Introduccin

La tincin de Gram o coloracin de Gram es un tipo de tincin

diferencial empleado en Se utiliza tanto para poder referirse a la morfologa
celular bacteriana como para poder realizar una primera aproximacin a la
diferenciacin bacteriana, considerndose Bacteria Gram positiva a las
bacterias que se visualizan de color moradas y Bacteria Gram negativa a las
que se visualizan de color rosa o rojo o grosella. Microbiologa para la
visualizacin
de
bacterias,
sobre
todo
en
muestras
clnicas.
El cristal violeta (colorante catinico) penetra en todas las
clulas bacterianas (tanto Gram positivas como Gram negativas) a travs de la
pared bacteriana.
El lugol es un compuesto formado por I2 (yodo) en equilibrio con KI (yoduro de
potasio) y Sl (Siulterio), los cuales estn presente para solubilizar el yodo, y
actan de mordiente, haciendo que el cristal violeta se fije con mayor
intensidad a la pared de la clula bacteriana. El I2 entra en las clulas y forma
un complejo insoluble en solucin acuosa con el cristal violeta.
La mezcla de alcohol-acetona que se agrega, sirve para realizar
la decoloracin, ya que en la misma es soluble el complejo I2/cristal violeta. Los
organismos Gram positivos no se decoloran, mientras que los Gram negativos
s
lo
hacen.
Para poner de manifiesto las clulas Gram negativas se utiliza
una coloracin de contraste. Habitualmente es un colorante de color rojo, como
la safranina o la fucsina. Despus de la coloracin de contraste las clulas
Gram negativas son rojas, mientras que las Gram positivas permanecen
azules.
La safranina puede o no utilizarse, no es crucial para la tcnica. Sirve para
hacer una tincin de contraste que pone de manifiesto las bacterias Gram
negativas. Al trmino del protocolo, las Gram positivas se vern azul-violceas
y las Gram negativas, se vern rosas (si no se hizo la tincin de contraste) o
rojas
(si
se
us,
por
ejemplo,
safranina).
Objetivos
Utilizacin de tcnicas sencillas para la observacin de microorganismo
Conocer o manejo del microscopio ptico para la observacin de bacterias
(importancia
del
objetivo
de
inmersin)
Conocer y manejar las unidades de medida de la clulas establecer
comparaciones entre tamaos de procariotas y de eucariotas
Reconocer

los

distintos

modelos

de

pared

bacteriana.

Materiales
Mechero
de
bunsen
o
de
alcohol
Asa
de
siembra
o
aguja
Enmangada
Pinza
Portaobjetos
Muestras bacterianas de origen natural : yogurt, sarro dental, suelo,
etc
Palillos
Microorganismos
Aceite
de
inmersin
Soporte
de
tinciones
Goteros
Agua
destilada
Colorantes
para la tincin: solucin de cristal violeta lugol safranina etanol 95
%
Cultivos:
cultivos
lquidos
y
slidos
de
escherichia
coli.,
streptoccocus sp., staphyloccus sp. Bacilus subtilis y klebsiella
sp.
Procedimiento
Primero prendimos el mechero y esterilizamos el asa hasta que tomo un color
rojo
vivo.
Ya esterilizada el aza procedimos a extraer la muestra del aurios, lo pusimos
en
el
portaobjetos.
Le agregamos una gota de agua luego extendimos suavemente la muestra y
lo
dejamos
secar
por
unos
momentos
en
el
mechero.
Posteriormente lo llevamos a la tina
y le agregamos a la
muestra
el
cristal
violeta.
y proseguimos a lavarlo con agua, despus que lavamos la muestra con
agua le agregamos lugol por un minuto, nuevamente lavamos con agua
entonces le agregamos gotas de alcohol acetona hasta que las gotas que
salan
quedaran
sin
color.
Al quedar sin color le aadimos una gota de agua y le agregamos 2 gotas
de
safranina
y
esperamos
dos
minutos.
Ya realizados estos pasos secamos la muestra con calor perro no tan
pegada al mechero
para que no se quemara la muestra.
Entonces colocamos la muestra en el microscopio y buscamos la
bacteria
El procedimiento realizado lo hicimos tambin con la bacteria
enterobacter.

Descripcin de la tincin de GRAM:

Las clulas fijadas al calor sobre un portaobjetos se tien, primero con una
solucin de cristal violeta (otros colorantes bsicos no son tan efectivos) y son
lavadas despus para quitar el exceso de colorante. En este estado, todas las
clulas, tanto las grampositivas como las gramnegativas, estn teidas de azul.
El portaobjetos se cubre entonces con una solucin de yodo-yoduro potsico.
El ingrediente activo es aqu el I2; el KI simplemente hace soluble el I2 en
agua. El I2 entra en las clulas y forma un complejo insoluble en agua con el
cristal violeta. De nuevo tanto las clulas grampositivas como las
gramnegativas se encuentran en la misma situacin.
Se lleva a cabo despus la decoloracin, usando una mezcla de alcoholacetona, sustancias en las que es soluble el complejo I2-cristal violeta. Algunos
organismos (grampositivos) no se decoloran, mientras que otros
(gramnegativos) lo hacen. La diferencia esencial entre esos dos tipos de
clulas est por tanto en su resistencia a la decoloracin; esta resistencia se
debe probablemente al hecho de que en el caso de bacterias gram-negativas,
la mezcla de alcohol/acetona es un solvente lipdico y disuelve la membrana
exterior de la pared de la clula (y tambin puede daar la membrana
citoplsmica a la que se une peptidoglicano). La delgada capa de
peptidoglicano es incapaz de retener el de complejo cristal violeta-yodo y la
clula se decolora. Las clulas grampositivas, a causa de sus paredes
celulares ms espesas (tienen ms peptidoglicano y menos lpido), no son
permeables al disolvente, provocando que el de complejo cristal violeta-yodo
quede atrapado dentro de la pared celular. Despus de la decoloracin las
clulas grampositivas son todava azules, pero las gramnegativas son
incoloras.
Para poner de manifiesto las clulas gramnegativas se utiliza una coloracin de
contraste. Habitualmente es un colorante de color rojo, como la safranina o la
fucsina bsica. Despus de la coloracin de contraste las clulas
gramnegativas son rojas, mientras que las grampositivas permanecen azules
Bacillus anthracis (Gram positivo) Pseudomonas aeruginosa (Gram negativo)
Deben destacarse algunos aspectos cruciales de la tincin de Gram:
1) El tratamiento con cristal violeta debe preceder al tratamiento con yodo. El
yodo por s solo tiene poca afinidad con las clulas.
2) EI proceso de decoloracin debe ser corto y es esencial un clculo preciso
del tiempo para evitar que pierdan la tincin las clulas grampositivas.
3) Cultivos de ms de 24 horas de teidos pueden perder su habilidad de
retener el complejo cristal violeta - yodo.