azul de metileno y se conocen también como gránulos de volutina. Se trata de una
forma de reserva de fosfato inorgánico (poli fosfato) que puede utilizarse en la síntesis de ATP. La
volutina se forma generalmente en células que crecen en ambientes ricos en fosfatos. Los
corpúsculos metas cromáticas se encuentran en algas, hongos y protozoos, así como en bacterias.
Estos gránulos son bastante grandes y característicos en Corynebacierium diphtheriae, el agente
etiológico de la difteria, por lo que tienen valor diagnóstico.
 MATERIALES Y REACTIVOS

Materiales
Reactivos
 PROCEDIMIENTOS Y RESULTADOS

COLORACION GRAM

PROCEDIMIENTO:

1. Desinfectamos el área de trabajo (alcohol)

2. Esterilizamos los materiales (aza de siembra) con ayuda del

mechero.

3. Sacamos una pequeña porción de muestra de los tubos con cultivo

gram - positiva y gram - negativas.

4. Obtenida la muestra en el aza de siembra la colocamos en el

portaobjetos y realizamos el frotis y la fijación de los diferentes cultivos
de bacterias. Cada colorante que se utilizará será de una cantidad de
2 ó 3 gotas.

5. Luego de ello cubrimos con colorante (cristal violeta) la preparación,

dejándola actuar en un periodo de un minuto.

6. Lavamos cuidadosamente con agua destilada (eliminación del exceso

de colorante).
 7. Se cubre la preparación con colorante (lugol) por un minuto, con
el objetivo de aumentar la afinidad entre el colorante y las
células.

8. Utilizamos el agente decolorante (alcohol – acetona) lavando

con sumo cuidado dicha preparación dejando actuar por un
minuto.

9. En seguida echamos colorante de contraste (safarina). las

bacterias Gram - positivas se teñirán de color azul y las gran
negativas color rosa debido a este colorante.

10. Finalmente secamos la muestra al aire libre, le añadimos 2

gotas aceite de inmersión y observamos en el microscopio con
el objetivo de inmersión (100X).

RESULTADO:
TINCION SIMPLE

PROCEDIMIENTO:
1. Desinfectar nuestra área de trabajo.

2. Encender el mechero y esterilizar el asa de siembra.

3. Dejar enfriar el asa de siembra para tomar la muestra de

microorganismos, después acercar el tubo hacia la muestra
quitarle el tapón y flamear rápidamente la boca del tubo, introducir
el asa en el tubo y tomar cuidadosamente la muestra.

4. Hacer el frotis y secarlo y fijarlo.

5. Cubrir con colorante /azul de metileno/ la preparación y dejarlo
actuar durante 1 minuto.

6. Lavar suavemente con agua destilada para eliminar el exceso

de colorante.

7. Secar al aire y echar 2 gotas de aceite de inmersión.

8. Observar en el microscopio con el objetivo de 100X.

RESULTADOS:

✓ Lugo del montaje al microscopio óptimo. Observamos flagelos finos filamentos de

color rojo. Cuerpo bacteriano de color azul.

Bacillus subtilis
 CONCLUSIONES

COLORACION GRAM

Concluimos que en la práctica de laboratorio pudimos identificar que la morfología de las

bacterias (Escherichia coli, Saccharomyces, Bacillus, Estafilococos) y el tipo de tinción que
presenta. Las gram positivas poseen una gruesa capa de peptidoglucano la cual impide
que escape el complejo cristal violeta – lugol. Es por ello que tiñen un color azul (Escherichia
coli, saccharomyces), mientras que la capa peptidoglucano de las bacterias gram negativas
es delgada y se encuentra a una membrana externa lipídica susceptible a la decoloración
con alcohol acetona; estas bacterias teñirán de color rosa debido a la safarina (colorante
de contraste) (Bacillus, estafilococos).

TINCION SIMPLE

• Con esta práctica aprendimos a realizar adecuadamente la preparación correcta de

un frotis para poder realizar posteriormente las tensiones más utilizadas para el
laboratorio de microbiología que son indispensables para el correcto estudio de los
microorganismos.

• Así mismo mediante la realización de las tinciones logramos observar la forma y

agrupación y características de las bacterias.

• La tinción simple es una herramienta muy útil en el laboratorio de microbiología, así

como análisis clínicos siendo ineludible conocer su fundamento y procedimiento,
para poder tener una correcta interpretación de los datos que nos otorga la
diferenciación de Gram positiva y negativas concluimos que debido a la estructura
de sus paredes celulares tendrán o no propiedades patológicas diferentes.
 BIBLIOGRAFÍA

• PRESCOTT MICROBIOLOGÍA QUINTA EDICIÓN PÁG. 70

• http://docencia.izt.uam.mx/gra/bioquimica1pdfs/1-1_celulas_procariontes.pdf
• Beishir, L. “Microbiology in practice. A self-instructional laboratory course”.5ª Ed.
Harper Collins Pub. Inc., 1991.
• Case, C.L. y T.R. Johnson. “Laboratory experiments in Microbiology”. The
Benjamin/Cummings Publishing Company, Inc. 1984.
• Claus, GW. “Understanding microbes: A laboratory textbook for microbiology”. 1ª Ed.
W.H. Freeman and Co. New York, 1989.
• Collins, C.H. y P.M. Lyne. “Microbiological methods”. Butterworth & Co. (Pub) Ltd.,
1985.