Ténicas histológicas

1. INTRODUCCIÓN

En estas páginas dedicadas a las técnicas histológicas vamos a describir los procedimientos
experimentales necesarios para obtener secciones teñidas y listas para observar al microscopio partiendo
de tejidos vivos extraídos de un animal o de una planta. Por tanto, dedicaremos espacios a la obtención,
fijación, inclusión, corte y tinción de los tejidos. Todos estos apartados seguirán el mismo esquema que
los capítulos dedicados a los tejidos o a la célula, partir de un esquema básico y ampliar la información
sucesivamente en páginas adicionales. No dedicaremos demasiado espacio a los instrumentos, desde el
punto de vista operativo, pero sí a la conveniencia de su uso y a sus capacidades. Además, se incluye un
apartado de protocolos y recetas donde se incorporan los tiempos, productos y manera de proceder para
llevar a cabo las tinciones más comunes y cómo preparar sus reactivos.También se han añadido
algunos vídeos explicativos.

La mayoría de las técnicas histológicas van encaminadas a preparar el tejido para su observación con
el microscopio, bien sea éste óptico o electrónico. Ello es debido a que la composición de los tejidos,
salvo contadas ocasiones, no tienen contraste ni colores que permitan diferenciar sus estructuras de una
manera clara mediante la observación directa con los microscopios. Por ello hay procesar las muestras,
primero para que no se se deterioren y después para resaltar sus estructuras y poder estudiarlas en detalle.

Existen procedimientos rápidos y simples para la observación de tejidos y células vivas que reciben
el nombre de vitales. Las intravitales permiten la observación dentro del cuerpo. Por ejemplo, la
observación del flujo sanguíneo en capilares del sistema circulatorio. Otra forma de observar células o
tejidos vivos es mediante las técnicas histológicas supravitales, en los que las células y los tejidos se
mantienen o se hacen crecer fuera del organismo, como es el caso de los cultivos de células y de tejidos.

Las técnicas histológicas postvitales son aquellas en las que las células mueren durante el proceso,
pero las características morfológicas y moleculares que poseían en estado vivo se conservan lo mejor
posible, lo que depende del tipo de técnica. Estas páginas estarán dedicadas a este tipo de técnicas, puesto
que son las más comúnmente usadas en los laboratorios de histología.
 P RO CESO H ISTO LÓ G ICO
Denominamos proceso histológico a una serie de métodos y técnicas utilizados para poder
estudiar las características morfológicas y moleculares de los tejidos. Hay diversos caminos para
estudiar los tejidos, es decir, series de técnicas que se utilizarán dependiendo de qué
característica deseemos observar. En el siguiente esquema se muestran los métodos y técnicas
comúnmente empleados durante el procesamiento de los tejidos para su observación con los
microscopios óptico o electrónico. Sin embargo, hay que tener en cuenta que existen muchas
variantes a estos "caminos" y su elección dependerá del resultado final que queramos obtener.

Esquema del proceso histológico.

 El proceso histológico comienza con la obtención del tejido objeto de estudio. En el caso
de los tejidos vegetales directamente se toman muestras de los distintos órganos que componen
el cuerpo de la planta, mientras que para los tejidos animales podemos optar por dos opciones:
coger una porción del tejido u órgano y procesarla o procesar primero el animal completo y
luego extraer la muestra que nos interese. En cualquier caso las muestras son habitualmente
fijadas con unas soluciones líquidas denominadas fijadores, las cuales se usan para mantener las
estructuras celulares y moleculares inalterables durante el procesamiento posterior y con una
organización lo más parecida posible a como se encontraban en la muestra viva. También
podemos fijar las moléculas de los tejidos por congelación rápida. Fijar un tejido es como hacer
una fotografía de dicho tejido, su estructura se mantendrá hasta su observación. La fijación por
congelación se emplea cuando la fijación química o los procesos histológicos posteriores alteran
las características de la muestra que queremos estudiar, por ejemplo una molécula sensible a
dichos tratamientos.

Normalmente, tras la fijación se procede a incluir el tejido para posteriormente obtener

secciones. Cuanto más delgada queramos que sea nuestra sección más tenemos que endurecer
nuestra muestra. Esto se consigue embebiendo el tejido con sustancias líquidas que
posteriormente polimerizarán (resinas) o se volverán consistentes (ceras). También se puede
conseguir el mismo efecto mediante congelación rápida. Cortes más gruesos de 40 µm se
pueden cortar sin necesidad de inclusión usando el vibratomo. Los medios de inclusión no son
normalmente hidrosolubles por lo que tendremos que sustituir el agua de los tejidos por
solventes orgánicos liposolubles y posteriormente sustituirlos por el medio de inclusión.

Tras la inclusión o la congelación se procede a cortar los tejidos, es decir, obtener

secciones. Existen diferentes aparatos de corte que permiten conseguir secciones ultrafinas (del
orden de nanometros), semifinas (de 0.5 a 2 µm), finas (entre unas 3 y 10 µm) y gruesas
(mayores a 10 µm). Habitualmente las secciones se procesan para poder observarlas y
estudiarlas, aunque ciertos tipos de microscopía, por ejemplo con contraste de fase, permiten
observar secciones de tejidos sin procesar. Normalmente las secciones se tiñen con colorantes
que son hidrosolubles, por lo que hay que eliminar el medio de inclusión para que los colorantes
pueden unirse al tejido. Las secciones ultrafinas (observadas con el microscopio electrónico) o
semifinas (observadas con el microscopio óptico) se pueden contrastar con metales pesados o
con colorantes, respectivamente, sin necesidad de eliminar el medio de inclusión.

Los tejidos procesados se observan con los microscopios. Existen dos tipos básicos de
microscopios: óptico y electrónico. Los primeros ofrecen una gran versatilidad en cuanto a
modos de observar los tejidos: campo claro, fluorescencia, contraste de fase, polarización o
contraste de interferencia diferencial, mientras que los segundos permiten un gran poder de
resolución, pudiéndose observar características ultraestructurales.
 Como dijimos al comienzo existen múltiples variaciones sobre este esquema general de
procesamiento histológico. Por ejemplo, se pueden observar tejidos con el microscopio
electrónico de barrido sin necesidad de incluir ni cortar, pero sólo observaremos superficies. En
las siguientes páginas veremos con cierto detalle algunas de las técnicas más empleadas para la
observación de los tejidos.

2. F IJACIÓ N
Todos los tejidos, bien cuando se extraen de un organismo o bien cuando el organismo en
el que están muere, sufren dos tipos de procesos degradativos: autolisis por acción de enzimas
intracelulares, es decir, autodigestión, y putrefacción por acción bacteriana. Además, el
procesamiento histológico posterior del tejido para poner de manifiesto y observar determinadas
estructuras supone una metodología que puede degradar las estructuras tisulares. Fijar un tejido
es preservar sus características morfológicas y moleculares lo más parecidas posibles a las que
poseía en su estado vivo. Es como hacer una fotografía del tejido vivo y poder observarla, tras
algún tratamiento, con el microscopio. Así, los fijadores deben evitar la autolisis, proteger frente
a ataques bacterianos, insolubilizar elementos solubles que se quieren estudiar, evitar
distorsiones y retracciones tisulares, penetrar y preparar el tejido para poder llevar a cabo
tinciones específicas posteriores, si es necesario, etcétera.

No existe un fijador universal, ni un método de fijación único. Incluso podemos usar varios
fijadores secuencialmente según nuestras necesidades. La elección depende de las características
fijadoras que necesitemos. Por ejemplo, si queremos estudiar actividades enzimáticas debemos
usar un fijador que no nos altere el centro activo de las enzimas en las que estamos interesados,
y quizá para ello tengamos que sacrificar en cierta medida la morfología tisular. La mayoría de
los fijadores no preservan los lípidos, los cuales permanecerán en el tejido mientras no usemos
disolventes. Así, si queremos estudiar la ultraestructura celular debemos usar fijadores que fijen
los lípidos y que por tanto protejan a las membranas celulares durante el procesamiento de
inclusión en resinas, que conlleva el uso de solventes orgánicos. Asimismo, la mayoría de los
fijadores no fijan los carbohidratos pero éstos permanecen en el tejido porque están unidos a las
proteínas. Por otra parte, si queremos teñir un determinado componente celular difícilmente
teñible quizá debamos usar un fijador que lo modifique para que sea reconocido más fácilmente
por los colorantes.

En cualquier caso hay características de los fijadores que tenemos que tener en cuenta antes
de su uso:

Velocidad de penetración. El proceso de fijación ha de ser rápido y la velocidad de

difusión de la sustancia fijadora en los tejidos es un factor determinante. Este
parámetro condiciona el tamaño de la pieza que queramos fijar, más pequeña cuanto menor sea
la velocidad de difusión del fijador empleado, y también determina el tiempo de fijación, mayor
cuanto menor tiempo de difusión.

Velocidad de fijación. Esta característica no dependen de la velocidad de difusión sino de

las propiedades químicas del fijador y condiciona el tiempo que debe permanecer el tejido en
contacto con el fijador.

Endurecimiento. Los fijadores generalmente endurecen los tejidos, lo cual depende del
tipo de fijador y del tiempo que el tejido haya estado expuesto a él.

Ósmosis y pH. Es indispensable evitar cambios de volumen en la células producidos por

una osmolaridad del fijador diferente a la del tejido. A las alteraciones artificiales producidas
durante el procesamiento histológico se les llama artefactos. Por tanto, en muchas ocasiones hay
que equilibrar la osmolaridad de las soluciones fijadoras y la de los tejidos a fijar. No es
necesario añadir sustancias complejas. Por ejemplo, para los tejidos de animales terrestres basta
con añadir 0.9 % de cloruro sódico. Son sales que no afectan a la capacidad del fijador.
Normalmente se suelen usar soluciones tamponadoras a un pH semejante al del tejido e
isoosmóticas con dicho tejido.

Efecto mordiente. Algunas estructuras tisulares son difíciles de teñir puesto que tienen
poca apetencia por los colorantes. Esta apetencia puede ser incrementada con un tratamiento
previo. Algunos fijadores, además de fijar, modifican químicamente a ciertas estructuras
celulares para que posteriormente puedan unirse a ellas los colorantes. Este este tipo de
modificación química se le denomina efecto mordiente.

Artefactos. Los procesos de fijación pueden acarrear alteraciones tisulares como

variaciones morfológicas, cristalización de compuestos, desplazamiento de sustancias, etcétera.
Estos cambios pueden producirse por las características del fijador o por un mal uso de éste. En
cualquier caso deben tenerse en cuenta para no describir como características tisulares lo que es
un artefacto introducido durante la fijación. Una consecuencia frecuente son las retracciones o
encogimientos de la muestra, lo cual se puede comprobar midiendo la muestra antes y después
de la fijación. No debe asumirse que las posibles retracciones afecten a todos los tejidos por
igual.

M ÉTO DO S de FIJACIÓ N
Existen diferentes formas de fijar los tejidos dependiendo del tipo de fijador, de la
estructura a fijar y de lo queramos observar. Los métodos de fijación se pueden clasificar en dos
tipos: físicos y químicos.
 Físicos

Los fijadores físicos se basan bien en una congelación muy rápida del tejido o bien en la
aplicación de calor elevado. Se utilizan cuando los fijadores químicos alteran la estructuras que
queremos observar, cuando necesitamos una fijación muy rápida, o cuando el tipo de tejido y la
técnica que usaremos lo requieran.

La congelación rápida es un buen método de preservación de las características

moleculares, puesto que no se verán alteradas por ninguna sustancia química. La congelación es
conveniente que sea rápida puesto que así se impide la formación de grandes cristales de hielo
que nos destrozarían la estructura del tejido. Por ello es conveniente no usar piezas mayores a 2
mm para que no se retarde la congelación de las zonas centrales de la pieza. Asimismo, cuando
sea posible, es conveniente embeber la muestra en anticongelantes, también llamados
crioprotectores. Una una congelación rápida se consigue sumergiendo la pieza en isopentano (-
170 ºC) enfriado con nitrógeno líquido, o colocando la muestra sobre un metal, el cual se
sumerge parcialmente en nitrógeno líquido (-196 ºC), en mezclas de hielo seco y acetona (-70
ºC) o incluso en helio líquido (-268 ºC). La crioprotección es siempre recomendable, aunque no
siempre es posible. Normalmente se emplean como agentes crioprotectores al dimetilsulfóxido,
el glicerol y la sacarosa, bien solos o mezclados en diferentes concentraciones. Hay que tener en
cuenta, sin embargo, que una vez que el tejido se haya cortado se vuelve a descongelar y hay
que protegerlo de los procesos de degradación. Existen variantes a la técnica de congelación
como son la criodesecación o liofilización y la criosustitución. La criodesecación parte de tejido
previamente congelado al que posteriormente se le sublima el hielo, es decir, el agua pasa de
estado sólido a gaseoso sin pasar por estado líquido. Al eliminar el agua se impide que se den
reacciones químicas, por lo que, además de la fijación, este método preserva el tejido en el
tiempo. La criosustitucióntambién parte de tejido congelado pero en este caso se produce una
sustitución lenta del hielo por una solución fijadora. Con ello se posibilita una fijación química
sobre un material que no ha sufrido deterioro puesto que está congelado.

La fijación por calor no es frecuente en histología, puesto que produce deterioros de los
tejidos. Su efecto es la coagulación de proteínas y disolución de lípidos. Sin embargo, se emplea
para la observación de microorganismos, ya que preserva la forma de éstos y sirve para su
identificación. Hoy en día, sin embargo, se suele emplear el calor como un complemento a la
fijación química. Así, las muestras inmersas en un fijador se introducen en un microondas y se
llevan hasta temperaturas de unos 55 ºC. Esta temperatura no produce artefactos y tiene dos
ventajas: incrementa la velocidad de fijación y reduce el tiempo fijación desde varias horas o
días a decenas de minutos. El uso del microondas permite que el calor sea homogéneo en toda la
muestra de forma inmediata (si se hiciera en un baño caliente habría un gradiente de calor en la
muestra desde la parte externa a la más interna.). Se cree que el incremento de la velocidad de
 fijación se debe sólo al calor generado y no al efecto directo de las microondas. Las microondas
se pueden usar también para otros pasos del proceso histológico como la tinción.

Químicos

Los métodos químicos utilizan soluciones acuosas compuestas por moléculas fijadoras que
establecen puentes entre las moléculas del tejido, manteniéndolas en sus lugares originales e
impidiendo su degradación. Hay que considerar que los fijadores químicos afectan al tejidos
tanto física como químicamente. Los efectos físicos suelen ser retracciones o distensiones, y la
mayoría endurecen el tejido. Hay dos métodos básicos de fijación con fijadores
líquidos: inmersión y perfusión. En cualquier caso el fijador debe llegar a todas las partes el
tejido lo más rápidamente posible.

Inmersión. En el método de inmersión las piezas de tejido se sumergen en la solución

fijadora. En algunos casos se necesitan fijar extensiones de sangre o cortes por congelación sin
fijación previa. En estos casos siempre se fijan por inmersión en la sustancia fijadora. Hay que
tener en cuenta algunas precauciones.

1) Las piezas de tejido no deberían superar los 0.5 cm de espesor para que el fijador
alcance el interior de la pieza antes de que ésta comience a deteriorarse. La velocidad
de penetración del fijador depende de cada fijador y de las características del tejido.
Esta velocidad nos condicionará el tamaño de la muestra. Para fijadores lentos se
recomiendan piezas de 0.2 cm de tamaño. Esto también se ve afectado por el tipo de
tejido. Por ejemplo, si es poroso o con grandes espacios la difusión del fijador será
más rápida.

Fijación por inmersión.

2) El volumen recomendado de fijador es de 10 a 20 veces superior al volumen de la

pieza.

3) La osmolaridad del tejido y de la solución fijadora deben estar equilibradas.

4) El pH del fijador debe ser próximo al fisiológico.

 5) El tiempo de fijación, para una mismo tipo de muestra, depende de cada tipo de
fijador: velocidad de difusión y velocidad de fijación (la rapidez e intensidad con la
que establece puentes o coagula proteínas). Debe ser suficiente para que la muestra
quede bien fijada pero no excesivo para evitar deterioros o alteraciones del tejido. Una
agitación suave durante la fijación ayuda a la penetración del fijador y disminuye el
tiempo. En general no se recomiendan fijaciones mayores de 24 horas, excepto en
algunos casos como el formaldehído, para el que se puede emplear una semana de
fijación.

Fijación por perfusión de un órgano. Mediante perfusión se consigue que la solución

fijadora llegue a todas las células del órgano a través del sistema sanguíneo. Mediante
una bomba peristáltica se introduce la solución fijadora a través de la arteria que irriga el
órgano. Se obturan todos aquellos vasos arteriales que no conducen al órgano.

Perfusión. Por este procedimiento la solución fijadora se introduce a través del sistema
circulatorio por el cual accede a todas las células del tejido gracias a la red de capilares.
Mediante este método se puede fijar un animal completo introduciendo la solución fijadora a
través del ventrículo izquierdo del corazón. El fijador llegará a todas las células irrigadas por la
sangre bombeada por dicho ventrículo (circuito corporal). Si se quieren fijar los pulmones habría
que introducir el fijador por el ventrículo derecho. También podemos fijar un único órgano en el
caso de que podamos introducir la solución fijadora en la arteria principal que irriga dicho
órgano. La perfusión no siempre es posible en algunos casos como en muchas biopsias o en los
tejidos vegetales.
 El método de fijación por perfusión es mucho más efectivo que el de inmersión ya que la
solución fijadora llega rápidamente a escasa distancia de todas las células de la estructura
perfundida. Por tanto, la velocidad de penetración del fijador no es una condición limitante.

Antes de introducir el fijador en el sistema de vasos sanguíneos hay que eliminar

previamente la sangre con una solución de lavado oxigenada, de otra manera su interacción con
el fijador produce trombos que impedirían la fijación de determinadas zonas del animal o del
órgano. Respecto a las precauciones mencionadas anteriormente en el método de inmersión
debemos cuidar aquí también la osmolaridad, el pH y el tiempo de fijación.

Fijación por perfusión de un organismo completo. Mediante este tipo de perfusión se

introduce la solución fijadora en el sistema sanguíneo. La bomba peristáltica aporta la
presión suficiente para permitir al fijador entrar a través del ventrículo izquierdo (Vi) y
pasar a la aorta, desde la cual se distribuye por todo el cuerpo (excepto por el circuito
pulmonar). Tras pasar por la red capilar la solución fijadora pasa a los vasos venosos que
terminan por verter su contenido en la aurícula derecha (Ad). A esta cavidad hay que
hacerle una abertura para que la solución fijadora, una vez realizada su función, salga del
circuito. Ai: aurícula izquierda; Vd: ventrículo derecho.

Este método de fijación por perfusión requiere conocer la presión a la que se va a introducir
la solución fijadora en el animal o estructura, la cual debe ser similar a la que posee la presión
sanguínea normal en estado vivo. La presión que ejercerá la solución fijadora se puede regular
mediante bombas peristálticas (ver figura) o por gravedad, es decir, variando la altura a la cual
se coloca la solución fijadora respecto a la del animal. Esto es importante porque una presión
muy baja podría impedir que la solución fijadora alcanzara todas las partes de la estructura y un
presión muy alta podría provocar roturas de los vasos sanguíneos y de la propia estructura
tisular.

fijas.

T aquí están muchos fijadores descritos en los libros de métodos histológicos. En esta página, se menci
fijadores más comunes utilizados en los laboratorios de histología. Estos han demostrado ser los más adecua
mejor conservación de las características del tejido. Los fijadores químicos son los más utilizados, ya sea com
componente o como soluciones que contienen varios fijadores.

C onsiderando el mecanismo de fijación, fijadores se puede clasificar en dos tipos: coagulante y

reticulación. Los fijadores de coagulantes eliminan el agua de los tejidos, lo que conduce a la coagulación y
desnaturalización de las proteínas, principalmente en la matriz extracelular. Los fijadores de reticulación form
químicos entre las moléculas del tejido. Los fijadores alcohólicos son coagulantes, como Bouin y Carnoy, m
formaldehído y el glutaraldehído son fijadores reticulantes. A veces, se utiliza una mezcla de los dos tipos de

Los aditivos también se clasifican como aditivos y no aditivos. Los fijadores aditivos secombinan con
del tejido para que el fijador, o algunos de sus componentes, se convierta en parte del tejido y se procese en l
pasos del protocolo histológico. Son principalmente fijadores de reticulación y algunos fijadores de
coagulante. Los fijadores no aditivos , una vez que se realiza la fijación, se eliminan del tejido en los pasos p
procesamiento del tejido. El alcohol y el ácido acético son ejemplos de fijadores no aditivos.

¡W arning! La mayoría de las soluciones fijadoras son tóxicas por inhalación o contacto con la piel, al
son cancerígenas. Es importante seguir las pautas de seguridad para manipular estas sustancias.

Fijadores
Etanol: CH 3 -CH 2 -OH

E thanol, metanol y acetona . Su mecanismo de fijación es por deshidratación y coagulación de proteín

principalmente proteínas citosólicas. Los lípidos se extraen de los tejidos, pero los carbohidratos no se ven af
metanol es mejor fijador que el etanol porque el tejido no está endurecido y se conserva mejor. En general, s
fijadores para muestras de tamaño pequeño, para conservar proteínas, como enzimas, glucógeno y algunos p
frotis de sangre y las secciones de tejido congelado de muestras no fijadas generalmente se fijan con estos fij
hacen la deshidratación y la fijación al mismo tiempo, pueden usarse para conservar las muestras. Sin embar
inconveniente, normalmente producen endurecimiento y retracción en el tejido y carecen de efecto mordaz.

Ácido acético: CH 3 COOH

Un ácido cético . El efecto del ácido acético en los tejidos no es una fijación directa, sino un cambio d
coloidal de las proteínas. El ácido acético se utiliza en una concentración de 1 a 5%. Es un muy buen fijador
nucleicos y las nucleoproteínas . Como inconvenientes, el ácido acético destruye las mitocondrias y no fija b
membranas y el citoplasma. Comúnmente se combina con otros fijadores como Bouin (formaldehído + ácido
pícrico) y FAA (formaldehído + ácido acético + etanol). En algunas soluciones fijadoras se usa para contrarr
artefactos que pueden causar etanol o ácido pícrico.
 Z inc cloruro y sulfato de zinc . Como fijador, las sales de zinc se utilizaron hace mucho tiempo, y más
convirtieron en un componente de varias soluciones fijadoras. Actualmente, se combinan con paraformaldeh
paraformaldehído con la fijación y preservan los antígenos tisulares para técnicas inmunohistoquímicas al m
efecto de enmascaramiento de antígenos del paraformaldehído. Las sales de mercurio, que se usaron en las p
soluciones fijadoras, han sido reemplazadas por sales de zinc. Los fijadores que contienen sales de zinc no se
tampón fosfato, ya que es común para otras sustancias fijadoras. Además, después de la fijación, el zinc debe
la muestra con lavados a fondo en agua destilada.

Ácido pícrico: C 6 H 2 OH (NO 2 ) 3

P ácido icric . La fijación por ácido pícrico está mediada por la coagulación de proteínas producidas po
picrato. Normalmente, el 2% al 15% de una solución saturada de ácido pícrico se combina con otros fijadore
tiempo de fijación se establece correctamente, el ácido pícrico es un buen fijador para preservar la estructura
como el glucógeno y los lípidos. Tiene un efecto mordiente , que es necesario para algunos tintes de varios m
tinción post-incrustación. Es una buena práctica lavar bien las muestras para eliminar el ácido pícrico antes d
de parafina, ya que el ácido pícrico dificulta la infiltración de la parafina. Bouin es un fijador ampliamente u
contiene ácido pícrico.
 3. INCLUSIÓ N
Una vez fijado el tejido tenemos que procesarlo para su observación con el microscopio.
Ello implica hacer secciones para teñirlas primero y posteriormente observarlas. Como regla
general se procede al endurecimiento de la muestra para poder obtener dichas secciones. La
regla general es que cuanto más delgada queramos una sección más consistente debe ser la
muestra de la que se obtiene. Los tejidos se endurecen a consecuencia de la fijación, pero esta
dureza no es muy alta e impide la obtención de cortes generalmente más delgados que 20 o 30
µm. Sólo en el caso de que queramos trabajar con secciones relativamente gruesas (entre 30 y
200 µm) se puede aprovechar el endurecimiento provocado por el fijador y obtener dichas
secciones con el vibratomo☆. Este tipo de aparato se utiliza en ciertas técnicas donde es necesaria
una buena preservación molecular. Sin embargo, en muchos casos necesitamos endurecer más el
tejido para obtener secciones más finas, lo cual se puede hacer de dos formas: por congelación o
por inclusión.

La congelación de los tejidos previamente fijados permite la obtención de secciones que

pueden ir desde unas 50 µm hasta decenas de nm de grosor, para lo que se utilizan diferentes
aparatos: microtomo de congelación☆ para secciones de decenas de µm, criostato para secciones
de entre 5 y 20 µm y ultracriotomo para secciones ultrafinas del orden de nm. Para evitar los
daños que se producen durante los procesos de congelación, como la formación de cristales de
hielo que nos agujerean los tejidos, se pueden usar diversas soluciones. a) Anticongelantes que
impidan la formación de cristales, siendo el crioprotector más usado la sacarosa al 30 %, aunque
también se usa el dimetil sulfóxido, el glicerol, etilén glicol y otros. La elección de uno u otro
depende del tipo de muestra y de la técnica que se vaya a usar. b) Una congelación lo más rápida
posible, por ejemplo, con nitrógeno líquido. Cuanto más rápida es la congelación menores son
las dimensiones de los cristales de agua formados, y menores los daños en el tejido.
Se pueden obtener secciones de grosor variable utilizando diferentes métodos. Secciones
más finas se obtienen endureciendo más el tejido. Esto se puede conseguir mediante la
congelación o embebiendo el tejido en sustancias que solidifican como la parafina o
ciertas resinas. Téngase en cuenta que las dimensiones de los cortes y objetos que se
muestran en este dibujo no están a escala. Una rejilla es mucho más pequeña que un
portaobjetos. Las dimensiones en µm y nm se refieren al espesor de las secciones.

La inclusión es el método más común de endurecer el tejido y consiste en infiltrar la

muestra con sustancias líquidas que tras un proceso de polimerización o enfriamiento se
solidifican, sin afectar a las características del tejido. Con ello se consigue obtener cortes del
orden de µm a nm, según el medio de inclusión, sin que el tejido se rompa o se deteriore.
Además, son un buen método para preservar las muestras durante largos periodos de tiempo.
Existen diferentes sustancias o medios de inclusión dependiendo del grosor del corte y de la
técnica que necesitemos realizar. Cuando se quieren hacer secciones para su observación con
el microscopio óptico los medios de inclusión más frecuentemente usados son la parafina☆ o la
celoidina, mientras que si vamos a realizar observaciones con el microscopio electrónico☆ la
inclusión se realiza con resinas☆, principalmente de tipo acríclicas o epoxy. La mayoría de estas
sustancias no son hidrosolubles, es decir, no son miscibles con el agua, luego si queremos que la
sustancia en la que vamos a incluir ocupe todo el tejido tenemos que eliminar el agua y
sustituirla por un líquido miscible con dicha sustancia. Si una muestra no está completamente
embebida en el medio de inclusión se deteriorará y la obtención de secciones homogéneas será
imposible.

INCLU S IÓ N e n P ARAF I NA
Para la inclusión de muestras que han de observarse con el microscopio óptico se utiliza
sobre todo la parafina, y en menor medida la celoidina, como medio de inclusión. Vamos a
describir los pasos para la inclusión en parafina de muestras de tejido previamente fijadas ☆.

La parafina es una sustancia de aspecto ceroso que está formada por mezclas de
hidrocarburos saturados. A temperatura ambiente es sólida y su punto de fusión puede variar
entre 40 °C y 70 °C según la composición de la mezcla de hidrocarburos. Así, parafinas más
duras a temperatura ambiente tienen un punto de fusión mayor, mientras que las más blandas
uno menor. Es recomendable una dureza mayor para incluir muestras más duras. Las parafinas
más usadas tienen un punto de fusión en torno a los 60 °C. Podemos también modificar las
características de las parafinas añadiendo sustancias para variar su dureza, viscosidad, fragilidad,
etcétera.

La parafina no es miscible con agua, mientras que todos los tejidos están formados
principalmente por agua. Además, la mayoría de los fijadores son soluciones acuosas. Esto
implica que para que la parafina líquida pueda penetrar completamente en el tejido ha de
sustituirse el agua por un solvente orgánico. Esto se consigue mediante la deshidratación del
tejido en alcoholes, normalmente etanol, de gradación creciente hasta alcohol de 100°. La
deshidratación debe ser completa porque de no ser así afectará a la infiltración posterior de la
parafina. Posteriormente se transfiere el tejido a un líquido que es miscible tanto con el alcohol
de 100° como con la parafina, denominado sustancia intermediaria, como es el benceno, xileno,
tolueno o el óxido de propileno, entre otros. Estas sustancias son normalmente aclarantes por lo
que comprobando la translucidez de la pieza podemos cerciorarnos de la penetración de la
sustancia intermediaria en el tejido. El tiempo de incubación de la pieza en algunos de estos
líquidos intermediarios como el tolueno o xileno no debe ser excesivo puesto que estas
sustancias endurecen la pieza y crean problemas al hacer las secciones.

Por último se pasa el tejido a parafina previamente licuada en una estufa regulada a la
temperatura apropiada para dicho tipo de parafina. Se dan tres pasos por parafina líquida para
favorecer una completa sustitución del líquido intermediario por la parafina. El tiempo que dura
dichos pasos depende de lo volátil que sea el líquido intermediario y lo grande que sea nuestra
pieza. Será mayor cuanto menos volátil es el líquido intermediario o mayor sea la muestra de
tejido. Hay que tener en cuenta que un tiempo excesivo en parafina puede endurecer el tejido.
Sin embargo, los efectos de una pobre infiltración pueden ser más perjudiciales que mantener
mucho tiempo las muestras en parafina líquida. Tras el embebimiento completo de la muestra se
vierte parafina líquida en un molde, se introduce la muestra y se coloca según la orientación
deseada de corte y se deja solidificar a temperatura ambiente.

Un protocolo común de inclusión en parafina es el siguiente:

Esquema de la inclusión en parafina de una muestra de tejido previamente fijada. Los
tiempos de incubación en cada sustancia pueden variar en función del tamaño de la
muestra, tipo de tejido o, por ejemplo, el líquido intermediario. Sin embargo, los pasos son
comunes a cualquier inclusión en parafina.

INCLU S IÓ N e n RESI NA
Para la observación de la ultraestructura celular es necesario hacer secciones de tejido muy
delgadas, del orden de nanometros, denominadas ultrafinas, y usar un microscopio electrónico
de transmisión. La obtención de secciones ultrafinas implica que tenemos que endurecer
enormemente el tejido. Esto se puede conseguir mediante congelación, obteniendo entonces la
secciones con un ultracriotomo. Sin embargo, lo más frecuente es incluir el tejido en un material
de alta dureza como son las resinas de tipo epoxy, o en menor medida las resinas acrílicas como
el metacrilato. Ambas se infiltran en el tejido en forma líquida y posteriormente polimerizan sin
afectar a la ultraestructura celular.

El procedimiento estándar de inclusión en resinas tipo epoxy es similar al descrito para la

parafina con algunas modificaciones. Así, los pasos que se siguen son fijación de las muestras
por inmersión o perfusión, deshidratación, líquido intermediario, infiltración y polimerización en
el medio de inclusión. Algunos medios de inclusión de tipo acrílico, por ejemplo la resina LR
white, son parcialmente miscibles con el agua por lo que no son necesarios deshidratar
completamente la muestra ni el líquido intermediario, y además polimerizan con luz ultravioleta
a bajas temperaturas. Estos medios son buenos para estudios citoquímicos.

En las inclusiones en resinas tipo epoxy, normalmente para muestras que se observarán en
el microscopio electrónico, se suelen seguir las siguientes recomendaciones:

a) Las soluciones fijadoras suelen contener glutaraldehído y es necesaria una postfijación

posterior en tetróxido de osmio. Con ello nos aseguramos una fuerte fijación para preservar la
ultraestructura celular y que no perderemos los lípidos que forman las membranas celulares
durante el proceso de inclusión, gracias al tetróxido de osmio.

b) Partimos de tamaños de muestras mucho más pequeñas, de unos pocos milímetros,

puesto que no nos interesa ver la organización general del tejido sino detalles del mismo. Si
queremos observar zonas diferentes de un órgano es conveniente hacer bloques de muestra
pequeños e independientes de cada una de ellas.

c) La resinas más comúnmente usadas para la inclusión no son hidrosolubles, por lo que
tenemos que sustituir el agua del tejido por un solvente orgánico que sea miscible con la resina.
Para ello se deshidrata el tejido mediante incubaciones sucesivas en gradaciones crecientes de
etanol o acetona. Como líquido intermediario entre la acetona pura o el etanol de 100° y las
resinas se suele utilizar el óxido de propileno.

d) El endurecimiento del medio de inclusión, la resina, no es por enfriamiento sino

por polimerización, normalmente a 60 °C.

e) Al medio de inclusión, la resina, se le añaden aceleradores y plastificantes que regulan

las características de la polimerización y la dureza de la resina polimerizada. Las resinas tipo
epoxy son las más usadas puesto que aportan una mayor homogeneidad en las polimerización y
más facilidad a la hora de obtener secciones regulares. Por el contrario las resinas acrílicas
presentan algunos inconvenientes y hay que ser muy cuidadosos a la hora de elegir las
condiciones de polimerización, obtención y tratamiento de los cortes ultrafinos.

A continuación se muestra un proceso de inclusión habitual en resinas de tipo epoxy.

Esquema de la inclusión en resina de tipo epoxy de una muestra de tejido previamente
fijada. Los tiempos de incubación en cada sustancia pueden variar en función del tamaño
de la muestra o tipo de tejido.
 4. CO RTE
Las características tisulares y celulares finas se observan con los microscopios. Sin
embargo, con estos aparatos sólo se pueden observar muestras de tejido que tengan un grosor
muy pequeño, ya que de no ser así hay problemas de difusión y penetración de la luz en el caso
de los microscopios ópticos y de penetración de los electrones en el caso del microscopio
electrónico de transmisión. Por tanto tenemos que hacer secciones de los tejidos que queremos
estudiar, las cuales pueden ir desde un grosor de unos cuantos nanometros hasta centenares de
micras. Algunos tejidos como los de las plantas, por sus características celulares, permiten su
observación en secciones de cientos de micras de grosor. Otros tipos de muestras, como la
sangre o los cultivos celulares, pueden observarse directamente puesto que las células se
extienden en una capa de una o unas pocas células de grosor.

Como hemos mencionado en las páginas anteriores, podemos decir que cuanto más delgada
queramos hacer una sección de tejido más endurecido ha de estar dicho tejido antes de
seccionarlo. La dureza de los tejidos depende de sus características (por ejemplo, las paredes
celulares hacen que las plantas tengan tejidos duros), de la fijación que hayamos realizado y
sobre todo del material en el que hayamos incluido dicho tejido. Una manera más directa de
endurecer el tejido es mediante congelación.

Los aparatos mecánicos para hacer secciones de un grosor de micrómetros se

denominan microtomos y existen diferentes tipos según el grosor que queramos conseguir en
nuestras secciones, según el medio de inclusión en el que se encuentre el tejido y según el
proceso de endurecimiento de la muestra: por congelación o por inclusión.

Los microtomos más usados son:

Microtomo para parafina. Se utiliza principalmente para material incluido en parafina y

se obtienen secciones de 5 a 20 µm de grosor. Estas secciones se observan con el microscopio
óptico.

Microtomo manual. Es un dispositivo muy sencillo que consta de un soporte para sujetar
la muestra. Los cortes se realizan a mano con una cuchilla. Este microtomo se usa prácticamente
sólo para tejidos vegetales, los cuales son duros gracias a las paredes vegetales. Hace cortes
gruesos, 100 µm o más, observables con el microscopio óptico.

Vibratomo. Corta material no incluido, aunque sí fijado o duro, en secciones que pueden ir
desde 30 hasta centenares de µm de grosor. Estas secciones se observan con el microscopio
óptico.
 Microtomo de congelación. Con él se consiguen secciones de 30 a unas 100 µm de grosor
a partir de material congelado y se observan con el microscopio óptico.

Criostato. Consigue secciones a partir de material congelado y se obtienen grosores de 10

a 40 µm, para observar con el microscopio óptico.

Ultramicrotomo. Con él se corta material incluido en resinas y se obtienen secciones

habitualmente de una pocas decenas de nanometros de grosor, pero también entre 0.5 y 1 µm.
Las secciones de 0.5 µm o más se observan con el microscopio óptico, mientras que las de un
grosor de decenas de nanometros van destinadas a ser observadas con el microscopio electrónico
de transmisión.

Ultracriotomo: Su uso no está muy extendido pero se suele emplear cuando se necesitan
secciones del orden de nanometros de material que no se debe incluir. Estas secciones van
destinadas a su observación con el microscopio electrónico de transmisión.

Los aparatos de corte más usados tradicionalmente para estudiar las características
generales de los tejidos y de las células son el microtomo para material incluido en parafina para
observaciones con el microscopio óptico y el ultramicrotomo para observaciones con el
microscopio electrónico de transmisión. El criostato se usa también frecuentemente en
microscopía óptica por el ahorro de tiempo que supone ya que no necesita incluir el tejido,
incluso se puede cortar material no fijado.

M ICRO TO M O S P ARA
P ARAF I NA
Los microtomos para cortar material incluido en parafina son probablemente los más
usados en los laboratorios de histología. Todos poseen varias partes comunes: una cuchilla, un
portamuestras y un sistema mecánico que permite acercar el bloque de parafina, con la muestra
dentro, a la cuchilla, a una distancia que se corresponde con el grosor de la sección que
pretendemos obtener, y realizar el corte.
Microtomo para parafina con mecanismo de rotación.

Hay dos tipos de microtomo para parafina: el de rotación y el de deslizamiento. El

microtomo de rotación provoca el corte gracias a la transformación de un movimiento de
rotación en otro de ascenso y descenso del portamuestras. En el movimiento de bajada sobre la
cuchilla se produce un acercamiento del portamuestras hacia la cuchilla según el grosor de corte
seleccionado. En el portamuestras existe un sistema mecánico que permite orientar la superficie
de corte de la muestra respecto a la cuchilla. En estos microtomos la cuchilla se mantiene fija
durante el proceso de corte, pero puede regularse el ángulo de ataque, es decir, el ángulo de la
hoja de la cuchilla respecto a la superficie de la muestra. Con el microtomo de deslizamiento se
obtienen cortes mediante un movimiento de deslizamiento del bloque sobre la cuchilla, o
viceversa. En estos microtomos el movimiento lo proporciona directamente la mano y es de ida
y vuelta, siendo en la vuelta cuando se eleva la posición del bloque, o dismimuye la de la
cuchilla, una distancia que nos dará el grosor del corte.

Microtomo para parafina con mecanismo de deslizamiento.

 Tanto el microtomo de rotación como el de deslizamiento tienen ventajas e inconvenientes.
La principal ventaja del de rotación es su precisión, la posibilidad de obtener secciones seriadas
con facilidad y la automatización del proceso de corte mediante motores eléctricos. Los
microtomos de deslizamiento son más sencillos mecánicamente y su disposición permite cortar
bloques más grandes, o bloques de celoidina, aunque están cayendo en des uso.

Hay que llevar a cabo una serie de procesos sobre el bloque de parafina antes de hacer el
primer corte útil a nuestra muestra. En primer lugar hay que retallar el bloque hasta hacer
una pirámide truncada. Antes de retallar hay que considerar cual de las caras laterales de esta
pirámide será el frente de ataque, es decir, cual será la que primero se ponga en contacto con la
cuchilla. Esta cara deberá ser más ancha que la opuesta, y ambas han de ser paralelas. Con el
retallado se consigue una buena orientación de nuestra muestra en las secciones, la diferencia en
el tamaño de la caras permite que cada nuevo corte arrastre sin problemas al previamente
cortado y, por último, las caras paralelas hacen que se obtengan tiras rectas de cortes. Una vez
retallada la pirámide, y antes de obtener secciones de nuestra muestra, es necesario un proceso
de desbastado, es decir, la eliminación del espesor de parafina que hay entre la superficie del
bloque y nuestra muestra.

Preparación del bloque de parafina antes de iniciar la obtención de secciones útiles.

A veces es necesario retallar el bloque de parafina.

Otro aspecto que hemos de tener en cuentan antes de empezar a cortar es el ángulo de
ataque o inclinación de la cuchilla respeto a la superficie de corte de la pirámide. Lo normal es
orientar la cuchilla con un ángulo de uno 10° respecto a la superficie de corte, aunque se puede
modificar según nuestras necesidades.

Una vez comenzado el corte de nuestra muestra se obtienen tiras de secciones unidas por
las caras paralelas a la cuchilla. Estas tiras se suelen manipular con pinceles o lancetas y, antes
 de su fijación definitiva en la superficie de un portaobjetos, han de estirarse para que nuestro
tejido quede perfectamente extendido. Aprovechando la hidrofobicidad de la parafina, las
secciones se colocan sobre agua calentada a unos 35 °C a 40 °C y el calor las hace extenderse
sin llegar a su punto de fusión, que está en torno a los 60 °C. El estiramiento se puede realizar en
baños de agua con regulación térmica o sobre los propios portaobjetos cubiertos de agua y
colocados sobre una plancha térmica regulable.

Corte con un vibratomo de rotación.

Una vez se ha retallado y desbastado el bloque se obtienen las secciones en tiras que
serán colocadas sobre un portaobjetos cubierto con agua calentada a unos 40 °C. El
portaobjetos ha sido tratado previamente son soluciones adhesivas. El calor y la
hidrofobicidad de la parafina hace que las secciones se estiren sobre la superficie del
agua y una vez evaporada queden adheridas al portaobjetos.

La superficie del portaobjetos donde se colocan las tiras de cortes ha de estar previamente
tratada para que nuestro tejido quede adherido durante el procesamiento posterior. Para ello los
portaobjetos se recubren con soluciones de gelatina☆, albúmina, u otras sustancias y se dejan
secar, de manera que hacen de adhesivo entre el cristal y nuestro tejido.
 Una vez que el agua se ha evaporado y están extendidas las tiras de cortes de parafina sobre
el portaobjetos, se procede a un secado exaustivoen una estufa a una temperatura de entre 35 °C
y 40 °C durante toda la noche. Una vez secos, los portaobjetos con las secciones están listos para
el procesamiento posterior.

Colocación y estiramiento de cortes de parafina.

VIBRA T O M O
Puede haber varias razones para evitar la inclusión de un tejido del que posteriormente
obtener secciones. Durante los procesos de inclusión, como las inclusiones en parafina o en
resinas tipo epoxy, se ha de someter a las muestras a deshidratación. Esto ocasiona a veces daño
en algunas moléculas o regiones moleculares que son las que queremos detectar posteriormente
con técnicas como la inmunocitoquímica. Además, para observar algunas características
tisulares o celulares se requieren secciones gruesas del orden de 50 µm, a veces de 100 o 200
µm. Por ejemplo, para estudiar la organización espacial de determinadas células como las
neuronas es recomendable hacer cortes de un grosor superior a las 50 µm y emplear
inmunocitoquímica o histoquímica para ponerlas de manifiesto. La obtención de secciones
gruesas sin necesidad de inclusión se puede conseguir de dos maneras diferentes: mediante
congelación de la muestra y corte en un microtomo de congelación o mediante el uso del
vibratomo.

Vista lateral de la cubeta de un vibratomo.

El vibratomo es un aparato con el que se obtienen secciones de un grosor que puede oscilar
entre las 40-50 µm hasta varios centenares de µm partiendo de una muestra animal o vegetal
 endurecida sólo mediante fijación. El mecanismo de corte consiste de una plataforma sobre la
que se sitúa la muestra, que puede regularse en altura y nos permite seleccionar el grosor del
corte, y de una cuchilla de borde muy afilado que se desplaza horizontalmente sobre la muestra
realizando el corte. La característica del vibratomo es que la cuchilla , además de avanzar sobre
la muestra, posee un movimiento de vibración lateral a modo de sierra que facilita el corte y
evita arrastrar el tejido. La muestra se encuentra adherida, normalmente mediante pegamento de
contacto, directamente a un bloque portamuestras que se coloca sobre la plataforma elevadora.

Pegado de la muestra al bloque portamuestras.

No todas las muestras son apropiadas para ser cortadas en un vibratomo. Así, aquellas que
sean muy blandas o que posean porciones demasiado duras o elásticas son normalmente
arrastradas por la cuchilla, a pesar de que disminuyamos la velocidad de avance y aumentemos
la oscilación de la cuchilla. Es decir, la muestra ha de tener una cierta consistencia y no poseer
elementos distorsionadores del corte.

Otra característica del vibratomo es que todo el proceso de corte se realiza bajo una
solución acuosa que normalmente es una solución tamponada o una solución salina. Para ello
tanto la muestra como el borde de corte de la cuchilla han de estar sumergidos y los cortes que
se obtienen se denominan cortes en flotación, es decir, no sujetos a ningún soporte. Estos cortes
se pueden procesar de esta manera, flotando, o adherirse a un portaobjetos y procesarlos
después. Sin embargo, el proceso de secado necesario para la adhesión al portaobjetos suele
conllevar alteraciones de la calidad del tejido. Así, los cortes se suelen procesar durante toda la
técnica en flotación y posteriormente se montan sobre portaobjetos para su observación con el
microscopio óptico.

CRIO TO M O S
La congelación de los tejidos es una manera rápida de endurecerlos sin necesidad de
inclusión. Esto tiene una serie de ventajas. a) La preservación molecular es máxima, lo cual es
muy importante si el procesamiento posterior requiere el reconocimiento molecular. b) Las
muestras congeladas pueden cortarse en secciones finas, del orden de 5-15 µm, y más gruesas
del orden de cientos de µm. El vibratomo permite también cortes sin incluir pero no se pueden
 conseguir secciones finas. c) La obtención de buenas secciones no depende del tipo de tejido
(excepto tejidos mineralizados como el hueso o aquellos excesivamente cornificados). d) Por
último, es posiblemente la manera más rápida de obtener secciones puesto que es posible
congelar la muestra sin necesidad de fijación y cortarla de inmediato, como las biopsias. Pero
para preservar correctamente la estructura del tejido ha de ser una congelación muy rápida,
normalmente en isopentano enfriado con nitrógeno líquido, lo que evita la formación de cristales
de hielo que deterioran las estructuras celulares.

Criostato. El compartimento de color azul es la cámara refrigerada a la temperatura

seleccionada. En esta cámara se encuentra la muestra, la cuchilla y es donde se recogen
las secciones.

En el caso de que no se requiera un corte rápido las muestras normalmente se fijan y

posteriormente se incuban en una solución anticogelante que contiene sacarosa y glicerol. Con
ello se evita que durante la congelación se formen cristales de hielo grandes que puedan dañar
las estructuras celulares. También se evitan daños tisulares con una congelación muy rápida, por
ejemplo, con nitrógeno líquido. Dicha congelación permite preservar incluso la ultraestructura
celular y observarla al microscopio electrónico, siempre con el uso previo de anticongelantes.
Para observaciones que no necesiten una preservación ultraestructural se suele realizar la
congelación de la muestra a temperaturas superiores (entre -80 oC y -20 oC) que dependen del
aparato empleado para realizar los cortes, lo cual hace necesario el uso previo de
anticongelantes.
Criostato. El mecanismo de rotación y corte del criostato se encuentra dentro de una
cámara refrigerada.

Los dos aparatos más usados para realizar cortes por congelación son el microtomo de
congelación y el criostato. El microtomo de congelación realiza cortes de decenas de µm de
grosor y consiste en una plataforma que se enfría a bajas temperaturas sobre la que se coloca la
muestra. Tras cada corte la plataforma se eleva un espacio correspondiente al grosor de corte
seleccionado. En los microtomos de congelación antiguos se producía la congelación mediante
gas carbónico que había que suministrar regularmente. Actualmente se produce la congelación
(de -30°C a -40 °C) de la plataforma mediante tubos que parten de un sistema de refrigeración
externo al propio dispositivo de corte. Además, existe la posibilidad de congelar también la
cuchilla si se desea. En los aparatos actuales la muestra se congela por contacto directo con la
plataforma y su temperatura es constante durante todo el tiempo de corte. Las secciones que se
obtienen, de decenas a cientos de µm, se recogen con un pincel, se añaden a un recipiente con
tampón de trabajo y se trabaja con ellas en flotación, igual que en el caso del vibratomo.
Criostato. Proceso mediante el que se pegan las secciones a un portaobjetos.

El criostato se utiliza para obtener secciones por congelación de 10 a 30 µm de grosor,

aproximadamente. En este aparato todo el sistema de corte se encuentra encerrado en
una cámara refrigerada cuya temperatura se puede regular, normalmente entre -20 y -30 °C. La
congelación se suele hacer en una plataforma dentro de la propia cámara refrigerada que se
encuentra a una temperatura inferior, en torno a -50 °C. También se puede congelar el tejido
externamente con la rapidez que deseemos, por ejemplo con nitrógeno líquido, pero es
conveniente colocar la muestra en la cámara del criostato hasta que consiga igualar su
temperatura con la de ésta para obtener secciones homogéneas. Antes de la congelación, la
muestra se encastra en un medio que es líquido a temperatura ambiente y sólido a la de corte.
Por tanto, tenemos nuestra muestra en un bloque sólido, encastrada pero no incluida. Esto
permite manipular la muestra y adherirla a un soporte portamuestras, el cual se fijará a un eje
que avanza sobre la cuchilla. La preparación del bloque y el mecanismo de corte es similar al
que se describió para el microtomo de rotación para parafina. Las secciones que se van
obteniendo se adhieren por contacto a portaobjetos con superficies adhesivas. Las secciones se
descongelan rápidamente en este proceso de pegado puesto que los portaobjetos están a
temperatura ambiente y una vez secas pueden procesarse para las técnicas que deseemos.

Todavía existe un tipo de criotomo mucho más sofisticado denominado ultracriotomo. Este
aparato se emplea para obtener secciones ultrafinas, del orden de decenas de nanometros, para
su observación con el microscopio electrónico de transmisión. La ventaja de este aparato
respecto al ultramicrotomo (ver en siguiente página) es que los tejidos no pasan por solventes
orgánicos y no temperaturas elevadas y por tanto la preservación molecular es mayor.

ULTRA M ICRO TO M O
Para la observación con detalle de la ultraestructura celular es necesario
realizar secciones muy delgadas, del orden de nanometros, denominadas ultrafinas, y
observarlas con el microscopio electrónico de transmisión. Para ello se incluye la muestra en
resina, generalmente de tipo epoxy, que una vez polimerizada resulta en un bloque de gran
dureza. La obtención de secciones ultrafinas se lleva a cabo con un aparato
denominado ultramicrotomo. Otra manera menos habitual de obtener secciones ultrafinas es
mediante el ultracriotomo, para lo cual la muestra se congela y se corta en una cámara
refrigerada a muy bajas temperaturas. Este último es un mecanismo similar al visto para el
criostato. Es un aparato que sólo se usa cuando queremos detectar con microscopía electrónica
moléculas que son dañadas durante el proceso de inclusión.

El ultramicrotomo tiene un diseño para cortar de un modo similar al microtomo de

parafina de rotación, pero mucho más preciso y sofisticado. Quizá el sistema más delicado sea el
que hace avanzar el bloque sobre la cuchilla pues debe hacerlo a intervalos de varios
nanometros. Actualmente este sistema de avance es mecánico pero en los ultramicrotomos más
antiguos era por calor, que producía dilatación del eje sobre el que se sujetaba la muestra.
También tiene un sistema completo de orientación de la muestra sobre el borde de la cuchilla
para que el plano de corte se pueda orientar perfectamente a la superficie de nuestra muestra. Al
realizar cortes muy delgados cualquier vibración o cambio de temperatura afecta la
homogeneidad del grosor del corte, por tanto el ultramicrotomo debe situarse en una habitación
donde no haya vibraciones y mantenerla a temperatura constante para evitar dilataciones del
brazo que porta la muestra, dentro de lo posible. Además, estos aparatos se colocan sobre mesas
especiales para disminuir las vibraciones. Todos los ultramicrotomos actuales tienen un panel de
control externo al aparato desde donde se controla electrónicamente el proceso de corte: inicio
de corte, grosor de la sección, velocidad de corte, ventana de corte, iluminación de la muestra,
etcétera.
 Antes de realizar el primer corte ultrafino de una muestra, al igual que ocurría con los
cortes de parafina, es necesario retallar y desbastar el bloque para crear una pirámide truncada.
Aunque todo este proceso se puede hacer a mano con una cuchilla, se suele utilizar un aparato
denominado piramidotomo con el que se liman y crean las caras de la pirámide con un
dispositivo a modo de torno, además de producir el desbastado para obtener la superficie de
corte. Hay que tener en cuenta que este proceso ha de ser preciso porque la superficie de
corte debe ser muy pequeña, en torno a unos 0,5 mm2. Los lados de la superficie de corte deben
ser similares a los descritos para el corte en inclusiones de parafina, dos lados han de ser
paralelos y uno más grande que el otro. Con esto nos aseguramos que una nueva sección
empujará a la previa del borde de la cuchilla y que conseguiremos tiras rectas de secciones.
Antes de hacer las secciones ultrafinas se suele hacer una sección semifina, de 0,5 o 1 µm para
tener una imagen de la muestra al microscopio óptico.

Proceso por el que se obtiene una cuchilla para hacer cortes en el ultramicrotomo.

Las cuchillas empleadas para hacer secciones ultrafinas son específicas para este tipo de
aparatos puesto que han de tener unos filos muy agudos. Las más comúnmente usadas son de
vidrio especial y se obtienen mediante unos aparatos que mediante ralladuras con puntas de
diamante y golpes secos sobre barras de vidrio son capaces de producir dichas cuchillas. Sin
embargo, la mejor calidad de corte se consigue con cuchillas con filo de diamante, pero son
mucha más caras. Aunque los ultramicrotomos actuales tienen mecanismos de corte precisos,
durante el proceso de corte se pueden obtener secciones de distinto grosor. El grosor de una
sección ultrafina se conoce por el color que produce el reflejo de la luz sobre su superficie. Este
 color puede ser gris (menos de 60 nm), plata (60 a 90 nm), oro pálido (90 a 120 nm), oro intenso
(120 a 150 nm), púrpura (150 a 190 nm), etcétera.

Corte y recogida de secciones en una rejilla.

Las secciones ultrafinas recién obtenidas quedan flotando sobre una balsa de agua que
posee la propia cuchilla y no se recogen sobre portaobjetos sino directamente sobre soportes de
níquel o cobre denominados rejillas. Son discos circulares con un enrejado de hilos que dejan
cavidades, las cuales son de distinto tamaño según el tipo de rejilla, normalmente desde 100 a
varios cientos de µm cuadradas. Estas rejillas tienen la ventaja de permitir una gran nitidez de
las imágenes del tejido que ofrece el microscopio electrónico puesto que los electrones sólo
atraviesan la sección antes de incidir sobre la pantalla de visualización. Sin embargo, presentan
el problema de que la porción de sección que caiga sobre el hilo de la rejilla quedará oculto. Por
ello existen las "rejillas" de ojal, que tienen una sola cavidad y suficientemente grande como
para que quepa un corte entero. Obviamente es necesario suministrar un soporte para que la
sección no se cuele por la cavidad. Este soporte es normalmente una membrana muy fina hecha
de una sustancia denominada formvar, la cual deja pasar los electrones y sostiene a las
secciones.

5. TINCIÓ N
 Los tejidos animales son en su gran mayoría incoloros, excepto aquellos que poseen algún
tipo de pigmento como la hemoglobina de la sangre o la melanina de la epidermis. En las
plantas, sin embargo, existe una mayor variedad de pigmentos naturales que permiten su
observación directa con el microscopio óptico, a lo que también ayuda la presencia de las
paredes celulares, las cuales facilitan la delimitación celular y la discriminación entre diferentes
tejidos. Cuando se inventaron los primeros microscopios hubo que descubrir cómo teñir los
tejidos para poder desentrañar sus características morfológicas. Se observó que
algunos pigmentos como el carmín o la eosina, disueltos en agua, se unían a determinados
componentes de los tejidos. La expansión de la industria textil en el siglo XIX y su necesidad de
colorear las telas provocó un rápido desarrollo de los tintes o pigmentos. Muchas de estas
sustancias fueron usadas como colorantes en la histología de los animales y de las plantas desde
mediados del siglo XIX hasta la actualidad, alcanzándose un enorme desarrollo y
perfeccionamiento de nuevas técnicas y moléculas sintéticas que se usan según las necesidades
del investigador. Con la llegada de la biología molecular se han puesto en marcha otras técnicas
mucho más sofisticadas para observar elementos celulares, entre las que se pueden destacar
aquellas que usan anticuerpos, inmunocitoquímicas, las que usan sondas de ADN o ARN,
hibridaciones "in situ", o más sofisticadas aún como las que mediante el diseño de animales
transgénicos permiten identificar y observar a las células que expresan un determinado gen,
incluso en el organismos vivo, gracias a la fluorescencia de la proteína verde fluorescente
(GFP).

No vamos a describir con detalle las técnicas más complejas, al menos no en estas páginas
básicas, sino las más comunes, las que se suelen emplear en un laboratorio para el estudio
general de los tejidos. Dividiremos el conjunto de técnicas histológicas en cinco categorías.

a) Tinciones generales. Aquellas que usan sustancias coloreadas que se unen a

componentes tisulares por afinidad electro-química.

b) Histoquímica. Son aquellas técnicas de tinción que implican la modificación química de

algunas moléculas tisulares para posteriormente ponerlas de manifiesto con colorantes. En este
apartado incluiremos también a los métodos de tinción basados en la capacidad catalítica de
algunas enzimas presentes en los tejidos que queremos estudiar.

c) Lectinas. Las lectinas son dominios de proteínas, como las selectinas, que son capaces de
reconocer glúcidos que forman parte de polisacáridos. Tienen una gran especificidad y se usan
para determinar el tipo de glúcido que aparece en las glicoproteínas de las células o de la matriz
extracelular de los diferentes tejidos o como marcadores de estructuras tisulares.

d) Inmunocitoquímica o inmunohistoquímica. Son técnicas histológicas muy potentes

basadas en la alta especificidad de la unión de los anticuerpos a los antígenos contra los que se
produjeron. Estos antígenos pueden ser cualquier molécula tisular que, purificada en inyectada
en un animal, sea capaz de desarrollar una respuesta inmune. Estos anticuerpos añadidos a una
sección de tejido reconocerán y se unirán específicamente a dicha molécula.

e) Hibridación. Son técnicas basadas en la unión complementaria de las bases de ácidos

nucleicos (adenina con la timina, o con el uracilo, y de la guanina con al citosina). Esto hace que
dos cadenas complementarias de ácidos nucleicos se unan entre sí de forma muy específica, es
decir, hibriden. Siguiendo este principio se pueden sintetizar sondas marcadas, cadenas de ADN
o ARN con una secuencia de bases determinada que llevan una molécula unida para poder
detectarlas. La secuencia de bases de la sonda es complementaria a otra que está presente en la
célula, normalmente en forma de ARN mensajero. Así, podemos observar qué células expresan
un determinado gen.

TINC IO NES G ENERALE S

La mayoría de los tejidos, sobre todo los de los animales, son incoloros y por ello
necesitamos teñirlos para observar sus características morfológicas con el microscopio óptico.
Ello se consigue con el uso los colorantes, sustancias coloreadas que son capaces de unirse de
manera más o menos específica a estructuras del tejido aportándoles color. Se utilizan
normalmente para teñir a las células y componentes tisulares que van a ser observados con el
microscopio óptico y por ello se realizan habitualmente sobre secciones de tejido, siendo las más
utilizadas las secciones obtenidas a partir de inclusiones en parafina u obtenidas en el criostato.
Los colorantes son los elementos principales de las tinciones generales.

La molécula de un colorante tiene normalmente dos componentes importantes: uno que

aporta el color, denominado cromógeno, y otro que posibilita la unión a elementos del tejido
denominado auxocromo. El cromóforo es la organización molecular dentro del cromógeno
responsable de la absorción de un espectro determinado de longitudes de onda. El auxocromo
que se une al cromógeno puede influir en su coloración y muchos colorantes tienen más de un
grupo auxocrómico. El auxocromo puede ser un grupo inonizable, un grupo que reacciona
covalentemente con iones metálicos (mordientes) o puede reaccionar covalentemente con el
sustrato, en este caso el tejido. Los colorantes son normalmente hidrosolubles, aunque hay
colorantes que carecen de grupos ionizables y sirven para teñir sustancias grasas, como gotas de
lípidos.

Según la naturaleza química del cromóforo hay varios tipos de colorantes: nitrosos,
ozoicos, derivados de la antroquinona, derivados de la acridina, derivados de iminas quinónicas,
derivados de diferrilmetano y triferrilmetano, derivados del xanteno y derivados de las
talocianinas.
 Según la naturaleza química del radical auxocromo los colorantes se clasifican en:

Básicos: son sales en las que la base, normalmente una amina, aporta el color, mientras que
la parte ácida es incolora. Es decir, con colorantes catiónicos. Tienen apetencia por sustancias
ácidas del tejido como el ADN o ciertos componentes de la matriz extracelular como los
glicosaminoglicanos. La unión es por atracción eléctrica. Así, ponen de manifiesto el núcleo y el
ARN, sobre todo el ARNr presente en los ribosomas por ser muy abundante, así como ciertas
matrices extracelulares ricas en componentes ácidos. Ejemplos de colorantes básicos son la
tionina, safranina, azul de toluidina, el azul de metileno o la hematoxilina.

Ácidos: son sales con el anión coloreado y la base incolora. Son derivados de grupos
sulfónicos, carboxilos o hidroxilos fenólicos. Tienen apetencia por sustancias básicas, sobre todo
estructuras proteicas localizadas en el citoplasma celular y también por el colágeno de la matriz
extracelular. La unión es por atracción eléctrica. Ejemplos de colorantes ácidos son la fucsina
ácida, verde rápido, naranja G o la eosina.

Colorantes mordientes: son aquellos que se usan en combinación con sales metálicas, que
actúan como mordiente. Estas sales se pueden emplear junto con el colorante, antes o después.
En algunos casos el colorante mordiente puede ser también aniónico o, menos frecuentemente,
catiónico. Normalmente se emplean para teñir los núcleos. Por ejemplo, la hematoxilina férrica
de Heidenhain

Neutros: poseen una porción ácida y otra básica, ambas con capacidad para aportar color.
Por tanto un mismo colorante puede teñir tanto las partes básicas como las ácidas de los tejidos.
Por ejemplo, el eosinato de azul de metileno.

Indiferentes o hidrofóbicos: realmente no se unen a elementos de los tejidos por afinidad

química sino porque se disuelven en ellos. Por ejemplo, el colorante sudán se disuelve en los
lípidos y por tanto teñirá a las gotas de lípidos, especialmente en los adipocitos.

Los colorantes usados en histología se emplean a muy altas concentraciones y la cantidad

que se une al tejido es realmente pequeña. Por eso, una solución de colorantes se puede usar
muchas veces sin que se agote. La manera en cómo se consigue una tinción adecuada se puede
dividir en dos tipos: progresiva y regresiva. La tinción progresiva consiste en obtener una
coloración adecuada controlando el tiempo de la sección en el colorante, de modo que a más
tiempo más coloración. La tinción regresiva consiste en la eliminación lenta de colorante de una
tinción que ha sido teñida en exceso. Esta eliminación se consigue normalmente con soluciones
alcohólicas y al proceso se le denomina desteñido. La concentración de la solución y tiempo de
diferenciación nos aporta la coloración adecuada.
 En algunas ocasiones necesitamos resaltar elementos tisulares de manera específica y para
ello usamos colorantes que tienen apetencia por dichas estructuras. Por ejemplo, la tinción
denominada azán contiene azocarmín y naranja-anilina-ácido acético que tiñen los núcleos de
rojo y sobre todo destaca el conectivo intensamente teñido de azul. Otra tinción combinada es el
tricrómio de Mallory que tiñe el colágeno de verde y las células musculares de rojo.

Cuando un colorante se une al tejido y aporta un color diferente al que tiene en solución se
dice que ha ocurrido un fenómeno de metacromasia. Esto se debe a que las propiedades de
absorción de la luz del colorante cambian al unirse a componentes celulares. Por ejemplo, el azul
de toluidina se vuelve púrpura cuando se une a ciertos gránulos de los mastocitos. Cuando el
colorante unido al tejido tiene el mismo color que en solución se denomina ortocromasia.

Tinción general. Una de las tinciones más comúnmente usada en histología es

la hematoxilina-eosina sobre cortes de parafina. Como vemos se usa un colorante básico
(hematoxilina) y otro ácido (eosina) para teñir de diferente color a las estructuras ácidas y
básicas de la célula. Antes de proceder a la tinción, si partimos de cortes de parafina, tenemos
que llevar a cabo unos tratamientos previos sobre las secciones como es el desaparafinado y la
hidratación, puesto que estos colorantes son hidrosolubles. Si partimos de cortes de criostato
esto no se lleva a cabo.

Sección de un glomérulo de un riñón de mamífero obtenida a partir de una inclusión en

parafina y teñido con hematoxilina-eosina. Los núcleos aparecen de color violáceo
(hematoxilina) y el citoplasma de color rosado (eosina).
Pasos que se siguen durante una tinción general de hematoxilina-eosina. Los tiempos son
aproximativos porque dependen del grosor de los cortes y de la concentración de los
colorantes. El desparafinado elimina el medio de inclusión, la parafina. El paso por agua
de grifo es típico de la hematoxilena y se denomina diferenciación. Las sales del agua
permiten obtener una coloración más violácea, en vez de púrpura. La deshidratación final
es necesaria porque el medio de montaje no suele ser hidrosoluble. Estos medios de
montaje no afectan al tejido, ni a los colorantes y tienen unas propiedades ópticas
excelentes. Además, conservan las preparaciones durante años en buenas condiciones.
Tras el montado y secado (evaporación del xileno), las secciones se puede observar con
el microscopio óptico.

Tinción general de hematoxilina y eosina en cortes de parafina.

Tinción de semifinos. Cuando se procesa material para microscopía electrónica es

necesario a veces hacerse una idea de qué zona del tejido vamos a cortar. Téngase en cuenta que
el área de una sección para observar con el microscopio electrónico es muy pequeña. Además, el
proceso de osmificación que ha de llevarse a cabo previamente a la inclusión acarrea el
oscurecimiento del tejido, con lo que dificulta aún más la orientación de la muestra. Por ello es
frecuente hacer secciones de 0,5 a 1 µm de grosor, denominadas secciones semifinas, con el
ultramicrotomo para orientarnos en la muestra y seleccionar la zona a partir de la cual haremos
las secciones ultrafinas. Los semifinos suelen tener áreas más grandes que las que
posteriormente vamos a usar para la obtención de las secciones ultrafinas. El colorante usado
para teñir secciones semifinas es normalmente el azul de toluidina, el cual puede infiltrase en la
resina calentada en una plancha y llegar hasta el tejido.
Sección semifina de un glomérulo de un riñón obtenida a partir de una inclusión en resina
y teñida con azul de toluidina.

Proceso de tinción de una sección semifina. La porosidad de la resina, el calor y las

propiedades del colorante (azul de tolouidina) hacen que se pueda teñir el tejido sin
necesidad de eliminar previamente la resina.

Contraste de ultrafinos. Aunque las secciones para microscopía electrónica se pueden

observar directamente con el microscopio electrónico se suelen tratar previamente con metales
pesados en un proceso denominado contraste, obteniendo así una imagen óptima de la
 ultraestructura celular. El contraste no es una tinción, puesto que no aporta color a la muestra,
pero sí es un proceso habitual para poder observar los componentes ultraestructurales de la
célula. Por ese motivo lo incluimos en este apartado. Téngase en cuenta que en la microscopía
electrónica lo importante no es añadir sustancias coloreadas sino moléculas que puedan interferir
con el camino de los electrones emitidos por el microscopio y que chocan contra la muestra. Los
metales pesados unidos al tejido impedirán que pasen los electrones y por tanto se verá una zona
negra en la pantalla fosforescente, mientras que en aquellas zonas de la célula donde no estén
estos metales dejarán pasar los electrones y provocarán áreas luminosas en dicha pantalla. Por
ello todas las imágenes originales de microscopía electrónica son en blanco y negro, aunque se
puedan colorear posteriormente con un ordenador.

Proceso de contraste de secciones ultrafinas. Los tiempos de incubación en citrato de

plomo y acetato de uranilo son aproximativos. Las lentejas de hidróxido sódico eliminan
humedad del aire y dificultan la pricipitación del citrato de plomo. Los lavados en agua se
llevan a cabo sumergiendo repetidas veces (en inglés, "deeping") la rejilla en el agua
durante un tiempo de aproximadamente 30 segundos en cada pocillo con agua destilada.

H ISTO Q UÍM ICA

Incluiremos dentro de las técnicas histoquímicas a aquellas que supongan una reacción
química en la que intervienen moléculas pertenecientes al propio tejido (trataremos la detección
de glúcidos mediante lectinas y la inmunohistoquímica en apartados diferentes a éste, aunque
algunos autores las incluyen como técnicas histoquímicas). El objetivo de la histoquímica es
poner de manifiesto una molécula o familia de moléculas presentes en una sección histológica y
estudiar su distribución tisular "in situ". Estas moléculas son difícilmente discernibles con
técnicas generales y por tanto es necesario realizar pasos previos para poner de manifiesto la
molécula que queremos detectar. Vamos a dividir las técnicas histoquímicas en dos grupos:
reacciones químicas e histoquímica enzimática.

Las reacciones químicas consisten en la modificación química de moléculas del tejido

para posteriormente poder colorearlas. Existen técnicas histoquímicas para detectar glúcidos,
proteínas y nucleótidos. La técnica histoquímica más empleada es la reacción de PAS (Periodic
Acid Schiff). Se utiliza para la detección de hidratos de carbono, libres o conjugados, cuando
están en cantidades relativamente grandes en los tejidos. La modificación química del tejido
consiste en la oxidación mediante el ácido periódico de los enlaces entre los carbonos próximos
que contienen grupos hidroxilos. Esto provoca la formación de grupos aldehídos que serán
reconocidos por el reactivo de Schiff, el cual se combinará con ellos para dar un color rojizo
brillante. Entre los componentes del reactivo de Schiff está la pararosanilina (un componente de
la fucsina básica) tratada con ácido sulfúrico. Una gran ventaja de la tinción histoquímica PAS
es su capacidad de discriminación de tipos de glúcidos con pequeñas modificaciones de la
técnica.
Tinción con hematoxilina-eosina (imagen de la izquierda) y PAS-hematoxilina (imagen de
la derecha) de las vellosidades del intestino de humano cortadas transversalmente. Se
puede apreciar a las células caliciformes teñidas de rosado con la técnica de PAS por su
alto contenido en mucopolisacáridos, mientras que en una tinción general aparecen
transparentes, sin teñir.

Pasos de la tinción histoquímica PAS-Hematoxilina sobre cortes de parafina. Los pasos

con letras en color verde son los específicos para esta tinción.
 La histoquímica enzimática o histoenzimología se basa en la capacidad que tienen
algunos enzimas del tejido de mantener funcional su centro activo tras el proceso de fijación.
Estos enzimas y las células que los poseen se ponen de manifiesto mediante una reacción
enzimática que convierte a unos sustratos solubles e incoloros en productos insolubles y
coloreados. Los sustratos son específicos para el enzima y los productos se depositan en el lugar
preciso donde se produjo la reacción, es decir, donde se localiza el enzima. Las enzimas que se
pueden detectar son variadas como las peroxidasas, fosfatasas, deshidrogenasas, diaforasas,
acetilcolinesterasa, etcétera. Hay que tener en cuenta que cuando queremos detectar una
actividad enzimática es recomendable no incluir el material en medios como la parafina puesto
que la deshidratación y la temperatura elevada pueden dañar la conformación de la enzima y por
tanto la actividad de su centro activo. Por ello estas técnicas se realizan normalmente en
secciones obtenidas por congelación o con el vibratomo.

La actividad NADPH diaforasa se asocia a las enzimas sintasas del óxido nítrico en sistema
nervioso y vascular. A estos enzimas se les ha relacionado con el control del flujo sanguíneo y
con ciertos aspectos de la fisiología del sistema nervioso. Esta técnica permite detectar neuronas
que expresan la enzima sintasa del óxido nítrico de una forma sencilla y rápida. La reacción es
NADPH + tetrazolio = NADP+ + formazán. Es el formazán el producto coloreado e insoluble
que se puede observar con el microscopio óptico, incluso con el microscopìo electrónico de
transmisión.

Imagen de un corte de 60 µm de grosor de cerebro obtenida con un criostato y procesada

para histoquímica enzimática que pone de manifiesto una actividad diaforasa
perteneciente a la enzima óxido nítrico sintasa neuronal que aparece en algunas
neuronas (células con un color azul intenso).
Los pasos para la detección histoquímica de la actividad diaforasa es muy sencilla. Tras
una fijación, preferentemente por perfusión, hay que permeabilizar el tejido con un
disolvente de lípidos como el Triton-X100. El revelado se produce a 37 oC y el final de la
reacción se controla mediante observaciones periódicas. Las concentraciones del sustrato
(NADPH) y del azul de tetrazolio varía según el tejido o el proceso de fijación.

LECTIN AS
Aparte de las técnicas de tinción generales y las histoquímicas, no muy específicas, existen
otras que se usan para detectar moléculas tisulares con una mayor especificidad. Ello es posible
gracias a la capacidad que tienen ciertas moléculas como las lectinas o las inmunoglobulinas
para reconocer y unirse sólo a un tipo de molécula presente en el tejido. En esta página vamos a
tratar sobre el uso de las lectinas para la detección en los tejidos de distintos tipos de glúcidos de
manera específica. En muchos textos la técnica de las lectinas se incluye dentro del apartado de
la histoquímica.

Las lectinas son proteínas que tienen dominios o secuencias de aminoácidos que son
capaces de reconocer y unirse a glúcidos terminales que forman parte de cadenas de
oligosacáridos, bien libres o formando parte de otras moléculas como las glicoproteínas. Por ello
se dice que las lectinas reconocen glicoconjugados. Las lectinas están ampliamente distribuidas
en los tejidos animales y vegetales y sus funciones son muy variadas. Por ejemplo, la salida de
los linfocitos desde el torrente sanguíneo hacia los tejidos dañados se produce gracias a la acción
de una familia de lectinas denominadas selectinas que expresan las células endoteliales próximas
al lugar de la lesión. Es decir, el linfocito puede salir por la pared endotelial gracias a la unión de
las selectinas endoteliales a los glúcidos de la membrana del linfocito. En el laboratorio de
 histología las lectinas se usan, sin embargo, para estudiar la distribución tisular de distintos tipos
de azúcares de manera específica. Se pueden usar diferentes tipos de lectinas en base a su
especificidad de reconocimiento de azúcares determinados. Hay al menos cinco grupos de
lectinas según se unan a manosa (Man), a galactosa/n-acetilgalactosamina (Gal/GalNAc), a N-
acetilglucosamina (GlcNAc), a fucosa (Fuc) o a ácido siálico (Neu5Ac), respectivamente.

Comercialmente hay disponibles docenas de lectinas diferentes que se nombran según el

organismo animal o la planta de la que se obtienen. En el siguiente cuadro se listan las lectinas
usadas comúnmente según el glúcido que reconocen.

Carbohidrato Nombre científico Acrónimo Carbohidrato específico

Galanthus nivalis
GNA Manα1,3Man > Manα1,6Man >
Manα1.2Man
Canavalia
Glucosa / Manosa Con-A αMan > αGlc > GlcNAc
ensiformis
LCA αMan > αGlc > GlcNAc
Lens culinaris
PEA αMan > αGlc > GlcNAc
Pisum sativum

Griffonia
Terminal α,βGlcNAc, glucógeno
simplicifolia GSA-II
Galβ1,4GlcNAc(N-acetillactosamina) >
N-
GlcNAc
Acetilglucosamina Datura DSA
GlcNAc(β1,4GlcNAc)1-2 >
stramonium WGA
β1,4GlcNAc1NeuAc
Tritricum vulgare

Dolichus biflorus DBA GalNAcα1,3GalNAc > αGalNAc

N-
Helix pomatia HPA GalNAcα1,3GalNAc > αGalNAc
Acetilgalactosamina
Arachis hypogaea PNA Terminal Galβbe1,3GalNAc
/ galactosa
Ricinus communis RCA-I Terminal βGal > αGal > GalNAc

Aleuria aurantia
AAA αL-Fuc
Lotus
LTA αL-Fuc > αL-Fuc1,2Galβ1,4GlcNAc > L-
L-Fucosa tetragonolobus
Fucα1,2Galβ1,3GlcNAc
UEA-I αL-Fuc
Ulex europaeus

Maackia amurensis MAA NeuAcα2,3Galβ1,4GlcNAc

Ácido siálico
Sambucus nigra SNA NeuAcα2,6Gal = NeuAcβ2,6GalNAc
Tabla con las lectinas más usadas en la que se muestra el carbohidrato o carbohidratos que se
detectan, las especies de donde se obtienen las lectinas que reconocen a dichos carbohidratos, los
acrónimos de las lectinas y los tipos de enlaces que se reconocen específicamente por cada lectina.
El símbolo > significa afinidad creciente hacia su izquierda, lo que indica que una lectina puede
reconocer a un carbohidrato específico enlazado de diferentes formas con otras moléculas, pero con
diferente afinidad.

Para poder observar el lugar de unión específica entre la lectina y su glúcido tenemos que
unir a la lectina un marcador que nos produzca una señal visible con el microscopio óptico o
electrónico de transmisión. Normalmente el marcaje consiste en la unión de una enzima como la
peroxidasa de rábano o la fosfatasa alcalina. Es el resultado de la reacción enzimática lo que se
puede observar. También se usa como marcador una molécula fluorescente que se puede
observar directamente en el tejido con un microscopio de fluorescencia. Cuando la enzima o la
molécula fluorescente están directamente unidas a la lectina se denomina método de detección
directa y cuando se unen a la lectina mediante una molécula interpuesta se denomina detección
indirecta. Las moléculas interpuestas más comunes son la biotina o anticuerpos específicos
(inmunoglobulinas tipo G) obtenidos contra la lectina.

Detección de lectinas mediante métodos indirectos en cortes adyacentes de epitelio del

pie de Haliotis tuberculata(oreja de mar, invertebrado prosobranquio). La imagen de la
izquierda muestra la detección de glucosamina mediante la lectina WGA biotinilada y su
posterior revelado de la peroxidasa unida a avidina (color marrón). En la imagen de la
derecha se muestra la detección de fucosa mediante la lectina AAA unida a digoxigenina.
Mediante un anticuerpo contra la digoxigenina unido a fosfatasa alcalina se pone de
manifiesto la localización de la fucosa (color azul).
Pasos para la detección de glúcidos con lectinas. Los tiempos pueden variar según el
material o la lectina usada. En este ejemplo se usa un método de detección indirecta
puesto que la lectina lleva unida una proteína intermediaria que es la biotina, la cual será
reconocida por la avidina del complejo ABC ("avidin-biotin-complex") que contiene la
enzima peroxidasa. Es el resultado de la reacción de este enzima tras añadir el substrato
peróxido de hidrógeno y la molécula diaminobencidina, lo que produce un precipitado
insoluble y visible con el microscopio óptico. El paso de BSA (albúmina de suero bovino)
sirve para saturar posibles sitios de unión inespecíficos de la lectina. Si en vez de cortes
en parafina hubiésemos usado cortes de vibratomo podríamos procesar, tras la reacción
de la peroxidasa, dichos cortes para observar el producto de reacción con el microscopio
óptico y también con el electrónico de transmisión.

La técnica con lectinas se suele complementar con una serie de tratamientos que sirven para
obtener más información acerca de la composición sacarídica de los glicoconjugados. Por
ejemplo, la desulfatación se usa para demostrar las uniones tipo ésteres de sulfato de las cadenas
terminales y la eliminación tipo beta permite conocer si las cadenas de glúcidos son uniones con
enlaces tipo O (uniones covalentes a grupos hidroxilo) o tipo N (enlaces covalentes a grupos
amino). En este último caso la alcalinización de los cortes elimina las uniones tipo O.

INM UN O CITO Q UÍM ICA

La inmunocitoquímica es una técnica para la localización de moléculas en los tejidos
mediante el empleo de anticuerpos. Es una técnica que gracias a la oferta comercial de
anticuerpos y a la estandarización de su protocolo se ha convertido en un método sencillo,
rápido y muy potente. Se basa en la gran especificidad y alta afinidad que tienen los anticuerpos
para reconocer a moléculas y unirse a ellas. Además, la conjugación o combinación de los
anticuerpos con enzimas o con sustancias fluorescentes permite detectar cantidades ínfimas de
moléculas presentes en el tejido.

Los anticuerpos o inmunoglobulinas que se usan en las técnicas inmunocitoquímicas son

del tipo G, producidas por unas células del sistema inmunitario denominados linfocitos Bdurante
la respuesta inmune. La producción masiva de anticuerpos se produce en un animal cuando le
inyectamos una molécula que reconoce como extraña. Estos anticuerpos pasan al suero
sanguíneo, el cual se extrae del animal inmunizado, y del que posteriormente se purifican.
Dichos anticuerpos purificados se usarán posteriormente en la técnica inmunocitoquímica.

Las moléculas complejas como las proteínas pueden tener en su estructura

varios determinantes antigénicos, es decir, lugares que son capaces de desencadenar una
respuesta inmune. Ello supone que cada determinante antigénico es capaz de activar un clon de
linfocitos B, es decir, un linaje de linfocitos B que producirá un mismo tipo de inmunoglobulina
G contra dicho determinante antigénico. Los anticuerpos de todos los clones de linfocitos B
activados por la molécula inyectada irán a parar al suero sanguíneo. Cuando se emplean sueros
purificados de este tipo en inmunocitoquímica se dice que se están empleando anticuerpos
policlonales. Por otra parte, existe una técnica que permite aislar y cultivar en el laboratorio (in
vitro) de forma invidualizada a cada uno de los clones de linfocitos B activados durante la
respuesta inmune. Cada uno de esos cultivos producirá un solo tipo de inmunoglobulina G que
 reconocerá sólo a uno de los determinantes antigénicos de la molécula inyectada. A los
anticuerpos obtenidos de cada uno de esos cultivos se les denomina monoclonales ya que
proceden de linfocitos que producen inmunoglobulinas idénticas.

Esquema resumido de las diferencias en la obtención de anticuerpos policlonales

(izquierda) y monoclonales (centro y derecha).
 Las moléculas de inmunoglobulinas tipo G pueden dividirse en dos dominos: la fracción
cristalizable y la variable. El dominio variable es el que se encarga de reconocer al determinante
antigénico de nuestra molécula. Hay dos sitios de unión en cada molécula, por lo que cada
inmunoglubulina podría reconocer y unir a dos determinantes antigénicos a la vez (estos
determinantes han de ser idénticos). La fracción cristalizable tiene una estructura similar para
todas las inmunoglubulinas G producidas por los individuos de una misma especie.

Para que un anticuerpo se una a su determinante antigénico localizado en una molécula del
tejido procesado, ésta no debe alterarse. De otro modo ese determinante antigénico no será
reconocido por el anticuerpo. Por ello el proceso de fijación del tejido debe elegirse para
preservar al máximo a la molécula que queremos detectar. Así, se usan diferentes fijadores
según el tipo de molécula en la que estemos interesados. También es necesario considerar el
método de obtención de los cortes. Inclusiones en parafina pueden dañar las moléculas, por lo
que en la mayoría de los casos se suele trabajar con cortes de vibratomo o con secciones
obtenidas por congelación.

Las inmunoglobulinas, aunque se unan a la molécula que queramos detectar, no son

visibles con el microscopio por lo que las tendremos que conjugar (unirlas) a otras moléculas
que nos den una señal visible. Estas moléculas que aportan visibilidad a los anticuerpos suelen
ser de dos tipos: moléculas fluorescentes y enzimas. Las primeras se pueden observar con el
microscopio de fluorescencia mientras que las segundas pueden convertir determinadas
moléculas solubles e incoloras en productos insolubles y coloreados. La señal aparece allí donde
está la sustancia fluorescente o el enzima, que es donde se ha unido la inmunoglubulina.

El método del marcado con sustancias fluorescentes tiene una serie de ventajas que
veremos más adelante, pero tiene la desventaja de que no son marcajes permanentes puesto que
la luz emitida por la molécula fluorescente se desvanece con el tiempo. Sin embargo, las
secciones procesadas con anticuerpos unidos a enzimas pueden deshidratarse, montarse y
mantenerse permanentemente para su observación. Las enzimas habituales que se unen a las
inmunoglobulinas son la peroxidasa y la fosfatasa alcalina.
Métodos de marcaje para detectar los anticuerpos primarios unidos específicamente a
una molécula del tejido.

La conjugación directa de un marcador (enzima o fluorescente) con la inmunoglobulina se

denomina método de detección directa. Hoy en día se suele emplear el método de detección
indirecta, que consiste en colocar una serie de intermediarios entre la inmunoglobulina y la
molécula marcadora.

En la detección con enzimas, también llamada inmunocitoquímica o inmunohistoquímica ,

Inicialmente se usó el método indirecto denominado peroxidasa-antiperoxidasa (PAP; ver figura
anterior), pero actualmente es más frecuente usar el método del complejo avidina-biotina-
peroxidasa (ABC; ver figura anterior). El método indirecto permite una mayor versatilidad de la
técnica y mayor intensidad de señal frente a una misma cantidad de antígeno.
 La inmunofluorescencia se basa en las propiedades de los fluorocromos. Son moléculas que
emiten luz visible cuando se les ilumina con una determinada longitud de onda. Aunque la
inmunofluorescencia se puede usar para detectar a una sola molécula tisular, su verdadero
potencial se muestra cuando necesitamos una múltiple inmunodetección, es decir, dos o más
moléculas presentes en una misma célula o matriz extracelular de forma simultánea. Esto es
posible porque existe una gran variedad de fluorocromos que son capaces de emitir luz visible
tras ser excitados con diferentes longitudes de onda, luego seleccionando el intervalo de
longitudes onda con el que iluminamos un tejido podemos excitar de modo individual, y
secuencial, varios fluorocromos que hayamos usado, unidos a inmunoglubulinas diferentes, para
detectar moléculas diferentes. Tomando fotografías tras cada excitación y superponiendo dichas
imágenes podemos averiguar si las moléculas se expresan, por ejemplo, en la misma célula.

Detección de la molécula tirosina hidroxilasa mediante inmunocitoquímica usando un

anticuerpo primario sin marcar, un anticuerpo secundario conjugado con biotina y el
complejo avidia-biotina-peroxidasa.
Inmunocitoquímica con detección indirecta y enzimática. La sección se obtiene de tejido
previamente fijado. Inmediatamente después se incuban en una solución de bloqueo que
satura los posibles sitios de unión inespecífica, gracias a una alta concentración de
proteína como la albúmina de suero bovino. Tras cada paso de unión de anticuerpos o del
complejo avidina-biotina-peroxidasa se procede a lavar los cortes en una solución
tamponada de fosfato (tampón fosfato), en la que también van disueltos los anticuerpos.
La reacción de la peroxidasa convierte unos sustratos, la diaminobencidina y el peróxido
de hidrógeno, en un producto insoluble y coloreado visible con el microscopio óptico.
Detección con inmunofluorescencia de dos antígenos en una sección de tejido nervioso:
la molécula calbindina (a la izquierda) y parvoalbúmina (a la derecha), usando
fluoresceína y Texas red como fluorocromos, respectivamente, mediante un método de
marcaje indirecto. Se pueden observar cuerpos celulares y prolongaciones nerviosas. Las
flechas blancas indican células que poseen ambas proteínas (calbindina y parvoalbúmina)
mientras que la flechas azules indican cuerpos celulares que sólo expresan
parvoalbúmina. Obsérvense las zonas oscuras, negativas, en la imagen de la izquierda.

Detección simultánea de dos moléculas situadas en una misma sección mediante

inmunofluorescencia. La razón de que los dos anticuerpos primarios procedan de dos
animales diferentes es que los anticuerpo secundarios, obtenidos de otro animal,
normalmente cabra u oveja, inmunizados con las inmunoglobulinas de ratón y conejo,
respectivamente, es lo que permite a cada anticuerpo secundario reconocer y unirse a un
anticuerpo primario determinado y no al otro.

H IBRID ACIÓ N i n si t u
La hibridación in situ permite descubrir la presencia de una secuencia de
nucleótidos mediante otra secuencia de nucleótidos complementaria a dicha secuencia o sonda.
La complementariedad entre secuencias de bases nucleotídicas es la base de la especificidan de
esta técnica. Así, podemos descubrir qué células expresan un gen determinado y cuándo lo
expresan. La expresión génica es un testimonio directo de la funcionalidad celular. Existe otra
aplicación de la hibridación in situ y consiste en la localización física de un gen sobre un
cromosoma. No se puede considerar a la hibridación in situ como una técnica de uso general.
Sin embargo, aporta una información sobre la fisiología de las células y los tejidos que no es
posible obtener con otras técnicas. Se puede emplear en células, tejidos, o animales enteros,
normalmente embriones. La hibridación in situ se usa ampliamente en investigación en
desarrollo embrionario, diferenciación de células madre, manipulaciones genéticas o cambios en
la fisiología celular frente a señales externas, entre otras.

Preparación del tejido

Cuando se hace sobre tejidos, órganos o embriones, hay que pretratar el tejido antes de
añadir la sonda. Como siempre, los tejidos han de estar fijados, siendo el formaldehído el fijador
más frecuente. Además, es preferible congelar y obtener secciones por congelación, en vez de
incluir en parafina, cuando hay que trabajar sobre secciones, puesto que el ARN se preserva
mejor. Es más tras un fijación, crioprotección y congelación, el material se puede mantener
congelado durante mucho tiempo.

En el caso de detección de ARN es importante tener en cuenta que es una molécula que se
degrada con facilidad, por lo que tenemos que tomar medidas para no perderla. El ARN se
degrada por las ARNasas, y una gran cantidad de este enzima se encuentra en nuestras manos,
por lo que tendremos que usar guantes y todo el material que se use ha de estar lbre de RNAsas
(con un autoclavado se pueden inactivar). A los tejidos se les trata antes para prepararlos para la
penetración de la sonda. Por ejemplo, con proteasas. También la acetilación (ácido acético en
tampón trietanolmaina) disminuye las uniones del sonda de manera insespecífica al tejido.

Sonda

La hibridación in situ se basa en la complementariedad de bases nucleotídicas (A-T o A-U

y G-C). Del mismo modo que en la inmunocitoquímica se usan los anticuerpos, en la
hibridación in situ se usa una secuencia de nucleótidos, denominada sonda, que es
complementaria a la secuencia del ARN que queremos detectar, y que está conjugada con una
molécula que luego pondremos de manifiesto y que nos sirve de marcador. El tamaño apropiado
de una sonda es de entre 50 a 300 bases. Las sondas se pueden marcar de manera radiactia
(isotópica) o no radiactiva (no isotópica). Esta última es la más frecuente. Las no isotópicas se
pueden marcar con biotina, sustancias fluorescentes, digoxigenina, bromodoxiuridina, y otras
sustancias.

Quizá una de las razones por las que la hibridación in situ no es común todavía en los
laboratorios de histología es porque sintetizar una sonda es complicado y generalmente no se
puede usar en una especie animal o vegetal distinta a aquella para la que se ha producido dicha
sonda. Ello es porque un mismo gen (y su ARN mensajero) en dos especies distintas tienen
secuencias que no son idénticas y por tanto hay que fabricar una sonda para cada especie. Sin
embargo, una vez obtenida la sonda el proceso de hibridación es sencillo.

Para obtener una sonda lo primero que tenemos que hacer es conocer la secuencia de bases
del ARNm con el que queremos hibridarla. Si esa secuencia está publicada en las bases de datos
en Internet todo el proceso se simplifica enormemente puesto que hoy en día se puede solicitar
la síntesis de forma química de secuencias largas de ADN (hasta 1000 nucleótidos es común) a
empresas especializadas. A partir de ese ADN podemos obtener nuestras sondas en el
laboratorio (ver más abajo). Pero incluso, se pueden comprar las sondas ya marcadas, con lo que
nos ahorramos una gran cantidad de tiempo en el laboratorio.

Sin embargo, en muchos casos no conocemos la secuencia de bases del gen deseado por lo
que hay que averiguarlo primero para obtener posteriormente la sonda. Para obtener una sonda
hay primero que clonar la secuencia de bases del gen (ARN mensajero) que queremos
detectar. Clonarimplica realizar una serie de pasos. 1) Una vez purificado el ARN de nuestro
tejido, los ARN mensajeros se retrotranscriben (transcripción inversa), es decir, se hacen copias
complementarias de ADN de todos los fragmentos de ARN mensajero. Se obtienen hebras de
ADN denominadas cDNA(ADN clonado). 2) Mediante la técnica de PCR ("polymerase chain
reaction") se consiguen multitud de copias de manera específica de la secuencia que queremos
estudiar. 3) Dichas copias se integran en un plásmido y posteriormente se introduce en bacterias.
4) Se cultivan las bacterias para que proliferen y así también conseguir gran número de copias
de los plásmidos, que se duplican en cada división bacteriana. 5) Los plásmidos se extraen y
purifican. 6) Mediante un proceso de transcripciónsimilar al que ocurre en el núcleo de las
células, a partir de estos plásmidos se consiguen numerosas réplicas de ARN complementarias a
nuestra secuencia inserta, que será también complementaria a la secuencia del ARN mensajero
que queremos detectar. El resultado de la transcripción realizada repetidas veces es un gran
número de cadenas de ARN denominadas sondas. Durante su síntesis es cuando se añaden los
nucleótidos conjugados con las moléculas marcadoras que nos servirán para detectarla una vez
la hibridación se haya producido. Normalmente son moléculas pequeñas como la digoxigenina y
 la biotina, aunque también se pueden utilizar moléculas fluorescentes, que se unen a los
nucleótidos que formarán parte de la sonda.

Proceso de hibridación

Una vez sintetizada la sonda marcada, se pone en contacto con el tejido e hibridará con
aquellos ARN mensajeros que sean complementarios. El lugar de hibridación se pondrá de
manifiesto cuando detectemos nuestro marcador unido a la sonda (por ejemplo, digoxigenina)
con un anticuerpo conjugado con un ezima (por ejemplo, la fosfatasa alcalina).

Esquema resumido del proceso de hibridación in situ. NBT (nitro blue tetrazolium) y el
BCIP (5-Bromo-4-chloro-3-indolyl fosfato, sal de toluidina) son los sustratos de la
fosfatasa alcalina.
Imagen que muestra neuronas (de color azul) que expresan el receptor D1 para la
dopamina en el cerebro ventral de una lamprea.
Esquema del proceso de hibridación in situ sobre secciones de criostato.

La hibridación in situ se puede combinar con otras técnicas como la inmunocitoquímica o

tinciones generales.

6. O BSERVAC Ió N
El último paso de todo proceso histológico es la observación del resultado producido por la
técnica realizada. El poder de resolución del ojo humano es de 0,2 mm (poder de resolución:
distancia mínima a la que se discriminan dos puntos), mientras que una célula eucariota típica
suele tener unas dimensiones que oscilan entre 10 y 50 micrómetros (µm; 1 µm = 10-6 mm).
Además, si queremos estudiar la ultraestructura celular hay que tener en cuenta que el grosor de
una membrana celular es de unos 7 nanómetros (nm; 1 nm = 10 -6 µm), mucho más pequeña.
Todo ello implica que necesitamos aparatos que nos permitan aumentar la imagen que
obtenemos de las muestras para discriminar estructuras tisulares diminutas como son las células
o sus compartimentos. Estos aparatos se llaman microscopios.

Hay dos tipos de microscopios: los ópticos y los electrónicos.

Los microscopios ópticos, o de campo claro, utilizan la luz visible y lentes de cristal que
permiten un aumento de las muestras de unas 1000 veces, con un poder de resolución de unos
0,2 micrómetros. Ésta es la máxima resolución que permite la luz visible por sus propiedades de
onda. Los microscopios se usan para observaciones generales, características celulares y
tisulares, y están presentes en todos los laboratorios de histología.

Los microscopios electrónicos se basan en la alta frecuencia de los electrones para

conseguir un poder de resolución de 1 nanometro. Se usan para observar la ultraestructura de la
célula y los tejidos, es decir, para estudiar el nivel subcelular, como orgánulos, membranas u
organizaciones moleculares (por ejemplo, se pueden observar los ribosomas). Hay dos tipos de
microscopios electrónicos: los de transmisión, que se usan para estudiar la ultraestructura de la
célula en secciones muy finas, y el de barrido, que permite estudiar superficies.

A los microscopios, sobre todo los ópticos, se les pueden añadir dispositivos que permiten
ampliar su potencialidad. Por ejemplo, al microscopio óptico se le puede adaptar una fuente
luminosa y una serie de filtros para observar moléculas fluorescentes, o filtros para destacar
cambios de densidad en el tejido, etcétera. A las diferentes formas de utilizar los microscopios
para la observación de características de los tejidos se les llama microscopía. Así podemos
hablar de microscopía óptica de contraste de fase, de fluorescencia, electrónica, etcétera.
M ICRO S CO P IO Ó P TICO
El microscopio óptico es un elemento esencial para los estudios generales de histología
puesto que es el que nos permite observar las diferentes características morfológicas de las
células y los tejidos. Se basa en el uso de lentes para aumentar los rayos de luz que atraviesan
una muestra de tejido. Su invención se remonta al siglo XVII. Desde entonces se ha ido
perfeccionando hasta llegar a los modernos microscopios. Durante estos siglos, el mayor avance
en cuanto a perfección y calidad se ha producido en su principal elemento, las lentes, las cuales
aumentan la imagen de las secciones de tejido y permiten hacer visibles al ojo humano detalles
nítidos que de otra manera sería imposible observar.

Los microscopios ópticos tienen un límite máximo de resolución de 0,2 µm. El poder de
resolución es la distancia mínima a la que se pueden discriminar dos puntos. Este límite viene
determinado por la longitud de onda de la fuente de iluminación, en este caso la luz visible.

Contiene normalmente dos sistemas de lentes: el objetivo y el ocular. El objetivo recoge la

luz que atraviesa la sección de tejido, mientras que el ocular es el que proyecta la imagen sobre
la retina. El aumento total que permite un microscopio óptico se calcula multiplicando la
magnificación que produce el objetivo por la que produce el ocular. Por ejemplo, si estamos
usando un objetivo de 40x (aumenta 40 veces) y un ocular de 10x (aumenta 10 veces), el
resultado final sera de 400x, es decir, vemos la muestra aumentada 400 veces. Usando
microscopios ópticos avanzados se consiguen unos 1000-1500 aumentos (objetivo de 100x junto
con oculares de 10x o 15x). Algunos microscopios ópticos tienen lentes internas que producen
aumentos adicionales que tendremos que tener en cuenta para calcular la magnificación de la
imagen que se observa. No debemos confundir los aumentos con el poder de resolución. Por más
que consigamos aumentar una imagen tomada de un microscopio, incluso con metodología
digital, no se puede aumentar la resolución de la imagen.

PARTES del MICROSCOPIO

Un microscopio óptico compuesto está formado por las siguientes partes:

Oculares. Son las lentes que forman la imagen que observaremos con nuestros ojos.
Todos los microscopios actuales poseen dos oculares, uno para cada ojo. Por eso a los
microscopios actuales se les llama binoculares. Los primeros microscopios eran monoculares, es
decir, poseían un solo ocular. Hay que tener en cuenta que en los microscopios más avanzados
tanto el objetivo como el ocular suelen estar compuestos por varias lentes. Al menos uno de los
 oculares puede regularse para alejar o acercar la lente al objetivo, permitiendo ajustar el enfoque
a las condiciones de visión, dioptrías, de cada observador.

Partes de un microscopio compuesto.

Objetivos. Los objetivos son las lentes que reciben la lux directamente tras atravesar la
sección histológica y quizá sean los elementos más importantes del microscopio. Hoy en día los
microscopios ópticos poseen un tambor o revólver donde se encuentran varios objetivos. Cada
uno de ellos posee lentes que permiten diferentes aumentos. Las magnificaciones de los
objetivos más usados suelen ser de 4x, 10x, 20x, 40x y 100x. Rotando el revólver se puede
seleccionar el objetivo y por tanto el aumento al que queremos observar la preparación. Aparte
de los aumentos, los objetivos tienen una serie de características para mejorar la imagen. Así,
pueden ser acromáticos, de fluorita o apocromáticos, los cuales corrigen alteraciones cromáticas,
de campo plano que eliminan la curvatura del campo de observación, de contraste de
interferencia, etcétera.

Cuando se usan objetivos de 100 aumentos (100x) es necesario emplear un líquido

denominado aceite de inmersión , que se añade entre el objetivo y la muestra. Esto es debido a
que la refracción de la luz es alta en el aire y provoca alteraciones en la imagen que se
manifiestan cuando se usan objetivos con esta capacidad de aumento. El aceite de inmersión
reduce enormente esta refracción permitiendo imágenes mucho más nítidas.
Imágenes resultantes del uso de objetivos con diferentes aumentos (especificados en las
imágenes) al observar un epitelio estratificado plano queratinizado.

Platina. Es la plataforma donde se coloca el portaobjetos con nuestro tejido. Posee un

dispositivo para sujetar el portaobjetos, el cual se puede desplazar en el plano de la
platina, movimiento controlado manualmente.

Condensador. Es un dispositivo con una lente que concentra y focaliza la luz proveniente
de la fuente sobre la sección de tejido.

Diafragma. Se sitúa entre la fuente luminosa y el condensador. Permite aumentar

el contraste de la muestra y la profundidad de campo, es decir, el espesor de la muestra que está
enfocado.

Lámpara luminosa. Es la que proporciona la luz que atraviesa la sección de tejido.

Inicialmente se usaba la luz natural, la cual se podía concentrar en la sección de tejido mediante
espejos cóncavos. Actualmente se usa una lámpara cuyo haz de luz atraviesa el diafragma, el
condensador, la muestra, y tras ello penetra por el objetivo y atraviesa los oculares hasta
nuestros ojos. La intensidad de la fuente luminosa se puede regular mediante un reostato.

Macrométrico y micrométrico. El enfoque de la muestra se consigue variando la

distancia de la muestra a la lente del objetivo. Esta distancia depende de los aumentos que
produzca el objetivo, mayor distancia cuanto menores aumentos, y del tipo de objetivo. La
distancia se controla mediante dos ruedas denominadas macrométrico y micrométrico,
respectivamente. La primera permite movimientos ascendentes y descendentes amplios de la
platina y la segunda ajustes finos.
Recorrido de la luz desde la fuente, pasando a través de los diferentes lentes de un
microscopio básico, hasta el observador.

Partes del microscopio óptico. Adaptación a las dioptrías del observador.

MODIFICACIONES
Contraste de fase. Esta modificación del microscopio de campo claro necesita de
objetivos especiales y se basa en el ligero retraso que sufre la luz cuando pasa por las estructuras
tisulares en función de su densidad. De esta manera se consiguen diferentes luminosidadespara
distintas estructuras tisulares. Se emplea para ver muestras sin teñir o acuosas, así como células
vivas, por ejemplo en cultivos celulares.

Campo oscuro. La observación en campo oscuro es un buen sustituto del contraste de fase
para observar especímenes sin teñir o medios acuosos. Consiste en la incorporación de un objeto
opaco bajo el condensador, entre la fuente luminosa y la sección de tejido. Este objeto sólo deja
pasar la luz más lateral que incidirá sobre la muestra de forma oblicua y sólo aquella luz que sea
reflejada por la muestra llegará a los objetivos. Allí donde no haya tejido aparecerá obscuro y
distintas densidades o propiedades del tejido reflejarán diferente cantidad de luz.

Contraste de interferencia y Nomarski. Este tipo de microscopía aparece sólo en los

microscopios más avanzados y supone tener objetivos especiales. Estos métodos dan a los
tejidos un aspecto tridimensional, es decir, aumentan la profundidad de campo (espesor de tejido
que está simultáneamente enfocado, es decir, que se ve nítidamente). Se basa en el uso de filtros
que polarizan la luz, lo cual consiste en dejar pasar sólo a la ondas electromagnéticas que vibran
en un determinado plano. Posteriormente pasan por un prisma que reagrupa esta luz en
elementos separados por una distancia que es similar al poder de resolución del objetivo que se
está usando. Existe un prisma para cada objetivo. Entonces la luz pasa por el muestra y
las diferencias de densidad del tejido, como los bordes de las células o densidades del interior
celular o matriz extracelular, provocarán alteraciones en la luz que se dirige hacia los objetivos,
los cuales transformarán esas diferencias en cambios en la luminosidad. Todavía existe
una lente adicional entre el objetivo y los oculares que permiten modular la luminosidad aún
más.

VARIANTES
Estereomicroscopio. También se llama microscopio de disección, lupa binocular o
simplemente lupa. Se utiliza normalmente para manipular muestras pequeñas o para observar
características que no requieren grandes aumentos, entre 7 y 40 X de aumentos, aunque pueden
llegar hasta 100x. Pueden observarse las muestras con difernte aumentos, lo que se consigue
mediante un sistema de zum o intercambiando objetivos. Al ser binoculares se observan los
objetos en tres dimensiones y tienen una gran distancia focal, es decir, las muestras se sitúan
lejos de los objetivos, con lo que la manipulación es más fácil. La iluminación de la muestra
puede venir de diferentes fuentes, que pueden ser externas.

FLUORESCENCIA
El microscopio de fluorescencia se usa para observar sustancias fluorescentes
denominadas fluoróforos. Una molécula fluorescente es aquella que es capaz de captar radiación
electromagnética con una longitud de onda determinada y emitir otra radiación electromagnética
con otra longitud de onda diferente, normalmente dentro del espectro de la luz visible. Los
fluoróforos se utilizan como marcadores para la detección de otras moléculas tisulares,
normalmente mediante la técnica de inmunofluorescencia. Los usados en microscopía absorben
en el rango de la luz ultravioleta, normalmente producida por una lámpara de mercurio, y emiten
en el rango de la luz visible. Para seleccionar el rango de longitud de onda con que serán
iluminados se utilizan filtros específicos localizados entre la fuente y la muestra que sólo dejan
pasar un determinado rango de frecuencias. Con un tambor de filtros se consigue iluminar la
muestra con diferentes rangos de ondas electromagnéticas y por tanto activar selectivamente a
diferentes fluoróforos.

La microscopía de fluorescencia nos permite usar más de un fluoróforo para

detectar varias moléculas tisulares de forma simultánea siempre que los espectros de absorción y
emisión de estos fluoróforos no se solapen, puesto que entonces sería imposible discriminarlos.
Imágenes de fluorescencia. A la izquierda, inmunocitoquímica para el neuropétido Y en
cerebro de rata, utilizando el fluoróforo Texas-Red. A la derecha, motoneuronas en el
encéfalo de lamprea marcadas con el trazador neuronal fluoresceína que es en sí mismo
un fluoróforo. Cada uno de los fluoróforos se ha estimulado con frecuencias diferentes y lo
que se observa es la emisión en el espectro de la luz visible de cada uno de ellos, rojo y
verde, respectivamente.

Una aplicación más avanzada de la fluorescencia se da en los microscopios confocales, los

cuales permiten eliminar la luz difusa procedente de fluoróforos que están en el tejido fuera del
plano de enfoque. Esta luz difusa, que aparece en los microscopios de fluorescencia
convencionales, provoca una difuminación y pérdida de nitidez de la imagen. Por tanto, con el
microscopio confocal se consiguen imágenes mucho más nítidas y mediante la digitalización y
solapamiento de planos de foco sucesivos se pueden conseguir imágenes tridimensionales.

M ICRO S CO P IO ELECTR Ó NICO

Cuando se quieren observar estructuras celulares que están por debajo del límite de
resolución del microscopio óptico, como algunos orgánulos, membranas, estructuras citosólicas,
complejos moleculares de la matriz extracelular o virus, se recurre al microscopio electrónico.
Se inventó en la primera mitad del siglo XX y su aplicación a la histología desveló las
estructuras celulares más pequeñas denominadas en su conjunto ultraestructura celular. Por
tanto, observar ultraestructuralmente a la célula significa observarla con el microscopio
electrónico. Este tipo de microscopio tiene un límite de resolución más pequeño que 1
nanómetro gracias a que no usa la radiación electromagnética de la luz visible sino la alta
frecuencia de un haz de electrones que incide sobre la muestra, y permite aumentos de varios
millones de veces.

El microscopio electrónico no usa lentes sino imanes que concentran los haces de
electrones emitidos por un filamento. Normalmente son aparatos grandes puesto que el viaje de
 los electrones tiene que ocurrir en vacío. Por eso, son grandes tubos dentro de los cuales se crea
y manipula el haz de electrones.

En histología se usan dos tipos de microscopios electrónicos: de transmisión y de barrido.

Microscopio electrónico de transmisión

En este tipo de microscopio electrónico se produce el haz de electrones en un filamento de

tungsteno que funciona como cátodo. Los electrones se condensan mediante electroimanes y se
focalizan sobre una sección de tejido. Las secciones de tejido deben ser muy finas, se
denominan ultrafinas (de unas decenas de nanómetros), para permitir que sean atravesadas por
los electrones y para conseguir imágenes nítidas. Previamente las secciones deben ser tratadas
con metales pesados como el osmio, el plomo y el uranilo. La función de estos metales es
similar a las tinciones usadas en el microscopio óptico, dar color a las estructuras celulares, pero
sólo en tonalidades de grises. Estos metales se concentran fundamentalmente en membranas y
en los complejos macromoleculares. Los electrones que chocan con estos metales rebotarán y no
cruzarán el tejido. Aquellos que consigan atravesar el tejido chocarán contra una pantalla
fluorescente que emitirá un destello luminoso tras cada choque. Esa imagen emitida por
la pantalla fluorescente es la que podemos observar nosotros. Por ello las imágenes observadas
con el microscopio electrónico son siempre en blanco y negro, aunque posteriormente se pueden
colorear con un ordenador.

Comparativa de la composición básica de un microscopio óptico (izquierda), electrónico

de transmisión (centro) y electrónico de barrido (derecha).
Imágenes tomadas en con microscopio electrónico de transmisión. Se puede ver la
capacidad de estos microscopios observando el incremento de resolución de las
imágenes de izquierda a derecha. Las líneas negras de la imagen de la derecha
corresponden a las membranas celulares.

Microscopio electrónico de barrido

Los microscopios electrónicos de barrido sirven para observar superficies tisulares. Ello es
posible porque los electrones no atraviesan la muestra sino que interaccionan con su superficie y
rebotan. Para que esto ocurra hay que cubrir a la muestra con una máscara de metales que se
adapta perfectamente al relieve de la muestra. La muestra se barre con el haz de electrones y
los electrones reflejados por un punto de la superficie son captados por una pantalla
receptora que creará una imagen en una pantalla digital. La imagen completa se formará cuando
el haz recorra toda la superficie de la muestra y se consiga información de cada uno de los
puntos. Es decir, se escanea la muestra, y de ahí el nombre de microscopio de barrido, o en
inglés "scannig".

Por supuesto, las muestras que se observan no son secciones, sino porciones de órganos
con superficies de interés. Se pueden observar superficies de secciones hechas con un vibratomo
o con un microtomo de congelación, pero no aquellas que han sido incluidas en resina o
parafina.
Imágenes obtenidas con un microscopio electrónico de barrido. Muestran el interior del
canal central de una médula espinal de lamprea. Se pueden observar numerosos cilios
(con más detalle en B) y pequeñas microvellosidades en los dominios apicales de las
células que forman las paredes de dicho canal. (Ver imagen de barrido de estomas de
una hoja).