Apuntes para quiz #1 de Laboratorio de biología celular.

En la naturaleza encontramos que la unión de elementos químicos como el hidrógeno, carbono,

nitrógeno, oxigeno, fosforo entre otros forman parte de todos los organismos del planeta.

Estos elementos se unen para formar diferentes biomoléculas como carbohidratos, aminoácidos,

lípidos, ácidos nucleicos y proteínas; dichas biomoléculas forman parte integral de los diferentes

tipos de células, las membranas celulares, organelas y metabolitos que permiten interacciones que

evidencia el fenómeno conocido como vida.

Es por esto que se han diseñado diferentes pruebas químicas para la detección de estas

biomoléculas de interés biológico; en esta práctica se usarán algunas de ellas en muestras de fácil

acceso.

Identificación de carbohidratos.

Prueba de Felhing

Identificación de polisacáridos.

Prueba de Lugol

Reconocimiento de lípidos:

Sudan III

Reconocimiento de proteínas

Reactivo de Biuret

1. Carbohidratos:

 Son compuestos orgánicos compuestos principalmente por carbono, hidrógeno y

oxígeno en una proporción de 1:2:1.

 Funcionan como la principal fuente de energía en la mayoría de los organismos.

 Se clasifican en simples (monosacáridos y disacáridos) y complejos (polisacáridos).

 Los monosacáridos (como la glucosa, la fructosa y la galactosa) son los bloques básicos
de los carbohidratos.

2. Aminoácidos:

 Son los bloques de construcción básicos de las proteínas.

 Contienen un grupo amino (-NH2) y un grupo carboxilo (-COOH) unidos a un carbono

central (alfa carbono).
  Hay 20 aminoácidos comunes en las proteínas, cada uno con una cadena lateral
(grupo R) que confiere propiedades únicas.

 Los aminoácidos se unen mediante enlaces peptídicos para formar cadenas

polipeptídicas, que a su vez se pliegan en estructuras tridimensionales para formar
proteínas.

3. Proteínas:

 Son macromoléculas formadas por una o más cadenas polipeptídicas.

 Tienen una estructura primaria (secuencia de aminoácidos), secundaria (hélices alfa y

láminas beta), terciaria (pliegues tridimensionales) y cuaternaria (interacciones entre
diferentes cadenas polipeptídicas).

 Las proteínas desempeñan una variedad de funciones en los organismos, incluida la

catálisis enzimática, el transporte de moléculas, la estructura celular y la regulación del
metabolismo.

4. Lípidos:

 Son una amplia clase de compuestos orgánicos que son insolubles en agua pero
solubles en solventes orgánicos como el cloroformo o el benceno.

 Los lípidos incluyen triglicéridos (grasas y aceites), fosfolípidos (componentes

principales de las membranas celulares), esteroides (como el colesterol y las hormonas
esteroides) y lípidos estructurales (como ceras).

 Son una reserva importante de energía en los organismos y también desempeñan

funciones estructurales, de transporte y de señalización en las células.

Estas son solo algunas de las características principales de estos grupos de compuestos biológicos.
Cada uno tiene una variedad de funciones y estructuras que son fundamentales para la vida
celular y los procesos fisiológicos en los organismos.

Los ácidos nucleicos (ADN y ARN) son moléculas en la cuales se encuentra la información

genética de todos los organismos en la naturaleza y se expresa a través de proteínas; esta

información en cada individuo se organiza mediante la interacción de nucleótidos en las

hebras del ADN y se transcribe en condiciones específicas mediante el ARN que origina

proteínas.

El ADN no solo está compuesto de información (genes) que origina proteínas, también esta

compuesto de muchas otras secuencias regulatorias que permite la expresión de los

mismos como transposones entre otros. Ambas moléculas (ADN y ARN) son polímeros de

nucleótidos formados por un grupo fosfato, un azúcar (desoxirribosa o ribosa) y una base
nitrogenada (purina o pirimidina). Hoy en día se llama al conjunto de ADN organizado en

los cromosomas que constituyen un individuo, genoma, mientras que a la expresión de la

información de ese genoma mediante el ARN en condiciones específicas se le denomina

transcriptoma.

Para poder estudiar el ADN ha sido necesario buscar estrategias químicas y físicas para

recuperar dichas moléculas ya que éstas se encuentran al interior de la célula. Estas

estrategias se les conoce como protocolos de extracción o recuperación de ADN los cuales

pueden ser de origen comercial o desarrollados en el laboratorio.

Generalmente los protocolos incluyen varias fases:

1. Selección de la muestra: En el proceso de recuperación de ADN de una muestra es

importante definir el tipo de organismo fuente (bacterias, tejido animal o vegetal,

huesos, hongos, virus etc). De acuerdo al tipo de muestra es necesario considerar

aspectos como la presencia de pared celular, elevados contenidos de polifenoles o alto

contenido de enzimas degradadoras de ADN (ADNasas); además de considerar si la

muestra proviene de un cultivo de laboratorio, de un bosque, del fondo del océano o de

los lixiviados de un basurero.

2. Ruptura celular: Para recuperar el ADN es necesario romper las células que lo

contienen, esto se puede lograr por procesos físicos como la congelación del tejido con

nitrógeno líquido y su posterior ruptura por maceración; también se puede realizar la

degradación de estructuras de la pared celular usando enzimas como proteasas o

lisozimas o implementando el uso de sonicación sobre la muestra.

3. Recuperación del ADN: Este proceso se puede llevar a cabo usando sustancias como

buffers de extracción seguidos de la aplicación de una solución de cloroformo/alcohol

isoamílico el cual permite separar la fase orgánica (proteínas y lípidos) de la inorgánica

en la cual se encuentra el ADN.

4. Precipitación de ADN: En esta etapa y después de usar varios ciclos de centrifugación

se logra precipitar el ADN usando etanol frio (70%-95%) sobre la solución que contiene

ADN. Seguido a esto se debe centrifugar nuevamente en frio para precipitar el ácido

nucléico y descartar el etanol; este paso es de especial cuidado ya que es muy fácil
perder el pellet de ADN si no se realiza remueve el etanol de forma lenta y progresiva.

5. Secado del ADN: Es necesario remover el exceso de etanol que aún queda en el ADN,

para esto se puede tomar los tubos que lo contienen y con la tapa abierta ubicarlo de

forma invertida en una cámara de flujo laminar por un tiempo determinado (10-30 min),

después del cual es necesario revisar que no existan residuos visibles de etanol.

6. Resuspención del ADN: El precipitado es disuelto con diferentes soluciones que

permiten la rehidratación de la molécula, para esto se puede usar H2O ultrapura a un

pH de 7 o una solución amortiguadora como el Tris-HCl 10mM o TE (Tris 10mM, EDTA

1mM) a un pH de 8.

7. Almacenamiento y conservación del ADN: El ADN recuperado debe ser recolectado,

almacenado y rotulado adecuadamente en tubos estériles y dispuesto en congelación a

-20 o -80 °C.

Los pasos anteriormente descritos pueden variar si se usan kits comerciales, ya que éstos

presentan columnas de retención para diferentes tipos de moléculas (proteínas, lípidos o

ácidos nucléicos).