UNIVERSIDAD NACIONAL DE PIURA

FACULTAD DE MEDICINA HUMANA

AÑO DE LA
DIVERSIFICACIÓN
PRODUCTIVA Y DEL
FORTALECIMIENTO DE LA
EDUCACIÓN

PRACTICA DE LABORATORIO Nº3

Tinción de muestras microbiológicas

CURSO : MECANISMO, AGRESIÓN Y DEFENSA I

CICLO : IV

DOCENTE : Dr. CESAR TORRES DIAZ

ALUMNA : OJEDA GUERRERO ROSA INÉS

PIURA, SETIEMBRE 2015

 INTRODUCCION

Es muy importante conocer los diferentes tipos de bacteria, para poder realizar como
médicos o como profesionales de la salud un diagnostico verídico de lo pueda tener un
paciente.

Para esto es necesario tener un conocimiento de las diferentes pruebas que se hace
para detectar estos agentes infecciosos que pueden estar deteriorando la salud de las
personas, por eso debemos conocer las diferentes formas de bacterias que puedan
haber ya sea cocos, bacilos, espirilos entre otras.

Hoy en día existen muchas formas para poder identificar qué tipo de bacteria es ,pero
algunas veces son muy costosas ,por ese motivo se optan por métodos más
económicos como la detección por medio de coloraciones.
MARCO TEORICO

Tinción

Una tinción o coloración es una técnica auxiliar utilizada en microscopía para mejorar
el contraste en la imagen vista al microscopio. Los colorantes y tinturas son sustancias
que usualmente se utilizan en biología y medicina para resaltar estructuras en tejidos
biológicos que van a ser observados con la ayuda de diferentes tipos de microscopios.
Los diferentes colorantes pueden ser utilizados para aumentar la definición y examinar
grandes cortes de tejido como por ejemplo haciendo que resalte fibras musculares o
tejido conectivo, también poblaciones celulares y estas clasificando diferentes células
sanguíneas o incluso para resaltar organelas.

En bioquímica, se puede explicar esto se da agregando un colorante específico (esto

significa que se una de manera selectiva ya sea a ADN, proteínas, lípidos,
carbohidratos, etc.) a un sustrato para cualificar o cuantificar la presencia de un
determinado compuesto.

Fundamentos

La mayoría de las células bacterianas difieren en tamaño y por eso es que resultan
difíciles de ver con el microscopio óptico. La principal dificultad es la falta de contraste
entre la célula y el medio que la rodea, y el medio más simple de aumentar el
contraste es la utilización de colorantes. Generalmente pueden emplearse para
distinguir entre tipos diferentes de células o para revelar la presencia de determinados
constituyentes celulares, tales como flagelos, esporas, cápsulas, paredes celulares,
centros de actividad respiratoria, etc.

Las células generalmente son tratadas para coagular el protoplasma antes de teñirlas,
proceso llamado fijación. Para bacterias, la fijación por el calor es lo más corriente,
aunque también puede fijarse con sustancias químicas como formaldehido, ácidos y
alcoholes. Después de la fijación, si se añade el colorante, no se producen ulteriores
cambios estruturales en el protoplasma. La fijación se realiza habitualmente en células
que han sido fijadas sobre un portaobjetos, tratando después éste con el agente
fijador, y siguiendo inmediatamente el proceso de tinción. La fijación produce
habitualmente el encogimiento de las células; la tinción, por el contrario, hace que las
células aparezcan mayores que lo que son realmente, de manera que las medidas de
las células que han sido fijadas o teñidas no pueden realizarse con mucha precisión.

La mayoría de los colorantes son compuestos orgánicos que tienen alguna afinidad
específica por los materiales celulares. Muchos colorantes utilizados con frecuencia
son moléculas cargadas positivamente (cationes) y se combinan con intensidad con
los constituyentes celulares cargados negativamente, tales como los ácidos nucleicos
y los polisacáridos ácidos. Ejemplos de colorantes catiónicos son el azul de metileno,
el cristal violeta y la safranina. Otros colorantes son moléculas cargadas
negativamente y se combinan con los constituyentes celulares cargados
positivamente, tales como muchas proteínas. Esos colorantes incluyen la eosina, la
fucsina ácida y el rojo Congo. Otro grupo de colorantes son sustancias liposolubles;
los colorantes de este grupo se combinan con los materiales lipídicos de la célula,
usándose a menudo para revelar la localización de las gotículas o depósítos de grasa.
Un ejemplo de colorante liposoluble es el negro Sudán.

Algunos colorantes teñirán mejor sólo después de que la célula haya sido tratada con
otra sustancia química, que no es un colorante por sí mismo. Esta sustancia se
denomina mordiente; un mordiente habitual es el ácido tánìco. El mordiente se
combina con un constituyente celular y lo altera de tal modo que ahora sí podrá atacar
el colorante.

Si se desea simplemente incrementar el contraste de las células para la microscopía,

son suficientes los procedimientos simples de tinción. El azul de metileno es un buen
colorante simple que actúa sobre todas las células bacterianas rápidamente y que no
produce un color tan intenso que oscurezca los detalles celulares. Es especialmente
útil para detectar la presencia de bacterias en muestras naturales, puesto que la mayor
parte del material no celular no se tiñe.

La tinción negativa es el reverso del procedimiento de tinción usual: las células se

dejan sin teñir, pero se colorea en cambio el medio que las rodea. Lo que se ve, por
tanto, es el perfil de las células. La sustancia utilizada para la tinción negativa es un
material opaco que no tiene afinidad por los constituyentes celulares y que
simplemente rodea las células, tal como la tinta china (que es una suspensión de
particulas de carbono coloidal) o la nigrosina (un colorante negro insoluble en agua).
La tinción negativa es un modo satisfactorio de aumentar el contraste de las células en
la microscopia óptica, pero su máxima utilidad está en revelar la presencia de cápsulas
alrededor de las células bacterianas.

Los métodos de tinción son de gran utilidad, pero deben usarse siempre con
precaución, ya que pueden conducir a errores. Las moléculas de colorante forman en
ocasiones precipitados o agregados que parecen estructuras celulares auténticas,
pero que son formaciones completamente artificiales inducidas por el mismo colorante.
Tales estructuras se denominan artefactos, y deben tomarse muchas precauciones
para tener la seguridad de que no nos estamos equivocando al creer que un artefacto
es una estructura realmente existente.
Método de tinción

Sobre un portaobjetos de vidrio, limpio y seco, se coloca una gota del material que se
va a teñir (si es líquido) o se hace rodar el hisopo con que se tomó la muestra. Una
vez que el hisopo ha tocado la superficie del portaobjetos, que no está estéril, ya no
puede ser empleado para inocular los medios de cultivo. Puede usarse una aguja
estéril para transferir una pequeña cantidad de un cultivo bacteriano a la superficie del
portaobjetos. Este material es suspendido en una gota de agua o solución salina
previamente colocada sobre el portaobjetos. Cuando se trata de colonias muy
pequeñas que pueden perderse en una gota de líquido se emplea una varilla delgada
de madera estéril con la cual se toca la colonia obteniéndose así una fracción
apreciable del desarrollo. El material se frota directamente sobre el portaobjetos,
donde puede visualizarse con facilidad. El material colocado en el portaobjetos se deja
secar al aire o bien se pasa varias veces por la zona azul de la llama de un mechero
de Bunsen hasta que el vidrio esté tan caliente que moleste al tacto pero no queme.

Preparación de la tinción

Las etapas preparatorias involucradas en una tinción van a depender del tipo de
análisis planeado; bajo estas premisas se puede considerar que algunos o todos de
los siguientes pasos podrían requerirse.

Fijación: de por sí, esta etapa puede consistir en varios pasos. La fijación es una
modificación de las propiedades fisicoquímicas de las proteínas que forman una célula
o tejido y que tiene por finalidad preservar las formas de las células o tejidos tanto
como sea posible. A veces se puede utilizar una fijación por calor para matar, adherir y
alterar un espécimen de modo que acepte la tinción.

Permeabilización este paso implica el tratamiento de las células con un surfactante

suave. Este tipo de tratamiento tiene como finalidad disolver la membrana celular para
permitir que las grandes moléculas de colorante puedan acceder a las estructuras del
interior de las células.

Montaje frecuentemente implica adherir los cortes histológicos a un portaobjetos de

vidrio para su observación al microscopio o análisis. En algunos casos, se puede
cultivar a las células directamente sobre le portaobjetos. En muestras de células
sueltas, como las que se presentan en un extendido de sangre o de fluidos biológicos,
la muestra puede ser aplicada directamente sobre el portaobjetos. Para piezas de
tejido de mayor tamaño, se utiliza un micrótomo que corta la muestra en rodajas
sumamente delgadas. El montaje tiene por finalidad aumentar la resistencia mecánica
de una muestra que de otra manera sería extremadamente frágil, para que soporte el
proceso de teñido conservando lo más posible su estructura original.

Tipos de tinciones

TINCIÓN ADECUADA: Esta forma es la más simple, el verdadero proceso de tinción

puede implicar la inmersión de la muestra (antes o después de la fijación y el montaje)
en la solución colorante, seguido del aclarado que es un lavado para eliminar el
exceso de colorante y la observación.

TINCIÓN DIRECTA: Hablamos de tinción directa cuando el colorante interacciona

directamente con el sustrato, sin otro tratamiento previo.

TINCIÓN INDIRECTA: Se denomina de este modo a las tinciones que hacen uso de
un mordiente. Un mordiente habitual es el ácido tánico.

Colorantes usados en tinciones

AZUL BRILLANTE DE COOMASSIE: (también conocido como azul brillante) es un

colorante que tiñe en forma no específica a todas las proteínas con un fuerte color
azul. Se utiliza frecuentemente para teñir las corridas de proteínas en las electroforesis
en gel.

AZUL DE METILENO: se utiliza para teñir células animales, para hacer más visibles
sus núcleos. Es también utilizado para teñir los extendidos de sangre para ser
utilizados en citología y como colorante vital en el recuento de reticulocitos.

AZUL NILO: es decir, azul Nilo, tiñe los núcleos de color azul. También puede ser
utilizado para teñir células vivas.

BISMARCK BROWN: también conocido como Bismarck brown Y o Manchester brown)

imparte un color amarillo a las mucinas ácidas. Se puede utilizar con células vivas.

BROMURO DE ETIDIO: se intercala en el ADN y le otorga un color rojo naranja

fluorescente. A pesar de que no es capaz de teñir células vivas ya que no atraviesa las
membranas intactas, puede ser utilizado para identificar células que se encuentran en
las etapas finales de la apoptosis, ya que tales células poseen unas membranas
mucho más permeables. Por el mismo motivo, el bromuro de etidio es utilizado como
un marcador de apoptosis en poblaciones celulares y para localizar las bandas de
ADN en una corrida en electroforesis en gel. Este colorante puede ser utilizado en
combinación con naranja de acridina (NA) en el conteo de células viables. Esta tinción
combinada BE/NA le otorga a las células vivas un color verde fluorescente mientras
que las células apoptóticas aparecen con la distintiva fluorescencia rojo-naranja.

CARMÍN: es un colorante de un intenso color rojo que puede ser utilizado como sal de
litio para teñir glicógeno, mientras que las sales de alumbre-carmín son colorantes que
se adhieren al núcleo. Las tinciones con carmín requieren del uso de un mordiente,
que usualmente es aluminio o alumbre.
CRISTAL VIOLETA: este al ser combinado con un mordiente adecuado, tiñe las
paredes celulares de color púrpura. El cristal violeta es un componente importante en
la coloración de Gram.

DAPI: es un colorante nuclear (tiñe el núcleo) fosforescente, se excita con luz

ultravioleta para producir una fuerte fluorescencia azul cuando se encuentra unido al
ADN.

EOSINA: se utiliza más frecuentemente como contracoloración de la hematoxilina,

impartiendo un color que va del rosado al rojo al material citoplasmático, membrana
celular, y algunas estructuras extracelulares. Además imparte un fuerte color rojo a los
eritrocitos.

FUCSINA ÁCIDA: puede ser utilizada para colorear colágeno, músculo liso o
mitocondrias. Forma parte de la coloración tricrómica de Mallory donde se utiliza para
colorear núcleo y citoplasma. En la tinción de Van Gieson (picrofucsina), la fucsina es
la responsable de dar el color rojo a las fibras de colágeno. También es una coloración
tradicional para colorear mitocondrias (método de Altmann).

HEMATOXILINA: es un colorante nuclear. Utilizado con un mordiente, la hematoxilina

tiñe los núcleos celulares de color azul violeta a negro. Con gran frecuencia se utiliza
en combinación con eosina en la coloración H&E (hematoxilina y eosina), una de las
más comunes utilizadas en histología.

HOECHST: es un compuesto derivado bis-benzimidazol que se une al surco menor del

ADN. Se utiliza con frecuencia en microscopía de fluorescencia para colorear el ADN.
Hoechst tiene color amarillo cuando se encuentra disuelto en agua, y emite luz azul
cuando recibe luz ultravioleta.

LUGOL: se utiliza en química analítica como indicador para el almidón. Cuando se

mezcla almidón con una solución de yodo, se desarrolla un color intensamente azul,
representando la formación del complejo de inclusión yodo/almidón. El almidón es una
sustancia muy común en la mayor parte de las células vegetales, de modo que una
solución diluida de yodo puede colorear el almidón presente en las células. El yodo
también es componente de la coloración de Gram utilizada en microbiología. La
solución de Lugol o Lugol yoduro (IKI) es una solución de color marrón que se torna
negra en presencia de almidones y puede ser utilizada para colorear células, haciendo
más visible el núcleo. En la coloración de gram el yoduro se utiliza como mordiente,
aumentando la capacidad del colorante para entrar en las células a través de los poros
presentes en la membrana o pared celular.

NARANJA DE ACRIDINA: es un colorante fluorescente, catiónico y selectivo para

ácidos nucleicos útil para demostraciones sobre el ciclo celular. Es capaz de atravesar
la membrana celular e interactúa con el ADN y el ARN por intercalación o
interacciones electrostáticas. Cuando se une al ADN presenta un espectro muy similar
al de la fluoresceína. Al igual que la fluoresceína, se puede utilizar también como una
tinción inespecífica para dar un trasfondo fluorescente (contraste) a tinciones
convencionales en la superficie de muestras sólidas de tejidos (coloración de contraste
fluorescente).
MORFOLOGÍA ULTRAMICROSCÓPICA DE LAS BACTERIAS: ESTRUCTURAS
INTERNAS

Pared celular

Debajo de las sustancias extracelulares, como son las cápsulas y cubiertas

mucilaginosas, y en la periferia de una delicada membrana que está en inmediato
contacto con el citoplasma, se encuentra la pared celular, que es una estructura rígida
que da forma a la célula. Las paredes celulares pueden destruirse o romperse en
condiciones especiales.

Constituyentes importantes de la pared celular son los aminoácidos, aminoazúcares,

azúcares y grasas. Estas sustancias (proteínas, Hidratos de carbono, grasas) están
enlazadas formando el polímero complejo que forma la pared celular.

Entre los constituyentes de la pared celular de las bacterias Gram-positivas y Gram-

negativas existen importantes diferencias. Por ejemplo, las paredes de las bacterias
gram-positivas contienen menos aminoácidos que las gram-negativas; el contenido
graso es mucho más elevado en las gram-negativas que en las gram-positivas. Este
hecho se ha propuesto como explicación del mecanismo de la reacción al gram (ver
las dos imágenes juntas).

Materiales usados en las tinciones

Colorantes para la coloracion

 Safranina
 Cristal violeta
 Alcohol cetona
 Lugol

Laminas portaobjetos

COLORACION GRAM

 Cristal violeta por 1minuto

 Lugol de 1 a 2 minutos
 Alcohol cetona 15 segundos
 Safranina 30 segundos

OBSERVACIONES Y RESULTADOS
LAMINA Nº1

Coloración gram positiva, en esta muestra 1 se puede observar cocos agrupados.

LAMINA Nº2

En la muestra observamos en mayor cantidad bacterias gram positivas

LAMINA Nº3
 Se observa algunos cocos agrupados con coloración gram positiva

CONCLUSIONES

La coloración de Gram si es un método efectivo a para poder identificar claramente a

las bacterias en el microscopio observando Gram positivas y Gram negativas, nos
daremos cuenta viendo la coloración diferente de estas.

Podemos observar que la mayoría de las bacterias eran cocos y estaban agrupadas.
BIBLIOGRAFIA

http://www.microinmuno.qb.fcen.uba.ar/SeminarioTinciones.htm

https://es.wikipedia.org/wiki/Tinci%C3%B3n

http://www.medigraphic.com/pdfs/invdis/ir-2014/ir141b.pdf