LABORATORIO No 1.
CULTIVO DE MICROORGANISMOS Y TINCIÓN DE GRAM
Nobles L.1, Ramos J.1
1. Estudiantes de la Facultad de Odontología.
Abril 2021
1. RESUMEN
Los medios de cultivo son mezclas
complejas de sustancias químicas y/o
productos naturales (proteínas,
sangre, suero, etc.) capaces de
soportar el crecimiento de las
bacterias. Estas pueden clasificarse
según sus características
morfológicas, Así mismo, se pueden
clasificar por la tinción de Gram en
grampositivas o gramnegativas,
dependiendo de la presencia de
elementos importantes de la
composición de la pared bacteriana.
Esta práctica de laboratorio busca que
el estudiante desarrolle las
habilidades para realizar una siembra
bacteriana, cultivo bacteriano, y a su
vez la tinción de Gram. Para llevar a
cabo este objetivo, se realizó
primeramente la siembra bacteriana,
proceso en el cual realizamos las
estrías paralelas en la cuarta parte de
la superficie de la placa; Tocando el
área sembrada inicialmente,
cubriendo otro cuarto de placa y el
resto de la superficie sin sembrar.
Para finalmente incubar a 37°C.
Posterior a 24 horas se reflejó la
siembra, por lo cual se procedió a
realizar tinción de Gram: se tomó la
muestra bacteriana del cultivo, se
realizó extensión y fijación, se cubrió
la superficie con cristal violeta
dejándolo actuar por un minuto para
luego continuar con el lavado con
agua, proceso que se repitió seguido
de la adición de lugol, continuando con
Un lavado con alcohol acetona por 30
segundos y lavado con agua.
Finalmente se agregó la safranina, la
cual nuevamente se dejó actuar por un
minuto y se lavó con agua, para dejar
secar el extendido y proseguir con la
observación microscópica de este. Por
medio de la tinción de Gram se
confirmó que los Streptococcus
mutans son bacterias Gram positivas,
y estas poseen una gran variedad de
características morfológicas depen-
diendo del agar correspondiente,
donde se destacó que el Agar MS
(Mitis Salivarius) es el medio de cultivo
más utilizado en la siembra bacteriana
de Streptococcus.
PALABRAS CLAVES
Siembra bacteriana; Agar Sangre;
Agar Mitis Salivarius; Tinción de Gram;
Bacterias Grampositivas;
Streptococcus mutans.
2. ABSTRACT
Culture media are complex mixtures of
chemicals and / or natural products
(proteins, blood, serum, etc.) capable
of supporting the growth of bacteria.
These can be classified according to
their morphological characteristics.
Likewise, they can be classified by
Gram staining as gram-positive or
gram-negative, depending on the
presence of important elements of the
composition of the bacterial wall.
This laboratory practice seeks for the
student to develop the skills to perform
a bacterial seeding, bacterial culture,
and in turn, gram staining. To carry out
this objective, the bacterial seeding
was carried out first, a process in
which we made the parallel striations
on a quarter of the surface of the plate;
Touching the initially seeded area,
covering another quarter of the plate
and the rest of the unseeded area. To
finally incubate at 37 ° C. After 24
hours, the sowing was reflected, for
which a Gram stain was carried out:
the bacterial sample of the culture was
taken, extension and fixation was
carried out, the surface was covered
with crystal violet leaving it to act for a
minute and then continue with washing
with water, a process that was
repeated followed by the addition of
lugol, continuing with a wash with
alcohol acetone for 30 seconds and
wash with water. finally safranin was
added, which again was allowed to act
for a minute and washed with water, to
let the smear dry and continue with the
microscopic observation of it. By
means of gram staining, it was
confirmed that Streptococcus mutans
are Gram positive bacteria, and these
have a great variety of morphological
characteristics depending on the
corresponding agar, where it was
highlighted that MS Agar (Mitis
Salivarius) is the most widely used
culture medium. in Streptococcus
bacterial seeding.
KEYWORDS
Bacterial seeding; Blood Agar; Mitis
Salivarius Agar; Gram stain; Gram-
Positive Bacteria; Streptococcus
mutans.
3. INTRODUCCIÓN
Los medios de cultivo son una mezcla
de nutrientes que, en concentraciones
adecuadas y en condiciones físicas y
óptimas, permiten el crecimiento de
los microorganismos. Son esenciales
en el Laboratorio de Microbiología por
lo que un control en su fabricación,
preparación, conservación y uso,
asegura la exactitud, confiabilidad y
reproducibilidad de los resultados
obtenidos. Estos medios se utilizan
para mantener las cepas, aislar o
identificar microorganismos con varias
finalidades: determinar la existencia
de contaminación de alimentos o
medicamentos; diagnosticar alguna
enfermedad, elaboración de vacunas
bacterianas, etc.
Una de las características más
importante para la identificación de las
bacterias es su morfología, definida
por el tamaño, la forma, el arreglo y la
estructura. Existen bacterias en forma
redondeada denominadas cocos, en
forma cilíndrica, denominadas bacilos
y una tercera morfología como son las
que tienen forma de espirales,
denominadas espirilos. A su vez cada
categoría puede subclasificarse con
base a diferentes arreglos. Estas
características pueden determinarse
examinando muestras al microscopio.
Dado que los microorganismos son
invisibles al ojo humano debido a sus
tamaños celulares y el alto contenido
de agua, se han desarrollado métodos
de tinción para facilitar su observación
al microscopio. Existen una gran
cantidad de colorantes aplicados en la
microbiología, así como diversas
técnicas de tinción, dependiendo del
tipo de microorganismo que desea ser
estudiados y los propósitos
particulares de cada estudio. Para
obtener mayor información sobre la
morfología y composición química de
las bacterias, debe recurrirse a
tinciones diferenciales que involucran
el uso de varios reactivos y éstas
pueden diferenciarse con base al color
que retienen.
La tinción de Gram es un
procedimiento de gran utilidad, es
definida como una tinción diferencial,
ya que utiliza dos colorantes y clasifica
a las bacterias en dos grandes grupos:
bacterias Gram negativas y bacterias
Gram positivas. Los organismos que
retienen el cristal violeta luego de la
adición del agente decolorante, el
alcohol, aparecen como azul oscuro o
violeta, y se designan como Gram
positivos; aquellos que pierden el
cristal violeta y se tiñen con el
colorante secundario, la safranina,
aparecen como rojos y se designan
como Gram negativos. Por lo tanto a
esto se realizará una práctica con el
objetivo que el estudiante logre
desarrollar las habilidades para
realizar siembras bacterianas, cultivos
bacterianos, y a su vez la tinción de
Gram.
4. OBJETIVOS
4.1. OBJETIVO GENERAL
• El estudiante desarrollará las
habilidades para realizar una
siembra bacteriana, cultivo
bacteriano, y a su vez la tinción
de Gram.
4.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS
• Identificar y conocer la tinción de
Gram.
• Identificar las bacterias Gram
positivas y Gram negativas en el
microscopio.
• Lograr el cultivo bacteriano.
• Identificar la morfología
bacteriana de una muestra de
placa dental supragingival.
5. METODOLOGÍA
Para poder realizar la tinción de Gram,
primeramente seleccionamos la
colonia aislada de un cultivo
bacteriano proveniente de una
muestra de placa dental supragingival,
posterior a esto se realizó la siembra
bacteriana en cultivo de Agar Mitis
Salivarius y Agar Sangre. Proceso en
el cual esterilizamos el asa de siembra
(Figura 1), seguidamente se dejó
enfriar y se cargó con la muestra
(Figura 2). Posterior a esto realizamos
las estrías paralelas en la cuarta parte
de la superficie de la placa (Figura 3).
Luego se volvió a esterilizar el asa, se
dejó enfriar y se giró la placa a 90°,
donde se volvió a estriar tocando el
área sembrada inicialmente,
cubriendo otro cuarto de placa (Figura
4). Después sin quemar el asa se
volvió a estriar el resto de la superficie
sin sembrar (Figura 5). Finalmente se
incubó a 37°C (Figura 6).
Posterior a 24 horas se reflejó la
siembra, por lo cual se procedió a
observar las características
morfológicas del cultivo bacteriano.
Seguidamente se realizó la tinción de
Gram: se tomó un portaobjeto limpio y
seco, donde se colocó una gota de
agua (Figura 7). Se esterilizó el asa en
el mechero (Figura 8) y se dejó enfriar.
Posterior a esto se tomó la muestra
bacteriana del cultivo (Figura 9) y
sobre la gota de agua se realizó
la extensión de la muestra (Figura
10). Luego se fijaron las bacterias
flameando el portaobjeto, con el
objetivo de que la muestra no sea
arrastrada durante la tinción (Figura
11). Se ubicó el portaobjeto en un
puente de tinción, donde se cubrió la
superficie con cristal violeta dejándolo
actuar por un minuto (Figura 12) para
luego continuar con el lavado con
agua (Figura 13). Después se le
agregó lugol al portaobjeto (Figura 14)
y nuevamente se dejó actuar por un Figura 2: Carga de la muestra
minuto y se lavó con agua (Figura 15). con el asa de siembra.
Posteriormente se realizó un lavado
con alcohol acetona
aproximadamente por 30 segundos
(Figura 16) y se lavó con agua (Figura
17). Luego se agregó la safranina
(Figura 18), la cual nuevamente se
dejó actuar por un minuto y se lavó con
agua (Figura 19).

Finalmente se colocó el portaobjeto en

un puente de tinción en posición
vertical, dejando que escurriera el
exceso de agua y que se secará el Figura 3: Estrías paralelas en
extendido. Una vez secada la muestra la cuarta parte de la superficie
de la placa.
procedimos a observar en el
microscopio el color de las bacterias
con el objetivo de 100X.

Figura 4: Estrías tocando el

área sembrada inicialmente,
Figura 1: Esterilización del asa cubriendo otro cuarto de placa.
de siembra.
 Figura 5: Estrias en el resto de Figura 8: Esterilización del
la superficie sin sembrar. asa.

Figura 6: Incubación de la Figura 9: Toma de la muestra

siembra a 37°C. bacteriana del cultivo

Figura 7: colocación de gota Figura 10: Extensión de la

de agua en el portaobjetos. muestra en el portaobjeto.
Figura 11: Fijación de las Figura 14: Adición de lugol al
bacterias en el portaobjetos. portaobjeto.

Figura 12: Adición de cristal Figura 15: Lavado del lugol

violeta al portaobjeto. con agua destilada.

Figura 13: Lavado del cristal Figura 16: Lavado con alcohol
violeta con agua destilada. acetona.

Figura 17: Lavado con agua
destilada
Figura 18: Adición de la
safranina al portaobjeto.
Figura 19: Lavado de la
safranina con agua destilada.
6. MARCO TEÓRICO
6.1. Siembra bacteriana:
La siembra bacteriana es introducir
una porción de muestra (inóculo) en
un medio adecuado, con el fin de
iniciar un cultivo microbiano, para su
desarrollo y multiplicación. Existen
diferentes tipos de siembra de
acuerdo al medio utilizado y los
requerimientos del microorganismos a
estudiar, entre ellos se encuentran
siembra por inmersión, siembra en
doble capa, siembra en superficie y
siembra en estría.
6.2. Medios de cultivo
bacteriano:
Un medio de cultivo es un conjunto de
nutrientes, factores de crecimiento y
otros componentes que crean
condiciones necesarias para el
crecimiento de los microorganismos
en el laboratorio, con el fin de aislar
diferentes especies bacterianas,
identificarlas y realizar estudios
complementarios.
Según su utilización y composición los
medios de cultivos se pueden
clasificar en:
Medios simples: los cuales poseen
requisitos nutricionales para permitir el
desarrollo bacteriano general,
ejemplo: agar nutritivo, caldo nutritivo
entre otros.
Los medios enriquecidos: favorecen el
crecimiento de un determinado tipo de
microorganismos sin llegar a inhibir
totalmente el crecimiento de los
demás, a estos se le añade elementos
como sangre, suero, entre otros.
Los medios selectivos: permiten el
crecimiento de un tipo de
microorganismos determinado e
Inhibiendo el desarrollo de los demás,
este se consigue añadiendo al agar
nutritivo, compuesto químicos nocivos
para algunas bacterias cuyo
crecimiento no es de interés.
Los medios diferenciales: son aquellos
en los que se pone de manifiesto
propiedades que un determinado tipo
de microorganismos posee.
De igual forma se pueden clasificar
según su consistencia ya sean
líquidos, sólidos o semisólidos.
6.3. Tinción de Gram:
La tinción de Gram es un
procedimiento de gran utilidad
empleado en laboratorios donde se
manejan pruebas microbiológicas.
Este proceso es definido como una
tinción diferencial, ya que utiliza dos
colorantes y clasifica a las bacterias en
dos grandes grupos: bacterias Gram
positivas y Gram negativas. Este
procedimiento fue desarrollado por el
científico danes Hans Christisn Gram
en el año 1884, hoy en día es una de
las tinciones más utilizada
universalmente debido a lo
económico, sencillo y eficaz que
resulta. En microbiología clínica es de
gran importancia ya que a partir de
muestras clínicas se puede saber de
manera rápida las características de la
muestra y hacer una diferencia de los
potenciales microorganismos
causantes de una infección. Los
principios de la tinción de Gram están
basados en las características de la
pared celular de las bacterias, lo cual
le confiere propiedades determinantes
a cada microorganismo.
6.4. Bacterias Gram positivas:
Las bacterias Gram positivas son más
susceptibles al tratamiento con los
antibióticos que bacterias Gram
negativas por falta de la membrana
exterior aun así las bacterias Gram
positivas poseen una pared celular
gruesa constituida por
peptidoglicano, estas bacterias
también se clasifican por el color que
adquieren después del proceso de
tinción de Gram tornándose a un color
azul o violeta.
6.5. Bacterias Gram negativas :
Las bacterias Gram negativas son a
menudo patógenas y contienen
endotoxinas dentro de sus
membranas exteriores. La estructura
de la pared celular de bacterias Gram
negativas también consulta una
capacidad creciente de resistir los
antibióticos. La pared celular de estas
bacterias Gram negativas está
constituida por una capa fina de
peptidoglucano y una membrana
celular externa, estas bacterias
también se clasifican por el color que
adquieren después del proceso de
tinción de Gram tornándose a un color
rojo.
6.6. Streptococcus mutans:
Streptococcus mutans es uno de los
microorganismos cariogénicos
asociados a la caries dental, este
microorganismo es un coco Gram
positivo, dispuesto en cadena, no
móvil, catalasa negativo, productor
rápido de ácido láctico con capacidad
de cambiar un medio de pH 7 a pH 4.2
en, aproximadamente, 24 horas.
Fermentador de glucosa, lactosa,
rafinosa, manitol, inulina y salicina con
la producción de ácido. Normalmente
no desamina la arginina para producir
amoniaco. Usualmente no producen ni
hemólisis ni decoloración en agar
sangre, es principalmente alfa o
gamma hemolítico en agar sangre de
cordero, aunque se han reportado
pocas cepas hemolíticas.

7. RESULTADOS
Al observar la siembra bacteriana se
obtuvieron colonias con
características que distinguen al
Streptococcus mutans. Este presenta Figura 21: Colonias de S.
características elevadas, convexa, mutans incubadas en agar MS.
ondulada, opaca, azul, márgenes
rugosos y superficie granular. Además
cuando producen muchos glucanos se
detectan como una burbuja de color
brillante.

Al momento de obtener la siembra

bacteriana en agar sangre y agar MS,
se observó diferencias en el color de
las colonias, esto debido al agar donde
se hizo la siembra bacteriana. En el
agar MS se reflejaron colonias
negruzcas o azul intenso, lisas,
prominentes, pocas con bordes
definidos y firmemente adheridas al
agar. En el agar sangre se reflejaron
colonias altas, convexas, en forma de
cojín y opacas.
Figura 22: Colonias lisas y
rugosas de S. mutans incubadas
en agar MS (estereomicroscopio).
Al momento de pasar el portaobjetos
al microscopio se observó bacterias
Gram positivas de color morado
correspondientes al Streptococcus
mutans, el cual está dispuesto en
cadenas cortas.

Figura 20: Colonias de S.

mutans incubadas en sangre Figura 23: Células esféricas de
Agar BHI Streptococcus mutans (tinción
de Gram)

Figura 24: S. mutans en
cadenas cortas (SEM).
8. DISCUSIÓN
A través de los resultados obtenidos
en esta práctica se confirmó que las
colonias de Streptococcus mutans
pueden crecer en agar sangre
después de 24 h de incubación
anaeróbica. Estas pueden ser
regulares y suaves o irregulares,
duras y pegajosas. El diámetro de las
colonias es 0,5–1,0 mm. En la mayoría
de las cepas se pueden observar
zonas de hemólisis α o γ alrededor de
las colonias, mientras que las zonas β-
hemolíticas también se puede
observar con las colonias de algunas
cepas, de igual forma se destaca que
los streptococcus no producen ni
hemólisis ni decoloración en agar
sangre. Por otro lado el agar MS es el
medio de cultivo más usado para aislar
S. mutans y otras especies orales de
streptococcus esto se da por el motivo
que el agar MS contiene sacarosa.
Al comparar la siembra bacteriana en
agar sangre y agar MS, se observó
diferencias en el color de las colonias
debido al agar correspondiente. En el
agar MS se reflejaron colonias
negruzcas o azul intenso, lisas,
prominentes, pocas con bordes
definidos y firmemente adheridas al
agar. Al contrario del agar sangre
donde se reflejaron colonias altas,
convexas, en forma de cojín y opacas
con un aspecto que recuerda al vidrio
esmerilado.
Nuestros resultados confirmaron que
las bacterias Streptococcus mutans
son bacterias Gram positivas debido a
que están formadas por un 90% de
peptidoglicano, siendo éste el principal
componente que permite
diferenciarlas con la pared de las
Gram negativas, ya que al teñirlas, el
grosor que esta pared le proporciona,
logra mantener la coloración del cristal
violeta en el interior de la célula. La
capa de peptidoglicano está
compuesta de ácidos teicoicos, los
cuales están presentes en pequeñas
cantidades. Éstos se presentan
embebidos en la pared de la bacteria
como polisacáridos ácidos. Están
cargados negativamente por lo tanto
contribuyen a la carga negativa de la
pared celular Gram-positiva y también
pueden proporcionar soporte
estructural a la pared celular.
9. CONCLUSIÓN
Finalmente a través de esta práctica
se aprendió a realizar la siembra y
cultivo bacteriano, donde se destacó
que el Agar Mitis Salivarius es el
medio de cultivo más utilizado en la
siembra bacteriana de Streptococcus.
Asimismo se aprendió a realizar la
tinción de Gram, dado que este es un
procedimiento importante en el
laboratorio. De igual manera se
reconoció la morfología a nivel
macroscópico y microscópico de las
bacterias Streptococcus mutans
siendo estas bacterias Gram
positivas.
10. CUESTIONARIO
De los agares mencionados ¿Cuál
es el más utilizado para aislar
Streptococcus mutans?
El Agar Mitis Salivarius es el medio
más ampliamente usado para aislar S.
mutans y otras especies orales de
estreptococos. Aunque esté
originalmente fue desarrollado para
aislar estreptococos fecales, su uso ha
predominado sobre otros medios de
cultivo para el aislamiento de
estreptococos orales, incluyendo
Streptococcus mutans. El agar MS ha
sido modificado para ser más selectivo
en el aislamiento de S. mutans
adicionando tanta sulfonamida (Agar
MC), bacitracina (Agar MSB),
polimixina o aun sacarosa (MS40S).
Los métodos de recuento de colonias
permiten determinar el grado de
colonización producida por
Streptococcus mutans según las
edades, siendo de gran utilidad para
identificar la población de alto riesgo
de caries dentales y su aplicación
permitiría desarrollar programas de
prevención en salud oral en
poblaciones específicas y vulnerables.
¿Qué papel tiene el alcohol-acetona
en la tinción de Gram?
El alcohol-acetona, se encarga de
deshidratar la pared bacteriana y
cierra los poros de la misma, también
destruye la membrana externa
(presente en las bacterias Gram
negativas).
¿Cuál es la importancia de la
técnica de Gram?
La gran aportación práctica de la
tinción de Gram es que permite
determinar el tipo de antibiótico así
como su eficacia. El antibiótico de
elección ha de ser capaz de atravesar
la pared bacteriana, en función de si la
bacteriana es Gram positiva o
negativa se seleccionará el antibiótico
más eficaz.
¿Qué función tiene el
peptidoglicano en la tinción de
Gram?
La tinción de Gram es un tipo de
tinción que se realiza sobre las
bacterias para observarlas mejor bajo
el microscopio. Según la distribución
del peptidoglicano de la pared celular
que las envuelve, se tiñen de una
forma u otra. Así, Las Gram negativas
están formadas por una pared más
fina formada por menos capas de
peptidoglicano y una segunda
membrana rica en lípidos (que repele
la tinción Gram) por lo que las
bacterias no se tiñen mediante esta
técnica, al microscopio aparecen
incoloras. Las Gram positivas tienen
una pared celular mucho más gruesa,
formada por un gran número de capas
de peptidoglicanos entre las que se
inserta la tinción Gram, dando un color
violeta intenso al microscopio y se
clasifican como Gram +.
¿Dónde se encuentra el
Streptococcus mutans?
Streptococcus mutans es una bacteria
Gram positiva, anaerobia facultativa
que se encuentra normalmente en la
cavidad bucal humana, formando
parte de la placa dental o biofilm
dental. Se encuentra de forma
permanente en la cavidad oral
después de la erupción dental, debido
a que requiere la presencia de tejido
duro no descamativo para colonizar.
El S. mutans se asocia al inicio y
desarrollo de la caries dental y es el
que más tiene influencia en el
desarrollo de dicha enfermedad.
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