FROTIS: No es otra cosa que el extendido de una suspensión bacteriana en una

lámina portaobjeto limpia de tal forma que se forme una película uniforme y fina en el
tercio medio de la placa. Los frotis preferentemente deben realizarse tomando
muestras de cultivos frescos o directamente de los focos infecciosos.

TECNICA:

 Limpiar un portaobjeto aplicando la llama a una de las superficies, colocarlo sobre la

mesa con el lado tratado hacia arriba.
 Tomar el asa de transferencia o de inoculación como si fuera un lápiz con el pulgar y el
índice.
 Insertar el asa de inoculación en un ángulo de 60° en la punta de llama del mechero de
Bunsen o del alcohol, calentar al rojo toda el asa.
 Tomar el tubo de ensayo que contiene solución salina con la mano libre, quitar el tapón
de algodón ó tapa con los dedos de la mano que sujeta el asa de inocular y que está
libre.
 Calentar el borde del tubo haciéndolo pasar por el cono superior de la llama.
 Insertar el asa esterilizada dentro de la solución salina y extraer 2 o 3 asadas y llevarlas
al centro de la lámina porta objeto.
 Esterilizar el asa nuevamente y tomar una muestra de colonias bacteriana siguiendo el
procedimiento anterior tratando en lo posible coger el tubo de ensayo del fondo.
 Llevar las muestras de colonias bacterianas al centro de la lámina donde previamente
estaba la solución salina, sin olvidar de tapar los tubos de ensayo.
 Hacer un extendido con el asa de inoculación realizando movimientos circulares que
abarquen el tercio medio de la placa, dejar que el frotis seque al aire.
 Pasar varias veces el frotis por el mechero para fijarlo.
 Esterilizar el asa de inoculación antes y después de utilizarla.
 El frotis también se puede fijar confijadorde Schaudinn de 5 minutos a 50°C o una hora
a temperatura ambiente sin sufrir daños el frotis.

COLORANTE: Un colorante se define como una sustancia capaz de dar color a

células, tejidos, fibras, etcétera. De acuerdo con su origen, se pueden dividir en:
colorantes naturales, los cuales son extraídos de plantas o animales, y colorantes artifi
ciales, que son aquellos de minerales procesados y manipulados en el laboratorio. Así
pues, los colorantes tienen las siguientes funciones:

1. Permiten hacer visibles a los objetos microscópicos y transparentes.

2. Revelan su forma y tamaño.

3. Muestran la presencia de estructuras internas y externas.

4. Producen reacciones químicas específicas.

Las Bacterias poseen la propiedad de fijar ciertas sustancias colorantes, de ahí que cuando
éstas se tiñen podemos observar algunas de las estructuras bacterianas que no se observaban
en fresco, como por ejemplo cápsulas, esporas, flagelos, membranas, etc. Hay algunos tipos
de colorantes químicos como: los ácidos, básicos y neutros. Los colorantes ácidos tienen
carga iónica negativa no tiñen a la célula bacteriana y son usados para impartir el fondo de
contraste al frotis, por ejemplo: la eosina. Los colorantes básicos tienen ión de carga positiva
y tiñen las células bacterianas uniformemente, por ejemplo: violeta de genciana, azul de
metileno. Las tinciones se pueden clasificar como simples cuando toda la muestra se tiñe del
mismo color y se utiliza un sólo colorante (azul de lactofenol o tinta china); tinción
diferencial, cuando se visualiza más de un color porque se utiliza más de un colorante (Gram
o Ziehl-Neelsen); tinción específica, cuando se utilizan anticuerpos marcados con una
molécula fluorescente para identificar una estructura celular en particular
(inmunocitoquímico). Los métodos de tinción especiales son aquellos donde se utilizan
colorantes o reactivos para estudiar ciertas estructuras específicas de las Bacterias como por
ejemplo gránulos metacromáticos, flagelos, cápsulas, esporas, membranas.
Algunas técnicas tintoriales como Gram o ZiehlNeelsen requieren antes de su proceso la
fijación de las muestras, con la fi nalidad de preservar la arquitectura estructural y
química de las células. Existen dos tipos de fijadores: físicos y químicos. Entre los
procesos de fijación físicos se tienen los siguientes: desecación, calor seco, calor
húmedo, ultrasonido y microondas, mientras que los procesos de fijación químicos se
pueden clasificar como oxidantes y reductores, de acuerdo con sus propiedades. Quizá
el método físico con mayor utilización en microbiología es el calor seco, que consiste en
exponer directamente la laminilla a la flama del mechero, con esto se logra detener los
procesos vitales de las células y los microorganismos. Sin embargo, la sobreexposición,
o la exposición en una zona incorrecta de la flama (zona fría, zona caliente y zona de
fusión) repercutirá en el efecto deseado; es muy común provocar alteraciones
morfológicas y destrucción celular.

METODOS DE TINCION SIMPLE:

Tenemos el método de Violeta de Genciana, el de Azul de Metileno, el de Fucsina fenicada
básica, y el Azul de Metileno alcalino de Loeffler.
La mayoría de los colorantes utilizados en las tinciones positivas son colorantes derivados de
las anilinas, sales orgánicas intensamente pigmentadas que proceden del alquitrán.
Se denominan colorantes básicos si el cromóforo (porción coloreada) de la molécula está
cargada positivamente, por ejemplo, cristal violeta y azul de metileno son colorantes básicos.
Otros colorantes de esta categoría utilizados con frecuencia en bacteriología son safranina,
fuchina básica y verde malaquita.
Bajo condiciones normales de crecimiento, la mayor parte de los procariotas tienen un pH
interno próxima la neutralidad (pH 7.0) y una superficie celular cargada negativamente, así
los colorantes básicos son los más eficaces. Colorantes ácidos con rojo Congo, rosa de
bengala, eosina y fuchina ácida tiene un cromóforo cargado negativamente y son utilizados
para teñir positivamente ciertos componentes como las proteínas.
La tinción simple nos proporciona exclusivamente información acerca de la forma, tamaño y
tipo de agrupación de los microorganismos. Sin embargo tiene la ventaja de ser un método
muy sencillo y rápido.
METODOS DE TINCION COMPUESTA:
Tenemos el método de Gram, el método de Preston-Morrel, el método de Ziehl-Neelsen, el
método de Kinyoun, método Albert.
METODOS DE TINCIONES ESPECIALES:
Método de Wirtz-Conklin, método de Tinta China, método de Hiss, método de tinción
de Fontana tribondeau, método de Fleming-modificado, método de Leifson ;rojo congo
para leptopiras es la que se adopta en el laboratorio de bacteriología para la
visualización de estas, sin embargo la técnica correcta es Microscopia de campo oscuro.
METODO DE VIOLETA DE GENCIANA:
TECNICA:
1.- Realizar un frotis y cubrir la preparación con violeta de genciana por un minuto, lavar con
agua destilada, luego de secar al medio ambiente o con papel filtro y queda lista para ser
observada con objetivo de inmersión.
Las Bacterias con este método se van a observar en el microscopio de color violeta o morada.
METODO DE AZUL DE METILENO:
TECNICA:
1.- Realizar un frotis y cubrir la preparación con azul de metileno durante un minuto, lavar
con agua destilada, luego secar al medio ambiente o con papel filtro y queda lista para ser
observada con el lente de inmersión.
Las Bacterias con éste método se van a observar de color azul.
METODO DE FUCSINA FENICADA BASICA:
TECNICA:
1.- Realizar un frotis y cubrir la preparación con fucsina fenicada basica durante un minuto
lavar con agua destilada, luego secar al medio ambiente o con papel filtro y queda lista para
ser observada con el lente de inmersión.
Las Bacterias con éste método se van a observar de color rosado
METODO DE AZUL DE METILENO ALCALINO DE LOEFLER:
TECNICA:
1.- Realizar un frotis y cubrir la preparación con azul de metileno alcalino de Loffler durante
un minuto, lavar con agua destilada, luego secar al medio ambiente o con papel filtro y queda
lista para ser observada con el lente de inmersión.
Las Bacterias con éste método se van a teñir de color azul, es importante señalar que
con éste método se tiñe bien el bacilo DIFTERICO, las granulaciomnes metacromáticas
del bacilo se observan en el microscopio de una coloración azul oscuro y el cuerpo del
bacilo en un azul pálido.
METODO DE VIOLETA DE GENCIANA:
TECNICA:
1.- Realizar un frotis y cubrir la preparación con violeta de genciana por un minuto, lavar con
agua destilada, luego de secar al medio ambiente o con papel filtro y queda lista para ser
observada con objetivo de inmersión.
Las Bacterias con este método se van a observar en el microscopio de color violeta o morada.
METODO DE AZUL DE METILENO:
TECNICA:
1.- Realizar un frotis y cubrir la preparación con azul de metileno durante un minuto, lavar
con agua destilada, luego secar al medio ambiente o con papel filtro y queda lista para ser
observada con el lente de inmersión.
Las Bacterias con éste método se van a observar de color azul.
METODO DE FUCSINA FENICADA BASICA:
TECNICA:
1.- Realizar un frotis y cubrir la preparación con fucsina fenicada basica durante un minuto
lavar con agua destilada, luego secar al medio ambiente o con papel filtro y queda lista para
ser observada con el lente de inmersión.
Las Bacterias con éste método se van a observar de color rosado
METODO DE AZUL DE METILENO ALCALINO DE LOEFLER:
TECNICA:
1.- Realizar un frotis y cubrir la preparación con azul de metileno alcalino de Loffler durante
un minuto, lavar con agua destilada, luego secar al medio ambiente o con papel filtro y queda
lista para ser observada con el lente de inmersión.
Las Bacterias con éste método se van a teñir de color azul, es importante señalar que
con éste método se tiñe bien el bacilo DIFTERICO, las granulaciones metacromáticas
del bacilo se observan en el microscopio de una coloración azul oscuro y el cuerpo del
bacilo en un azul pálido.

TINCION DE GRAM
Esta tinción es un procedimiento de gran utilidad empleado en los laboratorios donde se
manejan pruebas microbiológicas. Es definida como una tinción diferencial, ya que
utiliza dos colorantes y clasifica a las bacterias en dos grandes grupos: bacterias Gram
negativas y bacterias Gram positivas. Fue desarrollada por el científico danés Hans
Christian Gram en 1884; hoy en día, sigue siendo una de las tinciones más utilizadas
universalmente debido a lo económico, sencillo y eficaz que resulta. En microbiología
clínica resulta de gran utilidad, ya que a partir de muestras clínicas directas provenientes
de sitios estériles se puede saber de manera rápida las características de la muestra y
hacer una diferencia de los potenciales microorganismos causantes de una infección.
Los principios de la tinción de Gram están basados en las características de la pared
celular de las bacterias, la cual le confiere propiedades determinantes a cada
microorganismo. La pared celular de las bacterias Gram negativas está constituida por
una capa fina de peptidoglicano y una membrana celular externa, mientras que las
bacterias Gram positivas poseen una pared celular gruesa constituida por
peptidoglicano, pero no cuentan con membrana celular externa; así pues, la
composición química y el contenido de peptidoglicano en la pared celular de las
bacterias Gram negativas y Gram positivas explica y determina las características
tintoriales. La tinción de Gram se basa en colocar como colorante primario cristal
violeta, el cual tiene afi nidad con el peptidoglicano de la pared bacteriana.
Posteriormente, se coloca lugol (licor de Gram), el cual sirve como mordiente e impide
la salida del cristal violeta por la formación de un complejo cristal violetayodo que
satura los espacios del peptidoglicano de la pared bacteriana. En seguida, se coloca una
mezcla de alcohol-acetona, la cual deshidrata la pared bacteriana y cierra los poros de la
misma, también destruye la membrana externa de las bacterias Gram negativas debido a
que ésta es soluble a la acción de solventes orgánicos, como la mezcla de
alcoholacetona.Las bacterias Gram positivas, al contener una gran cantidad de
peptidoglicano, retienen con mayor fuerza este complejo, mientras que las Gram
negativas no lo pueden retener por tener menos cantidad de peptidoglicano. Por último,
se coloca safranina, la cual funciona como un colorante secundario o de contratinción y
sirve para teñir las bacterias que no pudieron retener el complejo cristal violeta-yodo.
Hay bacterias de un mismo género que pueden observarse en la misma muestra como
Gram positivas y como Gram negativas, a este evento se le llama tinción Gram variable
secundaria a alteración en nutrientes, temperatura, pH o concentración de electrolitos.
No todas las bacterias se pueden teñir por esta técnica, ya que carecen de pared celular
(micoplasma) o su pared celular tiene una composición química diferente
(micobacterias, que cuentan con una gran cantidad de ácidos micólicos). Las muestras
útiles para su uso son líquidos estériles, biopsias para cultivo, abscesos, hisopados,
crecimiento de colonias aisladas en medios de cultivo. Las bacterias Gram positivas se
observan de color azul obscuro a morado, mientras que las Gram negativas se observan
de color rosa a rojo.

TECNICA:
1.- Realizar un frotis y cubrir la preparación con violeta de genciana durante un minuto luego
lavar con agua.
2.- Cubrir la preparación con Licor de Gram que actúa como mordiente, durante un minuto,
luego lavar con agua.
3.- Decolorar la preparación con alcohol 70° ó alcohol acetona hasta eliminar el exceso de
violeta genciana, luego lavar.
4.- Cubrir el frotis con fuscina fenicada o safranina; si se usa fuscina fenicada diez
segundos es suficiente, si se utiliza safranina de 30 a 60 segundos. Luego lavamos con
agua secamos con papel filtro y queda lista para ser observada con el lente de inmersión.

TINCION DE ZIEHL-NEELSEN
La tinción de Ziehl-Neelsen es la técnica comúnmente usada en el diagnóstico rutinario
de tuberculosis. Es una técnica rápida, fácil y de bajo costo, lo que permite que se pueda
realizar en casi cualquier laboratorio clínico. Esta tinción permite diferenciar a las
bacterias en dos grupos: aquellos que son capaces de resistir la decoloración con
alcohol-ácido y aquellos que no lo son. El agente etiológico de la tuberculosis fue
descrito por Heinrich Hermann Robert Koch, quien, basándose en las características de
las micobacterias, desarrolló una de las primeras tinciones utilizando azul de metileno
seguido de la tinción de Bismarck. Sin embargo,fueron los trabajos de Paul Ehrlich los
que definieron la resistencia a la decoloración por alcohol-ácido, y las últimas
modificaciones a la tinción fueron realizadas por los científicos alemanes Franz Ziehl y
Karl Adolf Neelsen. El género Mycobacterium es el único miembro en la familia
Mycobacteriaceae y está relacionado con otros géneros que contienen ácidos micólicos
(Gordonia, Tsukamurella y Rhodococcus), los cuales también pueden ser teñidos con
esta tinción. La pared celular de las micobacterias es extremadamente compleja en
cuanto a su composición bioquímica; dicha característica es la que se ha aprovechado
para realizar la tinción de Ziehl-Neelsen. La pared celular está compuesta por ácido
mesodiaminopimélico, alanina, ácido glutámico, glucosamida, ácido murámico,
arabinosa y galactosa. Los ácidos micólicos, proveen a la célula de una barrera
hidrofóbica. La tinción se basa en colocar carbol-fucsina y calentar la preparación
ligeramente para solubilizar las ceras, lípidos y otros ácidos grasos de la pared celular
para que permita el paso libre del colorante, el cual tiene una enorme afinidad por los
ácidos micólicos presentes en la pared. Al enfriar con agua, los componentes de la pared
vuelven a solidifi car, resistiendo la acción abrasiva del alcohol-ácido, y el azul de
metileno se utiliza como contratinción. Las muestras clínicas útiles para su uso son
múltiples, como el líquido cefalorraquídeo, líquido pleural, líquido sinovial, líquido
pericárdico, biopsias para cultivo, abscesos, aspirados, crecimiento de colonias aisladas
en medios de cultivo, expectoraciones, aspirados endotraqueales y lavados
bronquioalveolares. Una tinción positiva es aquélla en la que se observan bacilos ácido-
alcohol resistentes, los cuales son de color rojo fucsia.

TECNICA:
1.- Realizar un frotis, cubrirlo con papel filtro y luego colocar fucsina. Calentar en el
mechero la lámina portaobjeto durante 5 minutos, separándola cada vez que emita vapores,
luego lavar con agua.
2.- Decolorar el frotis hasta eliminar el exceso de fuscina fenicada con alcohol ácido unos
segundos lavar con agua luego.
Cubrir elfrotis con azul de metileno un minuto. Lavar con agua, secar con papel filtro y
queda listo para observar con el lente de inmersión.

METODOS DE TINCIONES ESPECIALES

METODO DE WIRTZ CONKLIN: (ESPORAS).
TECNICA:
1.- Haga una suspensión de los organismos en 0,25 ml. de agua destilada.
2.- Haga un frotis delgado con esta suspensión y fíjelo a la llama.
3.- Cubra el frotis con una solución acuosa con el 5% de verde malaquita y calientelo hasta
emitir vapores de 3 a 6 minutos.
4.- Lave con agua destilada.
5.- Tiña con una solución acuosa al 5% de safranina por 1 minuto
6.- Lave con agua destilada.
7.- Seque y examine.
Las esporas se tiñe de verde, el cuerpo de la bacteria es rosado.

METODO DE TINTA CHINA (CAPSULAS).

TECNICA:
1.- Realizar un frotis y fijarlo.
2.-Depositar sobre el frotis seco y fijado una gota de tinta china y extenderlo con laminilla.
3.- Dejar secar.
4.- Colocar safranina durante 1 minuto.
5.- Lavar con agua y observar con el lente inmersión. La cápsula aparece como espacio claro
alrededor del cuerpo bacteriano que se tiñe de rojo pálido sobre un fondo negro dado por la
tinta china.
METODO DE HISS (CAPSULAS):
TECNICA:
1.- Mezcle el material a ser teñido con igual cantidad de suero. Haga un frotis delgado.
2.- Déjelo secar al aire.
3.- Fíjelo ya sea a la llama o en formalina comercial diluida al 10% (1:10).
4.- Cubra el frotis con el colorante de Hiss o con solución acuosa al 1% de cristal violeta hasta
emitir vapores por unos pocos segundos.
5.- Lave el colorante con una solución acuosa al 20% de sulfato de cobre.
6.- Seque al aire y examine.
El cuerpo bacteriano,células y fondo de la preparación se tiñen de púrpura.
Las cápsulas son incoloras o lavanda pálida.
TINCION DE PARED CELULAR.
1.- Se utiliza cultivos jóvenes de 18 a 20 horas de B. subtilis.
2.- Realizar un frotis grueso, con el frotis húmedo se coloca el ácido fosfomolíbdico 1% por 4
minutos.
3.- Escurrir el ácido fosfomolíbdico y agregar verde de metilo 1% por 5 minutos.
4.- Lavar.
Este método se fundamenta en que el ácido fosfomolíbdico hidroliza el citoplasma, pero
respeta la pared que aparece de color verde.
METODO DE FLEMING MODIFICADO. (ESPORAS):
1.- Carbol fucsina de Ziehl - 5 minutos calentando.
2.- Lavar.
3.- Decolorar con etanol 30 segundos.
4.- Lavar.
5.- Extendido de una gota de tinta china y dejar secar.
Es importante reconocer que cuando no se usa métodos especiales de tinción de esporas y se
utiliza el método de Gram las esporas aparecen como un espacio claro no teñido y el cuerpo
de la bacteria de color violeta.

TINCION DE FONTANA TRIBAONDEAU. (FLAGELOS):

Es una coloración de impregnación argéntica que permite la observación de ciertos
microorganismos (espiroquetas) o de estructuras muy finas (flagelos).
TECNICA:
1.- Extraer y secar a temperatura ambiente.
2.- - Cubrir la preparación con el fijador y dejar actuar 90 segundos.
3.- Lavar con alcohol etílico de 95°.
4.- Cubrir la preparación con el mordiente, calentando hasta el desprendimiento de vapores y
dejar actuar durante 30 segundos.
5.-- Lavar con agua.
6.- Cubrir la preparación con solución de nitrato de plata, calentando hasta el desprendimiento
de vapores . Mantenerlo de 15 a 20 segundos.
7.-- Lavar con agua.
8.-- Secar a temperatura ambiente y observar con objetivo de inmersión.
Las espiroquetas se observan de color castaño.
TINCION DE LEIFSON: (FLAGELOS):
Para realizar la tinción de flagelos se debe partir de un cultivo líquido adecuado de 18 a 24
horas, incubado a temperatura ambiente.
REACTIVOS:
Preparar tres soluciones por separado.
a.- Cloruro sódico: 1,5g.
Agua destilada 10ml.
b.- Acido tánico 10g.
Agua destilada 100ml.
c.- Acetato de p-rosanilina 0,9g.
p-rosanilina ClH: 0,3 g.
Alcohol etílico de 95 °: 100ml.
Dejar en reposo 12 horas a temperatura ambiente. Tomar volúmenes iguales de A, B, C, agitar
y dejar 2 horas en reposo.
TECNICA:
1.- Sobre 4 ml de cultivo añadir 0,25 ml de formol al 5%.
2.- Dejar reposar 15 minutos.
3.- Añadir agua destilada mezcla y centrifugar retirando el sobrenadante. Repetir 2 veces..
4.- Resuspender en 1-2 ml. de agua destilada debe quedar suspensión bacteriana ligeramente
turbia.
5.- Flamear un portaobjeto limpio y dejar enfriar.
6.- Depositar unas gotas de la suspensión , con asa o pipeta, en un extremo del portaobjetos
inclinado, de forma que las gotas se extiendan a lo largo del cristal.
7.- Dejar secar a temperatura ambiente y no fijar por el calor.
8.- Cubrir la preparación con 1 ml. de colorante.
9.- Dejar de 5 a 15 minutos hasta que el alcohol se evapore.
10- Una vez formado el precipitado lavar con agua.
11.- Secar a temperatura ambiente y observar con objetivo de inmersión.
Los flagelos se tiñen de color rojo oscuro o azul negro.
Además de este método, tenemos el método de Gray que también sirve para teñir
flagelos.