INSTITUTO TECNOLOGICO SUPERIOR DE SAN ANDRES TUXTLA

MICROBIOLOGIA

PROF. BIO.SOLEDAD MALDONADO BRAVO

TECNICAS DE TINCION UTILIZADAS EN EL LABORATORIO DE MICROBIOLOGIA

JARED CRISTAL REYES FIGUEROA

JEHIMI GPE. DEL CARMEN MALDONADO MARTINEZ

INGENIERIA AMBIENTAL 406-A

LUNES 17 DE FEBRERO DEL 2014

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Jared Cristal Reyes Figueroa
Jehimi Gpe. Del Carmen Maldonado Martinez
MICROBIOLOGIA

Introduccin

Una tincin o coloracin es una tcnica auxiliar utilizada en microscopa para mejorar el contraste en
la imagen vista al microscopio. Los colorantes y tinturas son sustancias que usualmente se utilizan
en biologa y medicina para resaltar estructuras en tejidos biolgicos que van a ser observados con
la ayuda de diferentes tipos de microscopios. Los diferentes colorantes pueden ser utilizados para
aumentar la definicin y examinar grandes cortes de tejido (resaltando por ejemplo fibras
musculares o tejido conectivo), poblaciones celulares (por ejemplo clasificando diferentes clulas
sanguneas) o incluso para resaltar organelos dentro de clulas individuales.
En bioqumica, esto implica agregar un colorante especfico (esto significa que se una de manera
selectiva ya sea ADN, protenas, lpidos, carbohidratos, etc.) a un sustrato para cualificar o
cuantificar la presencia de un determinado compuesto. Tanto la tincin como el marcado
fluorescente pueden servir para los mismos propsitos.
Diferentes tipos de tinciones biolgicas son utilizadas tambin para marcar clulas en citometra de
flujo y para marcar protenas cidos nucleicos en electroforesis en gel.
Las tinciones no estn limitadas a su uso en materiales biolgicos, tambin pueden ser utilizadas
para estudiar la morfologa de otros materiales (por ejemplo, las estructuras lamelares de polmeros
semicristalinos de las estructuras de dominio de bloques de copolmeros.

Las tinciones pueden ser:

Simples. Utilizan un solo colorante. Se basan en el hecho de que las clulas tienen una
composicin qumica diferente a la de su entorno, de modo que ambos se comportan de forma
diferente frente a un colorante. El colorante tie las clulas (azul de metileno, safranina) o no
(nigrosina).
Diferenciales. Se basan en el hecho de que distintos tipos de clulas tienen distinta
composicin qumica, y por lo tanto reaccionan de forma diferente frente a una tincin, lo que permite
clasificar los microorganismos en diferentes grupos, segn su capacidad de tincin. En este apartado
estn dos tinciones de importancia taxonmica y mdica: la tincin de Gram y la de cido-alcohol
resistencia (de Ziehl-Neelsen). Estas tinciones utilizan ms de un colorante.
Selectivas. Se basan en el hecho de que distintas estructuras celulares tienen distinta
composicin qumica, de modo que se tien selectivamente con ciertos colorantes. Ej; tincin de
esporas, de flagelos, de paredes celulares, de corpsculos metacromticos. Pueden utilizarse uno o
ms colorantes.
En microbiologa las tcnicas de tincin mas utilizadas en el laboratorio son Tincin de Gram, Tincin
de Ziehl-Neelsen, Tincin de Schaeffer-Fulton, Tincin de Conklin, Tincin de Grocott, Tincin de

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Dieterle, Tincin negativa y Tincin con mucicarmina, A continuacin mencionaremos unas de las
tinciones ms utilizadas por la microbiologa; mencionando sus utilidades para esta ciencia.

Tincin de Gram

La tincin de Gram o coloracin de Gram es un tipo de tincin diferencial empleado para la

visualizacin de bacterias. Debe su nombre al bacterilogo dans Christian Gram, que desarroll la
tcnica en 1884. Se utiliza tanto para poder referirse a la morfologa celular bacteriana como para
poder realizar una primera aproximacin a la diferenciacin bacteriana, considerndose Bacteria
Gram positiva a las bacterias que se visualizan de color morado o azul, y Bacteria Gram negativa a
las que se visualizan de color rosa o rojo o grosella.
Su metodologa es la siguiente:
1. Recoger muestras.
2. Hacer el extendido en espiral.
3. Fijarlas utilizando un mechero.
4. Fijar la muestra con metanol durante un minuto.
5. Agregar azul violeta (cristal violeta o violeta de genciana) y esperar 1 minuto. Todas las
clulas Gram positivas se tien de color azul-prpura.
6. Enjuagar con agua.
7. Agregar lugol y esperar 1 minuto.
8. Enjuagar con agua.
9. Agregar alcohol acetona y esperar 30 segundos o 5 segn la concentracin del reactivo (parte
crtica de la coloracin).
10. Enjuagar con agua.

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11. Tincin de contraste agregando safranina o fucsina bsica y esperar 1 minuto. Este tinte
dejar de color rosado-rojizo las bacterias Gram negativas.
Para observar al microscopio ptico es conveniente hacerlo a 100x con aceite de inmersin.

El metodo se fundamenta en el echo de que el colorante primaro (cristal violeta) tie por igual a
todas las bateras, pero la combinacin con el colorante es mas permanente en los gran positivos.
Para establecer la diferencia entre estos dos grupos, se aplica un disolvente del colorante primario
que no tiene efecto sobre el grupos de microorganismos que ls retienen firmemente, pero lo elimina
de aquellos que no son capaces de retenerlo, quedando por lo tanto completamente decolorados.
En estas circunstancias sera muy fcil su observacin por lo que es preciso tratarlos con otro
colorante llamado secundario, como la safranina. Este colorante no modifica el color de los
microorganismos que haban retenido el color primario, pero tie a los microorganismos decolorados.
Estas diferencias de tincin de las bacterias se explica por cambios en la composicin qumica y
estructura de las paredes celulares, que facilitan la retencin o eliminacin del colorante primarios
despus del proceso de decoloracin.

Tincin de Ziehl-Neelsen

La tincin de Ziehl-Neelsen (BAAR) es una tcnica de tincin diferencial rpida y econmica, usada
para la identificacin de microorganismos patgenos, como M. tuberculosis o el gnero Apicomplexa
(coccidios intestinales) entre otros.
Fue descrita por primera vez por dos mdicos alemanes: Franz Ziehl, un bacterilogo, y Friedrich
Neelsen, un patlogo.

Su metodologa en frio es la siguiente:

1. Hacer un frotis.
2. Dejarlo en el puente de tincin.
3. Aplicar fucsina-fenicada (solucin con fenol y mayor concentracin de fucsina).
4. Dejar en vasos coplin durante 20 minutos.

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5. Decolorar con alcohol cido.

6. Lavar con agua del grifo.
7. Contrastar con azul de metileno
Para observar al microscopio ptico es conveniente hacerlo a 100x con aceite de inmersin.
Los BAAR se tien de color rojo, y los ncleos se tien de azul semiamarillo.
Las paredes celulares de ciertas bacterias contienen cidos grasos (cidos miclicos) de cadena
larga (50 a 90 tomos de carbono) que les confieren la propiedad de resistir la decoloracn con
alcohol-cido, despus de la tincin con colorantes bsicos. Por esto se denominan cido-alcohol
resistentes. Las micobacterias como Mycobacterium tuberculosis y M. marinum se caracterizan por
sus propiedades de cido-alcohol resistencia. La coloracin clsica de Ziehl-Neelsen requiere
calentamiento para que el colorante atraviese la pared bacteriana que contiene ceras. Al suspender
el calentamiento y enfriar con agua, provoca una nueva solidificacin de lo cidos grasos de modo
que el colorante ya no puede salir de las bacterias. Por otro lado, el calentamiento aumenta la
energa cintica de las molculas del colorante lo cual tambin facilita su entrada a las bacterias. Las
bacterias que resisten la decoloracin son de color rojo y las que no, se ven de color azul ya que se
utiliza azul de metileno como tincin de contraste.

Tincin de Conklin
La tincin de Wirtz-Conklin (tincin de esporas) permite diferenciar las esporas de las clulas
vegetativas. La tincin primaria se realiza con Verde de Malaquita en caliente que tie las clulas de
verde. El calor es necesario para que las endosporas se tian. Si la preparacin se lava con agua,
slo las clulas vegetativas se decoloran mientras que las esporas retienen el color.
La tincin de contraste se realiza con rosa safranina que tie las clulas vegetativas de color rosa,
mientras que las esporas permanecen verdes.
Algunos gneros bacterianos, entre los que destacan Clostridium y Bacillus, producen en su interior
formas de resistencia denominadas endosporas. Se producen cuando las condiciones ambientales
son desfavorables (agotamiento de los nutrientes, temperaturas extremas, radiaciones, compuestos
txicos, etc.) formndose una espora por cada forma vegetativa. Al finalizar el proceso de
esporognesis, la clula vegetativa se lisa y libera la espora al exterior. Cuando el ambiente es

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favorable, la espora germina generando una nueva forma vegetativa. La capacidad de germinar
perdura durante aos. Algunas de las bacterias productoras de endosporas son patgenas para el
hombre, por lo que su estudio y observacin son de enorme inters.
Se emplearn cultivos en fase estacionaria para dar lugar a que las bacterias produzcan las esporas,
Sirve para diferenciar endosporas. Esta tincin es delicada en su realizacin y para poder obtener
unos resultados satisfactorios hay que seguir cuidadosamente las instrucciones.
Su metodologa es la siguiente:
1. Preparar los frotis bacterianos indicados.
2. Teir con verde malaquita. Con unas pinzas de madera colocar la muestra encima
de la llama del mechero de forma que el colorante humee durante 5 min.
3. Nota: evitar que la muestra hierva. Aadir ms colorante si ste se evapora; es
importante que la muestra no se seque.
4. Lavar con abundante agua el exceso de colorante.
5. Teir con safranina 1 min.
6. Lavar con abundante agua el exceso de colorante.
7. Secar la preparacin.
8. Observar la preparacin al microscopio. Anotar la disposicin y la morfologa de las
tres especies del gnero Bacillus.
Para observar al microscopio ptico es conveniente hacerlo a 100x con aceite de inmersin. Esta
tcnica tie endosporas de color verde y clulas vegetativas de color rosa.

Tincin Positiva

Tambin llamada Azul de metileno, permite teir el interior celular. Tie microorganismos
procarionticos (vivos o muertos). Los eucarionticos solo se tien si estn muertos. Algunas
estructuras, como los corpsculos metacromaticos, se tien ms intensamente con este colorante
que el resto de la clula.
Su metodologa es la siguiente:
1. Extensin. Poner una gota de agua en el porta objetos y extender en ella la muesta.
2. Fijacin. Pasar el porta objetos varias veces por encima de la llama del mechero de alcohol,
sin permitir que llegue a hervir, hasta que seque.
3. Aadir azul de metileno y esperar dos minutos.
4. Lavar con agua
5. Secar con ayuda del mechero.

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6. Observar primero con el objetivo de 40; luego se aade aceite de imersion y se observa con el
objetivo de 100.
La coloracin con azul de metilenos tie a todas las bacterias por igual. Este colorante se utiliza para
teir las estructuras presentes en el citoplasma de la batera. No es diferencial porque cuando se
tien microorganismos con este colorante tie a todos por igual, se comporta dela misma forma con
una batera u otra.

Tincin simple
La mayora de los colorantes utilizados en las tinciones positivas son colorantes derivados de las
anilinas, sales orgnicas intensamente pigmentadas que proceden del alquitrn.
Se denominan colorantes bsicos si el cromforo (porcin coloreada) de la molcula est cargada
positivamente, por ejemplo, cristal violeta (Fig. 5) y azul de metileno son colorantes bsicos. Otros
colorantes de esta categora utilizados con frecuencia en bacteriologa son safranina, fuchina bsica
y verde malaquita. Bajo condiciones normales de crecimiento, la mayor parte de los procariotas
tienen un pH interno prximo a la neutralidad (pH 7.0) y una superficie celular cargada
negativamente, as los colorantes bsicos son los ms eficaces. Colorantes cidos con rojo Congo,
rosa de bengala, eosina y fuchina cida tiene un cromforo cargado negativamente y son utilizados
para teir positivamente ciertos componentes como las protenas.
Se utilizan cultivos bacterianos de Staphylococcus aureus y Micrococcus luteus, frasco lavador,
cristalizador, soporte y colorantes (safranina y cristal violeta), asa de siembra, aceite de inmersin.

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Su metodologa es la siguiente:
1. Poner sobre un portaobjetos una gota de agua y una pequea alcuota de un
2. cultivo bacteriano con el asa de siembra estril.
3. Hacer el frotis, formando una pelcula homognea sobre el portaobjetos con el
4. asa de siembra. Dejar secar.
5. Fijar la preparacin, pasando a travs de la llama del mechero el portaobjetos.
6. Cubrir con una pelcula de colorante (cristal violeta o safranina) durante 1
7. minuto.
8. Lavar el exceso de colorante con agua.
9. Dejar secar al aire.
10. Aadir una gota de aceite de inmersin.
11. Observar con objetivo de inmersin (100 x).
12.
La tincin simple nos proporciona exclusivamente informacin acerca de la forma, tamao y tipo de
agrupacin de los microorganismos. Sin embargo tiene la ventaja de ser un mtodo muy sencillo y
rpido

Tincin de azul de lactofenol.

El anlisis de la calidad de los alimentos incluye la determinacin de los hongos que se encuentran
en los alimentos, cuando se degradan. Los hongos pertenecen al grupo de eucariota en este estn
las levaduras, mohos y setas. Los hongos deuteromicotos con los conidios y conidioforos no tienen
ningn tipo de proteccin. El tal de un hongo esta formado por hifas (sn filamentos cilndricos
constituidos, generalmente estn ramificadas) y estas ests estan divididas por septas. Y el conjunto
de hifas se le llama micelio. La reproduccin asexual de los hongos tiene a lugar en las esporas, que
se encuentran en las extremidades de las hifas. Estas esporas tiene una estructura como las uvas.
Las esporas axesuales de los hongos se pueden formar de varios tipos;

Clamidiporas

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Conidiosporas

Los hongos se encuentran de manera asexual y sexual. Y las floriduras que desarrollan encima de
los alimentos, pertenecen al grupo; Deuteromicetos, es una subdivisin artificial(reproduccin
asexual). La tincin con azul de lactofenol de la pared externa de las estructuras taloficas, se realizan
en una sola etapa.

Su metodologa es la siguiente:
1. Se coloca una gota de agua salina fisiolgica encima del portaobjetos. Y con la ayuda de la
asa esterilizada en el mechero Bunsen se pica un trocito de hongo y se expande por encima
de la gota de agua salina fisiolgica, y se pasa por el mechero hasta que seque. O se deja al
aire libre para que el portaobjetos se seque por si solo.
2. Despus de que se seque la muestra, se coge una gota de azul de lactofenol con una aguja
estril y se aade encima de la muestra. Es aconsejable esperar un par de minutos, despus
de introducir el reactivo.
3. se cubre la muestra con el cubreobjetos. Hay que intentar que no queden burbujas de aire en
la preparacin, sino se observara mayoritariamente burbujas.
4. para observar las estructuras se usa una resolucin de 4X. Despus de encontrar el
microorganismo, se aumenta hasta la resolucin de 100X, para poder ver bien el
microorganismo.

Se observaran estructuras de los filamentos de los hongos coloreadas de azul.

Tincin de Shaeffer-Fulton

La envuelta de la endospora es ms compleja e impermeable que la envuelta de las clulas

vegetativas en las que se forma. Slo se puede teir el contenido de la espora alterando su envuelta.
La impermeabilidad de las cubiertas dificulta que las endosporas se decoloren una vez teidas.

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El verde de malaquita es un colorante dbilmente bsico (tiene una carga positiva dbil) y por tanto,
se une dbilmente a la bacteria. Penetra en las clulas vegetativas. Cuando se calienta la
preparacin tambin penetra las endosporas.
Durante el lavado con agua, el verde de malaquita se elimina de las clulas vegetativas, pero no de
la endospora. El colorante de contraste (la safranina) solo puede teir a las clulas vegetativas
(decoloradas por el agua).
Para el correcto desarrollo de esta prctica sern necesarios los siguiente materiales: cultivos
de Bacillus subtilis y de Bacillus megaterium. Verde malaquita al 5 % en agua y Safranina al 1% en
agua. Platina de Koch.
Su metodologa es la siguiente:
1. cubrir la extensin con el papel de filtro (dificulta la precipitacin del colorante sobre las
bacterias)
2. depositar la preparacin sobre una platina de Koch. Aadir verde de malaquita. Esperar un
minuto.
3. Seguir la tincin con el calor: en emisin de vapores durante 5-10 min. Dejar enfriar.
4. Lavar con agua abundante y dejar secar.
5. Teir con safranina (dos min.). lavar con agua. Secar. Observar con objetivo de inmersin.
Lo que se observa son esporas teidas de verde y clulas vegetativas teidas de rosa. Observar la
forma, tamao relativo y posicin de la espora en la clula vegetativa.

Tincin del Sudan III

La tcnica del sudn III es un mtodo utilizado generalmente para demostrar la presencia
mediante tincin de triglicridos, aunque tambin tie otros lpidos.

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Pertenece al grupo de colorantes indiferentes, que son aquellos que no tienen afinidad por
estructuras cidas o bsicas. Son insolubles en el agua y tien aquellas sustancias que tienen un
poder de disolucin superior al del lquido empleado para preparar la solucin colorante.
Los colorantes para grasas son ms solubles en las propias grasas que en el medio en el que van
disueltos. As, al baar la grasa con la solucin del colorante, ste tiende a disolverse en la grasa
que se va cargando del colorante. Por regla general estos colorantes siempre van en solucin
alcohlica o bien en una mezcla de alcohol/acetona o alcohol/agua.
El tejido diana para esta tcnica es el tejido adiposo y lpidos en general. El fijador ideal es
el formol 10%, y el grosor ptimo de corte es de 4 a 6 micras.
Su metodologa es la siguiente:
1. Desparafinar e hidratar.
2. Lavar en agua destilada.
3. Aadir sudn III + 40 gotas de rojo escarlata, de 1 a 24 horas.
4. Lavar con agua corriente.
5. Aadir hematoxilina o carmn (para el contraste), 5-10 minutos.
6. Lavar en agua corriente, 5 minutos.
7. Montar.

Para observar al microscopio ptico es conveniente hacerlo a 100x con aceite de inmersin. Se
observara que las Grasas se teirn de color rojo.

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Tincin negativa

La Tincin negativa es una tcnica de microscopa que permite contrastar las muestras mediante una
sustancia opaca a los fotones (microscopa ptica) o a los electrones (microscopa electrnica). En el
primer caso, se emplea nigrosina o tinta china; para el caso de bacterias que esporulan, esta tcnica
permite visualizar las esporas como entes refringentes sobre un campo de fondo oscuro. En caso
de microscopa electrnica de transmisin, se emplean sustancias de alto nmero atmico que, por
tanto, resultan opacas a los electrones transmitidos. Tpicamente, estas sustancias son acetato de
uranilo, citrato de plomo o molibdato de amonio.
Al electrnico, esta tcnica permite visualizar virus, flagelos, bacterias y otros entes de escaso
tamao.
Esta tcnica tie el exterior, pero no el interior de clulas y sus estructuras.

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REFERENCIAS

VINCULOS EN LA WEB.
1. Tincin - Wikipedia, la enciclopedia libre
2. Tincin azul d metileno....www.slideshare.net
3. Prcticas Online de Microbiologa para Farmacuticos > Tincin de esporas (tcnica
de Shaeffer-Fulton) | Universidad de Granada.www.pomif.com
4. Creando la pgina Tincin de Conklin - Wikipedia, la enciclopedia libre.
es.wikipedia.org
5. Tincion Simple. es.scribd.com
6. yeansi: Tincin de hongos con azul lactofenol. eniyas999.blogspot.mx
7. Laboratorio de Microbiologia: Observacin de Bacterias.
labmicrofarmaciaulat.blogspot.mx

BIBLIOGRAFIA.
1. Manual de laboratorio clnico. Dra. Bioqumica y Farmacia opcin Bioq. Clnica. Celia
Annabel Bowen Fernndez.
2. Manual de prcticas de laboratorio Microbiologa General. Ma.de los Ageles Aquiahuatl
Ramos, et. Al.

3. Manual de prcticas de laboratorio: microbiologa general y aplicada. Jorge Luna

Fontalvo.

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