UNIVERSIDAD NACIONAL DEL CALLAO

TINCIN GRAM

CURSO:

MICROBIOLOGA
PROFESOR:

Ing. Msc. SONIA HERRERA SANCHEZ

INTEGRANTES:
BENITES ZELAYA, Julio Csar 1426125471
GRADOS ARELLANO, Bruno Anghelo 1426125238
JARAMILLO GONZALES, Marissa Milagros 1426125191
PANTOJA MOCARRO, Joel David 1426125291

2017-A
 NDICE

INTRODUCCIN...3

I. OBJETIVOS 4

II. MARCO TERICO.5

III. MATERIALES Y REACTIVOS.....8

IV. PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL.....10

V. RESULTADOS Y CONCLUSIONES..12

VI. RECOMENDACIONES....13

VII. BIBLIOGRAFA....13

VIII. ANEXOS.14
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Facultad De Ingeniera Qumica.

INTRODUCCIN

La tincin de Gram o coloracin de Gram es un tipo de tincin

diferencial. Se utiliza tanto para poder referirse a la morfologa celular bacteriana como
para poder realizar una primera aproximacin a la diferenciacin bacteriana, conside-
rndose Bacteria Gram positiva a las bacterias que se visualizan de color moradas y
Bacteria Gram negativa a las que se visualizan de color rosa o rojo o grosella.

Los pasos a seguir para una buena coloracin son:

- La extensin.
- La fijacin.
- La coloracin o tincin.

En el laboratorio de microbiologa realizaremos las experiencias con muestras entrega-

das por la docente teniendo como objetivo principal identificarlas en base a la tincin
Gram.

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I. OBJETIVOS:

1. Realizar la tincin Gram de bacterias de coloracin de bacterianas.

2. Describir las caractersticas de las diferentes muestras analizadas.

3. Aprender a diferenciar entre una bacteria Gram positiva y Gram negativa.

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II. MARCO TERICO

La tincin Gram es uno de los procedimientos de tincin ms tiles en la identifica-
cin de microorganismos, ya que divide a stos en dos grandes grupos: Gram positi-
vos y Gram negativos.
En 1884, Hans Christian Gram, un Mdico dans que la-
boraba en Berln, accidentalmente descubri un mtodo
para teir y diferenciar bacterias. Empleaba cristal violeta
como colorante y una solucin yodada potsica como
mordente. Mientras examinaba preparaciones de tejido
pulmonar de pacientes que haban muerto por neumona,
descubri que el colorante era retenido por
algunas bacterias y otras permanecan incoloras despus
de lavar el frotis con etanol y agua. Clasific a las prime-
ras como Gram-positivas y Gram-negativas a las segundas.

Posteriormente Carl Weigert introdujo la modificacin por la cual se incorporaba

safranina como colorante de contraste al mtodo facilitando la diferenciacin entre
positivas (violeta) y negativas (rosa/naranja).

1. Un primer colorante bsico, generalmente cristal violeta, que se aplica sobre la

muestra y que reacciona con las clulas (cargadas negativamente), coloren-
dolas.

2. Un mordiente, que incrementa la afinidad entre el primer colorante y las clu-

las. Parece ser que el mordiente (solucin diluida de yodo) se combina con el
colorante, para formar un compuesto insoluble coloreado en el interior de la
clula.

3. Un agente decolorante, como el etanol de 95% o la mezcla alcohol acetona

(1:1), que son disolventes orgnicos capaces de eliminar el primer colorante
de algunas bacterias, decolorndolas.

4. Un colorante de contraste, igualmente de carcter bsico pero de distinto color

que el primer colorante. Generalmente se suele utilizar la safranina, de color
rosa, que contrasta con el color violeta del primer colorante, y que teir slo
a las bacterias decoloradas en el paso anterior. Los organismos que resisten
la decoloracin y retienen el complejo cristal violeta-yodo aparecern de
color violeta oscuro al microscopio y se denominan Gram positivos. Aque-
llos que pierden el color inicial del cristal violeta tras la decoloracin, se clasi-
fican como Gram negativos y toman el color rosa debido al segundo coloran-
te, la safranina.

Las diferencias qumicas en sus paredes celulares, son las que permiten o no la salida
del complejo cristal violeta-yodo. Las bacterias Gram positivas tienen una pared celu-
lar gruesa, compuesta principalmente por pptidoglicano, mientras que en Gram nega-
tivas, aunque la pared est tambin constituida por pptidoglicano, es ms delgada y
presenta adems una membrana externa con lipopolisacridos

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Las paredes de las bacterias Gram positivas tratadas con alcohol sufren una deshidrata-
cin y sus poros se contraen, dificultando la salida del complejo cristal
violeta-yodo. En las Gram negativas, el alcohol desorganiza la capa lipdica ms
externa y lava el colorante de la delgada capa de peptidoglicano. La tincin de Gram
es ms reproducible cuando se aplica a cultivos jvenes de bacterias, ya que las
bacterias Gram positivas, en la fase estacionaria de crecimiento, pueden
aparecer como Gram negativas.

Tenemos algunos ejemplos de bacterias Gram positivas y Gram negativas luego de

haber realizado la tincin.

Estafilococos Grampositivos Diplococos Gramnegativos

Estreptococos Gram positivos Cocobacilos Gramnegativos

Bacilos Grampositivos Espirilos

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Levaduras Espiroquetas

Diplococos Grampositivos Vibrios

Cpsula Esporas

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III. MATERIALES Y REACTIVOS

En esta sesin las experiencias se realizaron con los MATERIALES que se presentan a
continuacin:

Materiales Descripcin Imagen

Se usa para transportar, arrastrar,

Asa de trasvasar inculos (pequeo vo-
siembra lumen de microorganismos)
desde la solucin de trabajo
tambin llamada solucin madre
al medio de cultivo.

Es una lmina de vidrio rectan-

gular de color transparente la
Portaobjetos cual se utiliza para almacenar
muestras y objetos con el fin de
observarlas bajo el microscopio
y analizar.

Mechero de Es un instrumento utilizado en

Bunsen los laboratorios cientficos para
calentar o esterilizar muestras o
reactivos qumicos.

Es utilizado para poder observar

diferentes tipos de muestras tan-
Placa to biolgicas como qumicas.
Las cuales se encuentran ence-
petri rradas dentro de la placa.
Tambin es utilizado para el
cultivo de bacterias y otras espe-
cies relacionadas.

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Ahora tenemos los siguientes REACTIVOS:

Reactivo Descripcin Imagen

La funcin del alcohol-acetona

es la quitar el colorante de las bac-
terias, as si la bacteria conserva el
Alcohol- tinte, es Gram positiva y si el tinte
no se mantiene es Gram negati-
acetona (1:1) va. Para poner de manifiesto las
clulas Gram negativas se utiliza
una coloracin de contraste.

Las bacterias que absorben este

colorante y adquieren una colora-
cin rosada o rojiza se conocen
Safranina como Gram negativas, por lo tanto
facilita la observacin e identifica-
cin de bacterias Gram negativas.

El cristal violeta es el colorante

primario de la coloracin de Gram
que se adhiere a la pared celular
Solucin de bacteriana, las bacterias Gram posi-
Cristal tivas absorben este colorante por-
que tienen mayor porcentaje de
violeta cido teicoico en su estructura y por
eso adquieren un color violeta en el
microscopio.

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IV.PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL
Antes de comenzar la experiencia esterilizamos la lmina de vidrio con etanol y
el asa de siembra al fuego (mechero).

Extensin y fijacin de la
muestra

La muestra se extender con

ayuda del asa de siembra, y
luego procederemos a fijarla
con ayuda de un mechero,
esto para que al lavarla nues-
tra muestra no se pierda.

(Imagen referencial)

Aplicacin del colorante

Despus de haber fijado la muestra se

echa el cristal violeta y se deja que lo cu-
bra por un minuto, para luego
proceder a enjuagar suavemente con agua
destilada; esto con el fin de eliminar el
exceso de colorante.

Traza con mordiente

Se cubre por 60 segundos con reactivo de

Lugol para una mejor afinidad del colo-
rante.
Pasado el tiempo se procede a enjuagar
suavemente con agua para eliminar el ex-
ceso de Lugol.

Aplicacin del agente decolorante

Se gotea alcohol-acetona al 95% (1:1) de

forma continua hasta que la preparacin
pierda color (de 5 a 10 segundos); y en-
juagar con abundante agua.

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Aplicacin del colorante de contraste

Se cubre la muestra con Safranina por un

minuto procediendo luego a enjuagar el
exceso. Se usa la safranina por el buen
contraste que tiene con el violeta, tiendo
de rosa solo a las bacterias que hayan sido
decoloradas en el paso anterior.

Bacteria Gram negativa Bacteria Gram positiva

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V. RESULTADOS Y CONCLUSIONES
1. De la experiencia se obtiene como resultado que se analiz una bacteria Gram
negativa y una bacteria Gram positiva, esto se corrobora con la coloracin final
observndose una coloracin rosada y otra violeta.

2. Se hubiera observado mejor la tincin Gram de haberse llevado el preparado fi-

nal al microscopio.

3. Se aprendi a diferenciar las bacterias Gram positivas y Gram negativas, poste-

riormente esto nos servir para la identificacin de bacterias como el Escherichia
coli (Gram negativo) o el Bacillus Cereus (Gram positivo); y hacer el tratamien-
to correspondiente de acuerdo a sus caractersticas.

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VI. RECOMENDACIONES
1. Se sugiere llegar media hora antes al laboratorio para esterilizar los materiales y
as ahorrar tiempo.

2. Todas las personas en el laboratorio deben contar con guantes de proteccin para
evitar contaminar sus muestras.

3. El rea de trabajo debe mantenerse limpia ya que al trabajar con microrganismos

patgenos estos podran localizarse en esa zona.

4. Seguir la gua de laboratorio, fichas tcnicas, reglamento de lmites mximos y

mnimos permisibles, y cualquier otro que la profesora haya entregado a los
alumnos para un mayor desenvolvimiento en el curso.

5. Se recomienda que la muestra trabajada para este laboratorio sea joven ya que
al usar una muestra de mayor tiempo de cultivo podemos reportar una mayor
cantidad de errores.

VII. BIBLIOGRAFA

1. VILCHEZ CCEDA, Vctor (2010). Manual de prcticas de microbiologa,

Lima, Per. pgs. 46,49,50,51.

2. HERRERA SANCHEZ, Sonia. Manual de Prcticas de Laboratorio. Lima,

Per. pgs 21-23.

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VIII. ANEXOS

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