Recuento de células: hemocitómetro

Publicado enMES DE JULIO 13, 2021

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El hemocitómetro es un portaobjetos especial que se puede utilizar para contar celdas. El usuario
cuenta el número de celdas manualmente., dentro de un volumen de líquido, bajo un microscopio.

Tomando una descripción general rápida, se puede afirmar que el hemocitómetro tiene dos rejillas
que forman áreas cuadradas de tamaño definido (1 lado mm, ver figura a continuación) y,
colocando un cubreobjetos en el hemocitómetro, se forma un espacio de volumen definido.

Esta es la cámara de recuento en la que un volumen conocido de suspensión celular (10 µl) se
puede pipetear.

A continuación, el personal de cultivo celular puede contar fácilmente las células mirando el
portaobjetos con un microscopio..

hemocitómetro

Un hemocitómetro, con el cubreobjetos encima, formando dos (Superior e inferior) recuento de

cámaras

vista lateral de un hemacitómetro.

Vista lateral de un hemocitómetro. Se resalta la cámara de conteo formada entre la corredera de

la puerta y el cubreobjetos..

rejilla de hemocitómetro

rejilla de hemocitómetro
CÁLCULO DEL NÚMERO DE CELDA

Intentemos entender cómo funciona un hemacitómetro y cómo calcular la concentración de

células o la densidad de las células. (y el número total de células en el matraz), una vez que han
sido contados.

Cada una de las dos rejillas del hemocitómetro (cámara 1 y 2) es un cuadrado con un lado de 3
mm.

El cuadrado está dividido por 3 líneas equidistantes verticales y horizontales que forman 9
cuadrados con un lado de 1 mm.

El área de cada cuadrado (rojo en el diagrama de arriba) es, por lo tanto 1 mm2.

Colocar un cubreobjetos en el hemocitómetro forma una cámara que es 0.1 mm de alto (ver la
segunda figura).

El volumen de suspensión celular incluido en un 1 mm2 cuadrado (resaltado en rojo en la figura

siguiente) será por lo tanto 1mm2 x 0,1 mm = 0,1 mm3.

Desde 1 ml de agua = 1 cm3, luego 0.1 mm3 = 10-4 ml

En otras palabras, EL NÚMERO de celdas incluidas en el área de un cuadrado (rojo), son los
contenidos en 10-4 ml de suspensión celular.

Para saber la cantidad de celdas en 1 ml, bastará con dividir el número de células contadas en un
pequeño cuadrado rojo por 10-4 ml, es decir. multiplica el número de celdas x 104.

La 4 los cuadrados de las esquinas de la cuadrícula principal se dividen en 16 celdas más pequeñas.
El cuadrado central de la cuadrícula principal se divide en 16 cuadrados más pequeños, cada uno
de los cuales se divide nuevamente en 16 cuadrados más pequeños.

TEstas divisiones adicionales se realizan para contar las celdas más pequeñas., como los glóbulos
rojos, pero generalmente no se usan para cultivos celulares.

PROTOCOLO: CONTEO CELULAR MEDIANTE HEMOCITÓMETRO

Prepare el hemocitómetro:

Limpiar cuidadosamente el vidrio con 70% alcohol y un pañuelo de papel suave para evitar rayar la
superficie

limpiar el cubreobjetos de la misma manera

poner 4 pequeñas gotas de agua (1 la) sobre el 4 esquinas del cubreobjetos y presiónelo en las
ranuras para que se adhiera

Prepara las celdas:

Para contar células con un hemacitómetro, necesitarás una suspensión de células.

Si las células crecen en suspensión, sólo necesitará pipetear una cantidad adecuada (10 la)
volumen de suspensión celular en la cámara del hemocitómetro.

Si las células crecen adhiriéndose al soporte, primero necesitarás tripsinizarlos (según el protocolo
específico para sus células), centrifugarlos y resuspenderlos en un (conocido!) volumen de medio
fresco en un tubo de epp o Falcon.

En la suspensión celular debe evitarse la presencia de aglomeraciones celulares., para evitar

errores en el conteo. Es necesario pipetear con cuidado hacia arriba y hacia abajo para dispersar
los grumos..

Consejos

Si hay demasiadas células en suspensión (número > 100 por cuadrado de conteo, área roja en la
imagen de la cuadrícula del hemocitómetro), será necesario diluir la suspensión por ejemplo 1: 1,
agregando 10 ul de suspensión celular y 10 ul de medio fresco en un nuevo epps. Pipeta 10 ul de
esta suspensión (diluido 1: 2) y contar (multiplicar por el factor de dilución para los cálculos, pero
veremos más adelante en esta publicación)

Si también va a determinar la viabilidad celular, Deberá agregar un tinte de viabilidad como el

tripán. (1: 1 la dilución generalmente funciona mejor), pero lo veremos en otra publicación.

si las celdas son muy pocas (< 30 por recuento cuadrado), ellos necesitarán estar concentrados.
Bastará con centrifugar la suspensión celular. (100 g para 5 minutos) y resuspenderlo en un
(conocido!) menor volumen de medio.

Antes de cualquier muestreo, es necesario resuspender las células con cuidado., recuerde que las
células tienden a asentarse en poco tiempo.

Si toma de la parte superficial de la suspensión celular, sin haber resuspendido cuidadosamente,

corre el riesgo de tomar menos células y, por lo tanto, introduciendo un error en su recuento.
cargar la suspensión celular en el hemocitómetro.

Con 1 micropipeta, llevar 10 ul de la suspensión celular a contar,

Coloque el orificio de la punta de la pipeta en el espacio entre el cubreobjetos y la cámara

y pipetear la suspensión celular, que entrará en el pequeño espacio de la cámara de recuento por
capilaridad.

Para que esté bien cargado, debe observar que el fluido se distribuye uniformemente para cubrir
toda la rejilla y la cámara de conteo

En presencia de burbujas es necesario rehacer el relleno., porque con estos pequeños volúmenes,
incluso pequeñas burbujas de aire pueden causar grandes errores!

contar celdas

transferir el portaobjetos a la platina del microscopio.

Seleccione un 10 × objetivo y enfoque en las líneas de cuadrícula de la cámara

Mueva la diapositiva para que el campo que ve sea el cuadrado rojo en la imagen, que es el área
más grande que puedes ver delimitada por tres líneas paralelas. Esta zona es 1 mm2.

Con un estándar 10 × lente esta área casi llenará el campo, o las esquinas estarán ligeramente
fuera del campo. Debería ver algo como esto (Vea el inserto que representa una ampliación del
área roja observada bajo el microscopio con un 10 x objetivo)

Empiece a contar en las celdas incluyendo en el recuento los incluidos en el área del cuadrado y
los que están en las líneas fronterizas de la cámara derecha y superior. (celdas negras-puntos – en
la foto), y no las células que entran en contacto con las líneas fronterizas en izquierda y abajo
(glóbulos blancos-puntos – en la foto).

Esto se hace para evitar contar las células dos veces., una vez que cuentes el cuadrado al lado.

Repita la cuenta al menos 4 cuadrícula (tener una buena media) y, si quieres tener un recuento
más preciso, repetir también en la otra cámara del hemocitómetro.

Tome un promedio de las celdas contadas en cada cuadrado.

Limpiar el hemocitómetro enjuagando con agua después de su uso y con 70% alcohol

RESULTADOS FINALES

la concentración de las células en suspensión será, como se ha mencionado más arriba,

N x 104 células / ml

donde N es el número promedio de celdas contadas en los diferentes cuadrados.

Si ha diluido las células porque son demasiado densas, o con azul tripán para la prueba de
viabilidad, también debes multiplicar el número por el factor de dilución.

N x 104 x f

donde f es el factor de dilución

Por ejemplo: si diluyes las células 1: 2, poniendo un volumen igual de celdas (decir 10 la) y medio
(o azul tripán), entonces la fórmula será Nx 104 X 2

Si ha diluido las células 1: 3, poniendo el doble del volumen de medio (decir 20 la) en comparación
con el volumen de células (decir 10 la), entonces tendrás que multiplicar por 3 N x 104 X 3 y así.

Esta es la concentración de las células en la suspensión celular creada después de la tripsinización.,

centrifugación y resuspensión en el volumen conocido de medio

(para 25 cm2 matraz, con células epiteliales en 80% confluencia, Normalmente resuspendo en 3
ml de medio para tener una buena densidad celular para que las células se cuenten fácilmente).

número de celdas totales

Para determinar el número total de células contenidas en el recipiente de crecimiento., será

necesario multiplicar la concentración celular medida x el volumen del medio utilizado para
resuspender las células (en mi caso 3 ml).
densidad de células

Para determinar el densidad de células en el cultivo antes de la tripsinización, dividir por la

superficie del matraz (en mi caso 25 cm2). Esto calculará la densidad celular del cultivo original..

error estimado

El error estimado para contar con esta técnica es 1/√norte

donde n es el número de células contadas (ver aquí)

Ten cuidado! Hay diferentes tipos de cámaras de recuento disponibles., con diferentes tamaños de
cuadrícula. Algunas cámaras de conteo también tienen rejillas de diferentes tamaños.. Tenga
cuidado de conocer la altura y el tamaño de la cuadrícula, de lo contrario cometerá errores de
cálculo.

¿En cuánto volumen resuspender las células para colocarlas en la densidad celular deseada?? leer
aquí

Recuento celular: determinación de la concentración de células en una suspensión

Índice de técnicas

Hemocitómetro: portaobjetos especial para contar células bajo el microscopio.

También se le llama cámara de Neubauer.

En la imagen se observan también dos cubreobjetos.

Pasa el puntero sobre la imagen para ver más información.

Esquema del hemocitómetro y procedimiento a seguir:

Cada porta tiene dos cámaras de recuento.

La muestra (suspensión de células) se aplica en el borde del cubre y entrará por capilaridad al
espacio entre el porta y el cubre, llenando una de las cámaras.

La altura de dicho espacio en una cámara de Neubauer es habitualmente de 0,1 mm

Hay retículas trazadas en cada cámara de recuento que la dividen en 9 zonas cuadradas, de 1 mm
de lado cada una.

Las 4 zonas de las esquinas tienen una retícula interior más espaciada, la central una retícula más
densa.

Si se cuentan las células en los 4 cuadros de las esquinas, el volumen correspondiente es de 4 × ( 1

mm × 1 mm × 0,1 mm ) = 4 × 0,1 mm3

0,1 mm3 = 0,1 × 10−9 m3 = 0,1 × 10−9 × 103 L = 10−7 L = 10−4 mL

Entonces se puede calcular la concentración de células como

N células / (4 × 10−4 mL) = N / 4 × 104 células/mL

siendo N = nº total de células contadas en las 4 zonas

¿Cómo contar las células que tocan los bordes de un recuadro?

Para evitar ignorarlas o contarlas dos veces, en cada recuadro se cuentan las que tocan dos de los
lados, siempre los mismos, y se ignoran las que tocan los otros dos.

Por ejemplo, se cuentan las que tocan los lados izquierdo o superior:

en el cuadro 1, se contarán las verdes pero no las moradas.

Ejemplo y ejercicio

En la imagen de ejemplo, haz el recuento de células en las 4 cuadrículas de esquina dentro de la

zona marcada y calcula la concentración celular de la muestra.

Tu respuesta:

×10

cél. / mL

Esquema del hemocitómetro: imagen tomada de Cell Cultures, por Daniel Focosi (2014). Se
reproduce aquí de acuerdo a los términos de uso educativo. Molecular Medicine © Daniele Focosi
[url] 2001-2014 [Consultado 8 nov. 2016]

Fotografía del hemocitómetro con células: retocada de la imagen tomada de Flickr, por Joseph
Elsbernd (CodonAUG). Licencia Creative Commons Atribución [url] [Consultado 19 ago. 2020]
Mutaciones en procariotas

ÍNDICE:

1 INTRODUCCIÓN A LAS VARIACIONES HEREDITARIAS NO ASOCIADAS A TRANSFERENCIA DE

MATERIAL GENÉTICO

2 MUTACIONES ESPONTÁNEAS.

2.1 MUTACIONES PUNTUALES

2.1.1 BASE MOLECULAR DE LAS MUTACIONES PUNTUALES

2.1.2 CONSECUENCIAS POSIBLES DE UNA MUTACIÓN PUNTUAL

2.2 MUTACIONES DE DESPLAZAMIENTO DE LA FASE (=DEL MARCO O PAUTA) DE LECTURA

[“FRAMESHIFTS”]

2.3 GRANDES DELECCIONES (O BORRADURAS)

2.4 INVERSIONES

2.5 TRANSLOCACIONES

2.6 DUPLICACIONES EN TÁNDEM

2.7 MUTACIONES ORIGINADAS POR ELEMENTOS GENÉTICOS TRANSPONIBLES

2.8 REPASO DE CONCEPTOS ÚTILES EN EL TRABAJO CON MUTANTES BACTERIANOS

3 CARACTERIZACIÓN DE LAS MUTACIONES

4 TASA DE MUTACIÓN

5 REVERSIBILIDAD DE LAS MUTACIONES BACTERIANAS

5.1 BASES MOLECULARES DE LAS SUPRESIONES DIRECTAS INTRAGÉNICAS

5.2 BASES MOLECULARES DE LAS SUPRESIONES DIRECTAS INTERGÉNICAS

5.3 EFICACIA DE LAS MUTACIONES SUPRESORAS POR ARNt MUTANTES

6 AGENTES MUTAGÉNICOS E INDUCCIÓN DE MUTACIONES

6.1 AGENTES FÍSICOS

6.1.1 RADIACIÓN UV

6.1.2 RAYOS X Y RADIACIONES IONIZANTES

6.2 AGENTES QUÍMICOS

6.2.1 ANÁLOGOS DE BASES

6.2.2 AGENTES DESAMINANTES O HIDROXILANTES

6.2.3 AGENTES ALQUILANTES

6.2.4 SUSTANCIAS INTERCALANTES

6.2.5 AGENTES QUE BLOQUEAN TOTALMENTE EL EMPAREJAMIENTO DE BASES

7 LAS BACTERIAS COMO INDICADORAS DE SUSTANCIAS MUTAGÉNICAS Y POTENCIALMENTE

CARCINOGÉNICAS (TEST DE AMES)

8 ALGUNOS MUTANTES BACTERIANOS EMPLEADOS EN LABORATORIO

8.1 TIPOS Y EJEMPLOS DE MUTANTES EMPLEADOS EN LABORATORIO

8.1.1 MUTACIONES QUE AFECTAN A RASGOS MORFOLÓGICOS DE LAS COLONIAS

8.1.2 MUTACIONES QUE AFECTAN A REQUERIMIENTOS NUTRICIONALES

8.1.3 MUTANTES RESISTENTES A DROGAS Y A FAGOS

8.1.4 MUTANTES AFECTADOS EN EL USO DE AZÚCARES U OTRAS FUENTES DE C Y ENERGÍA

9 VARIACIONES BACTERIANAS POR CURACIÓN DE PLÁSMIDOS

INTRODUCCIÓN GENERAL A LOS SIGUIENTES TEMAS: VARIACIONES BACTERIANAS ASOCIADAS A

CAMBIOS EN EL GENOTIPO

Los diversos cambios morfológicos, estructurales y funcionales ocurridos a lo largo de la

evolución de los seres vivos tienen como base los cambios en los genotipos, que esencialmente
pueden ser de dos tipos:

bullet

mutaciones. A pesar de que el mecanismo de la herencia genética es fiel y tiende a la

conservación, esta fidelidad no es absoluta e inflexible. Las mutaciones son cambios bruscos
ocurridos en el genotipo, y que son transmitidos a las generaciones siguientes.

bullet
recombinaciones subsiguientes a intercambio genético. En la mayoría de los eucariotas, pueden
ocurrir recombinaciones entre genotipos individuales de una misma población. En los fenómenos
de sexualidad se origina una variedad casi infinita de nuevas ordenaciones o genotipos, sin
necesidad del aporte de nuevas mutaciones. Ello suministra una materia prima sobre la que puede
actuar la selección, de modo que las poblaciones pueden ir evolucionando con el paso del tiempo,
en función de presiones ambientales.

¿Qué ocurre en bacterias?

bullet

Los procariotas son organismos con tiempos cortos de generación: se reproducen rápidamente y
pueden dar origen en poco tiempo a grandes poblaciones. Por supuesto, experimentan
fenómenos de mutación, por lo que las poblaciones pueden acumular gran número de
mutaciones. Estudiaremos la mutación (y los modos posibles de su eliminación) en el presente
capítulo.

bullet

Pero la mutación no es el único tipo de variación genotípica en bacterias. Aunque los procariotas
carecen de fenómenos de sexualidad auténtica, existen variaciones genéticas asociadas a la
adquisición por una bacteria de parte del material genético de otra bacteria o de un bacteriófago.
Los posibles mecanismos de transferencia de información genética entre bacterias son:

bullet

transformación (que estudiaremos en el capítulo 17);

bullet

conjugación (ver capítulo 18);

bullet

transducción (ver capítulo 19).

Los fenómenos de recombinación genética asociados a la transferencia serán abordados en la

primera parte del capítulo 17.

1 INTRODUCCIÓN A LAS VARIACIONES HEREDITARIAS NO ASOCIADAS A TRANSFERENCIA DE

MATERIAL GENÉTICO

Definiciones básicas:

Desde un mero punto de vista fenotípico, mutación es la aparición brusca y espontánea de

una variación fenotípica de un individuo, la cual se transmite hereditariamente a la progenie.
 Pero tras el descubrimiento del ADN como material de la herencia, podemos plasmar una
definición más ajustada, desde el punto de vista genotípico: Mutación es cualquier alteración de
la secuencia de bases de un segmento de ADN correspondiente a un gen o a un locus (sea éste
transcribible o no), aun cuando esta alteración no se refleje en forma de cambio fenotípico
observable o detectable.

bullet

Alelo es cada una de las distintas versiones en que puede presentarse un gen.

bullet

alelo silvestre: “forma” (secuencia) de un gen en las bacterias aisladas de su hábitat natural
(estirpes silvestres). En la naturaleza es muy frecuente la existencia de polimorfismo:existen
diversos alelos silvestres diferentes para un mismo locus.

bullet

alelos mutantes: las distintas “formas” (secuencias) que resultan de mutaciones del alelo silvestre.

Una pareja de conceptos que también conviene incluir aquí es la diferenciación entre mutaciones
espontáneas y mutaciones inducidas:

bullet

Mutaciones espontáneas: son resultado de la actividad normal de la célula, o de sus interacciones

con su medio natural. La mayoría aparecen por errores en los procesos de replicación, reparación
o recombinación del ADN. (O sea, para abreviar, serían aquellas mutaciones no provocadas de
forma experimental).

bullet

Mutaciones inducidas: aquellas provocadas por previa alteración experimental del ADN, bien sea
directamente, o indirectamente, por agentes físicos o químicos denominados mutágenos.

2 MUTACIONES ESPONTÁNEAS.

Los principales tipos son:

1) Mutaciones puntuales: sustituciones de pares de bases. Pueden ser:

a) transiciones: suponen cambio de una pareja Pu:Py à Pu:Py;

b) transversiones: cambio de una pareja Pu:Py à Py:Pu.

2) Mutaciones por desplazamiento de la pauta (=fase o marco) de lectura [“frameshift”]. Se

deben a:

a) eliminación de uno o un corto número de nucleótidos;

b) incorporación de uno o un corto número de nucleótidos.

3) Grandes delecciones (o borraduras)

4) Inversiones

5) Traslocaciones

6) Duplicaciones en tándem

7) Mutaciones insercionales ocasionadas por elementos genéticos transponibles.

Los estudiaremos a continuación, comentando algo sobre su base molecular.

2.1 MUTACIONES PUNTUALES

Las transiciones suponen cambios de una pareja purina: pirimida a otra purina:pirimidina:

A:T ßà G:C

Las transversiones suponen el cambio de un par purina:pirimidina a una pirimida:purina (o

viceversa):

A:T ßà T:A
G:C ßà C:G

2.1.1 BASE MOLECULAR DE LAS MUTACIONES PUNTUALES

2.1.1.1 Base molecular de las transiciones

Se deben, en esencia, a la ocurrencia espontánea, durante la replicación, de formas raras

tautoméricas de las bases nitrogenadas. Los desplazamientos tautoméricos del protón cambian las
propiedades de formación de puentes de H, de tal modo que:

forma tautomérica

Se comporta como

A* (imino)

G* (enol)

C* (imino)

T* (enol)

Por lo tanto, los emparejamientos propiciados por las formas tautoméricas serían:
A* : C

C* : A

T* : G

G* : T

2.1.1.2 Base molecular de las transversiones

(Modelo de Topal & Fresco:observen en el gráfico los emparejamientos de las formas sin y anti)

El modelo predice que la frecuencia de mutaciones puntuales en un par de bases dependerá de:

bullet

constante de equilibrio (k) de tautomerización del par de bases (unos 10-4 - 10-5);

bullet

frecuencia de dNTPs en forma sin. (G sin aparece con frec. de 10-1, A , con 5·10-2).

De este modo, teóricamente deberían darse las siguientes frecuencias de mutaciones puntuales:

bullet

frec. prevista de transiciones: 10-4 - 10-5

bullet

frec. prevista de transversiones: 10-5 - 10-6 (para la G) y 5·10-6 - 5·10-7 (para la A)

Sin embargo, en la realidad, las frecuencias observadas son mucho más bajas (del orden de
10-10). Esto implica que debe de existir un sistema que corrija los emparejamientos erróneos:
como ya sabemos, las ADN polimerasas poseen una capacidad correctora de pruebas (“editing”):
cada paso de elongación es seguido inmediatamente por una comprobación del emparejamiento.
Si este emparejamiento es erróneo, la polimerasa usa su actividad exonucleasa 3'à5' para
elimininar la base mal emparejada, y a continuación vuelve a polimerizar en el mismo lugar (por su
actividad polimerasa 5'à3').
Ejemplo: Durante la replicación puede ocurrir que la citosina pase a su forma imino, que se
empareja con la adenina:

1) C à Cimino : A (la A es incorporada por la ADN polimerasa)

2) Ahora la Cimino vuelve rápidamente a su forma normal, con lo que queda…

3) C : A (este emparejamiento anómalo es detectado por la polimerasa)

4) La actividad exonucleasa 3'à5' elimina la A recién incorporada

5) Vuelve a intervenir la actividad polimerasa 5'à3', que incorpora G

6) El resultado final es el emparejamiento correcto C à G

De esta forma, la tasa real de transiciones a partir de una C es aproximadamente

equivalente al cuadrado de la correspondiente cte. (k) de tautomerización.

Parece ser que en la naturaleza existe una selección natural que propicia una frecuencia
baja, pero no nula, de errores durante la replicación. El significado biológico es que de esta forma
se combina una alta tasa de fidelidad en la replicación, pero con suficiente flexibilidad
(oportunidad de errores) como para generar innovaciones sobre las que pueda actuar la presión
selectiva, lo cual permite evolución.

Puntos calientes de mutación (“hot-spots”): son puntos o zonas dentro del genomio donde se
concentran mutaciones con una frecuencia mayor que la esperada si se distribuyeran al azar.

Ejemplo: en el gen lacI hay una zona especialmente “caliente” cerca de la base 200, donde la
probabilidad de encontrar mutaciones es muy superior a la del resto de la secuencia de ADN de
ese gen.
Explicación: algunas bases, dentro de un determinado contexto de secuencia, son modificadas
químicamente por acción de alguna enzima (normalmente una metilasa), y ello provoca una
mayor susceptibilidad a la aparición de mutaciones puntuales:

La citosina (C), dentro del contexto de secuencia siguiente:

CCAGG

GGTCC

es metilada por una metilasa específica (que reconoce precisamente a esas dos citosinas dentro de
esa secuencia), para dar 5-metilcitosina. La 5-metil citosina experimenta espontáneamente una
desaminación oxidativa, que la convierte en timina, de manera que se produce finalmente una
transición: C:G à 5-metil-C:G à T:G (emparejamiento anómalo)à T:A

2.1.2 CONSECUENCIAS POSIBLES DE UNA MUTACIÓN PUNTUAL

Si la mutación afecta a una región en 5' que actúa en cis:

bullet

Determinadas mutaciones puntuales en el promotor impiden que la ARN polimerasa se una a esta
secuencia; entonces el promotor queda inactivado y no se produce la expresión de los genes del
operón.

bullet

En otros casos los efectos son diferentes. Por ejemplo: se recordará que el promotor del operón
lac tiene una secuencia -10 atípica, que obliga a que la expresión a alto nivel requiera el concurso
de la proteína CAP activa. Pues bien, por medio de mutaciones puntuales se puede lograr que esa
secuencia atípica adquiera las características de las secuencias -10 típicas (a base de TATA, o
similar). En este caso, el efecto de estas mutaciones es que el operón lac se vuelve independiente
de la proteína CAP para su expresión eficiente: el operón se hará independiente de la represión
catabólica.

bullet

En los operones sometidos a control negativo, determinadas mutaciones en el operador provocan

una menor afinidad de la proteína reguladora (del represor). El efecto es el de crear una expresión
constitutiva (es decir, el operón se expresa incluso en presencia del represor activo, debido a que
éste no reconoce al operador mutante).

Si la mutación afecta a una zona codificadora: se produce la alteración de un codón. Las

consecuencias de la alteración pueden ser muy variadas:

1) Si la nueva tripleta (codón) codifica el mismo aa. que la antigua (debido a la sinonimia o
“degeneración” del código genético, que afecta sobre todo a la tercera base del codón) se origina
una mutación neutra, que es “silenciosa” (no hay ningún cambio en el fenotipo).

2) Si la nueva tripleta codifica un aa. diferente del original, tenemos varias posibilidades:

a) mutaciones de sentido erróneo o alterado (“missense”):

i) si el nuevo aa. es de un tipo químico similar al antiguo, puede cumplir una función semejante
en la proteína mutante, por lo que el fenotipo sería también una mutación silenciosa por
sustitución de aa.

ii) En otros casos el nuevo aa. provoca una inestabilidad estructural, que puede reflejarse en
que la proteína sea termosensible o criosensible, o más susceptible a efectores alostéricos. La
proteína termosensible es funcional a temperaturas moderadas, pero se inactiva a temperaturas
relativamente altas, a las cuales la correspondiente proteína silvestre es activa. La proteína
criosensible es funcional a temperaturas moderadas, pero se inactiva a temperaturas
relativamente bajas, a las cuales la proteína silvestre es activa. La proteína más susceptible a
efectores alostéricos es aquella que se inhibe por efectores de forma más acusada. En esta
categoría entran también las proteínas con actividad residual.

iii) Por otro lado, podemos encontrar proteínas que pierden su actividad biológica debido a que
la sustitución del aa. provoca la alteración de la estructura secundaria y terciaria de la proteína:
por ejemplo, la aparición por mutación de una prolina en mitad de una a-hélice destruye esta
estructura, y puede originar inactivación de la función.

iv) La alteración del centro activo suele provocar inactivación total o parcial. NOTA: Aquí se
plantea la siguiente pregunta: si la mutación inactiva totalmente la capacidad funcional de la
proteína, ¿cómo podemos reconocer que esa proteína alterada está presente en la célula? La
proteína se puede identificar por medio de anticuerpos (Ac) obtenidos frente a la proteína
silvestre. Si ponemos en contacto estos Ac con un extracto de las células mutantes, se producirá
una reacción antígeno-anticuerpo. Las proteínas inactivas caracterizadas de esta manera se suelen
denominar como “CRM” iniciales de “cross-reactive material” (material que da reacción cruzada
respecto de la proteína silvestre).

b) mutaciones “sin sentido” (“nonsense”), o sea, aquellas que cambian un codón original a una
de las tres tripletas que significan “señal de parada” de la traducción:UAG (codón “ámbar”), UAA
(codón “ocre”), UGA (codón “ópalo”). Obviamente, el efecto de estas mutaciones sin sentido es
producir la detención de la lectura del ARNm por parte de los ribosomas. Por lo tanto se produce
una proteína truncada, que suele ser inactiva.

Si la mutación sin sentido se produce en un gen de un operón policistrónico, y si esa

mutación cae cerca de una zona del ARNm capaz de formar estructuras secundarias en horquilla,
aparte del efecto de mutación sobre el gen afectado, se detectará un fenómeno de polaridad,
debido a que el acoplamiento transcripción-traducción provoca la no transcripción de la región
situada más allá (en sentido 3') de la zona de la horquilla. O sea, no habrá transcripción de los
genes distales del operón.

2.2 MUTACIONES DE DESPLAZAMIENTO DE LA FASE (=DEL MARCO O PAUTA) DE LECTURA

[“FRAMESHIFTS”]

Se pueden originar por pérdida o ganancia de un pequeño nº de nucleótidos (que no sea 3 o

múltiplo de 3)

Base molecular: Suelen ocurrir en zonas del ADN con secuencias repetitivas. En este tipo de
secuencias, durante la replicación o la recombinación, se pueden producir malos alineamientos
por desplazamiento de una o varias copias de la secuencia repetitiva.

Ejemplo:

GTCCGTCCGTCCGTCC

CAGGCAGGCAGGCACC

Se produce un cambio total en el sentido del mensaje genético, a partir del sitio de la mutación se
sintetiza una proteína inactiva, a menudo truncada (debido a que al cambiar la pauta de lectura,
pueden aparecer tripletas sin sentido).
Si la pérdida es de 3 nucleótidos (o múltiplo de 3), y la pequeña delección no afecta a una zona
importante de la proteína, se puede producir un producto que aún tenga actividad biológica.

2.3 GRANDES DELECCIONES (O BORRADURAS)

Suponen la eliminación de cientos e incluso miles de nucleótidos.

Base molecular: Formación de grandes bucles intracatenarios, con posterior escisión de dichos
bucles. Normalmente en los extremos del material que se va a delecionar existen secuencias de
ADN que son repeticiones directas una de otra, lo que facilita algún fenómeno de recombinación
que lleva a la eliminación del material (bucle) intercalado entre esas secuencias.

Consecuencias: Mutación irreversible e inactivadora total de uno o varios genes.

2.4 INVERSIONES

Cambio de orientación de un segmento de ADN. En muchos casos se deben a emparejamiento y

ulterir recombinación entre secuencias inversamente repetidas en los extremos del material que
sufre la inversión.

Consecuencias: En muchos casos no hay consecuencias fenotípicas, ya que simplemente se ha

invertido el orden de los genes del segmento invertido en relación al resto del genoma.[1] A
diferencia de las deleciones, las inversiones suelen revertir, precisamente por un nuevo proceso
de recombinación entre las secuencias inversamente repetidas.

2.5 TRANSLOCACIONES

Traslado de un segmento a otro lugar del genomio.

2.6 DUPLICACIONES EN TÁNDEM

Se trata de la aparición de una copia de una zona de ADN a continuación de la localización

del original. Suelen deberse al emparejamiento y recombinación entre secuencias similares en dos
moléculas de ADN (en realidad, en este evento, de las dos moléculas de ADN, una se queda con
una duplicación mientras que la otra se queda con una delección).
 Si el segmento duplicado es grande y lleva varios genes, no suele conducir a inactivación
génica (ya que aunque en la juntura de la duplicación puede haber una mezcla de dos genes
truncados, sigue habiendo copias silvestres de dichos genes en el mutante).

Una de las propiedades más características de las duplicaciones en tándem es su

inestabilidad, ya que revierten con gran frecuencia por nueva recombinación dentro del segmento
duplicado.

A pesar de esto, las duplicaciones parecen haber jugado un papel importante en la

evolución. Tras una duplicación que se haya estabilizado, hay dos copias de uno o varios genes, de
modo que una de las copias de cada pareja puede lentamente ir evolucionando e incluso adquirir
una nueva función.

2.7 MUTACIONES ORIGINADAS POR ELEMENTOS GENÉTICOS TRANSPONIBLES

La inserción de una secuencia de inserción (IS) o de un transposón (Tn) en de un gen origina

la inactivación insercional, debida a:

bullet

desplazamientos de la pauta de lectura, que como antes indicamos, generan frecuentes señales de
fin de traducción;

bullet

terminación de transcripción dependiente de Rho, con efectos polares (debido a que las IS llevan
frecuentes señales de terminación compleja de la transcripción, dependiente de r).

Una vez que ha ocurrido una inserción de una IS o de un Tn, pueden producirse ulteriores
delecciones secundarias de todo o de parte del elemento transponible, y a veces también
delecciones del material genético adyacente (fenómenos de escisión imprecisa del IS o Tn).

Por otro lado, dadas dos secuencias IS del mismo tipo, situadas a cierta distancia una de la
otra, por fenómenos de recombinación propiciados por dichas IS se pueden producir:

bullet

inversiones del material intercalado entre ambias copias del IS;

bullet
translocaciones del material intercalado entre esas secuencias de inserción.

2.8 REPASO DE CONCEPTOS ÚTILES EN EL TRABAJO CON MUTANTES BACTERIANOS

Repasemos algunos conceptos y términos que son igualmente de uso común en muchos
estudios de genética:

Dependiendo de que la mutación genética se manifieste o no a nivel fenotípico, y según el

grado de afectación fenotípica, podemos clasificar las mutaciones de la siguiente manera:

bullet

mutaciones silenciosas (o neutras), si no hay efecto fenotípico;

bullet

mutaciones que implican alteración del fenotipo silvestre:

bullet

letales: si ocasionan la muerte o pérdida de viabilidad del microorganismo;

bullet

condicionalmente letales: si bajo determinadas condiciones el mutante pierde la viabilidad, pero

bajo otras la mantiene.

bullet

mutaciones de alteración fenotípica que suponen la pérdida o la merma de alguna función que no
sea esencial para la viabilidad del organismo. Dentro de ellos están los mutantes condicionales (su
fenotipo alterado se manifiesta en determinadas circunstancias).

Las mutaciones condicionales (incluidas las condicionalmente letales) son muy útiles para
estudiar aquellos genes esenciales para la bacteria. En estos mutantes hay que distinguir dos tipos
de condiciones:

bullet

condiciones restrictivas (también llamadas no-permisivas): son aquellas condiciones ambientales

bajo las cuales el mutante pierde la viabilidad, o su fenotipo se ve alterado, debido a que el
producto afectado por la mutación pierde su actividad biológica.

bullet

condiciones permisivas: son aquellas bajo las cuales el producto del gen mutado es aún funcional.

Algunos ejemplos de mutantes condicionales muy empleados en genética:

bullet

mutantes sensibles al calor (termosensibles). Se suelen denominar con las siglas ts. El producto del
gen mutado es más sensible al calor que el producto silvestre

bullet

mutantes de biosíntesis sensible al calor;

bullet

mutantes sensibles al frío (criosensibles)

bullet

mutantes sensibles a efectores alostéricos

bullet

mutantes suprimibles por supresores extragénicos (por ejemplo, por ARNt supresores, mutantes);

bullet

mutantes dependientes de estreptomicina;

bullet

mutantes estabilizados osmóticamente (sólo son estables en altas concentraciones de sales).

En principio, y “por definición”, es imposible obtener mutantes letales estrictos de genes

esenciales para la viabilidad de la bacteria (p. ej., en genes de la ADN-polimerasa, ARN-polimerasa,
ADN-ligasa, etc.), pero sí es posible conseguir mutantes condicionalmente letales, especialmente
los termosensibles. Por ejemplo, si tras un tratamiento mutagénico sembramos células de
Escherichia coli en placas y las cultivamos a 30ºC, y luego hacemos réplicas en placas que se
incuban a 42ºC, las colonias “ausentes” en estas últimas nos señalan correspondientes colonias de
la placa matriz candidatas a mutantes termosensibles.

Otro tipo de mutantes condicionales muy empleados en bacterias son aquellos con
mutaciones sin sentido. Como se recordará, cuando el ribosoma llega al codón sin sentido, se
detiene la traducción ulterior. Sin embargo, si esa bacteria tiene simultáneamente una segunda
mutación de tipo supresor extragénico, a saber, un ARNt mutante adecuado, se puede restablecer
el fenotipo silvestre (al menos parcialmente).

3 CARACTERIZACIÓN DE LAS MUTACIONES

Para caracterizar genéticamente una mutación (es decir, para conocer qué tipo de mutación
es) se recurre normalmente a pruebas de reversión de cada mutante.
bullet

Las mutaciones puntuales pueden revertir o ser suprimidas por una 2ª mutación (ver más
adelante, en este mismo capítulo).

bullet

Igual ocurre con algunas mutaciones de desfase de la pauta de lectura.[2]

bullet

Las inserciones sólo pueden revertir por una delección exacta del material insertado.

bullet

Las delecciones no pueden revertir.

bullet

Por otro lado, las mutaciones generadas por elementos genéticos transponibles no aumentan su
frecuencia por tratamiento con agentes mutagénicos, mientras que el resto sí lo hacen.

4 TASA DE MUTACIÓN

En una población bacteriana se define la tasa de mutación (T) para un determinado

fenotipo como la probabilidad de que una célula mute a ese fenotipo en un determinado intervalo
de tiempo. Luria y Delbrück (1943) escogieron como intervalo de tiempo unitario el
correspondiente a un ciclo celular (o sea, a una generación), que es el tiempo necesario para
completar una ronda de división celular. Por lo tanto:

T = m / d, donde m es el nº de mutaciones surgidas en un tiempo t, y d es el nº de divisiones

ocurridas en ese tiempo t.

Si expresamos d en función del número de células: T= m / (N-N0)

NOTA 1: La tasa T de mutación espontánea es constante para cada división celular a distintas tasas
de crecimiento

En la expresión anterior hay que introducir un factor de corrección, ya que en el momento de

determinar el número de células (N), las bacterias se encuentran en distintas etapas del siguiente
ciclo celular, de modo que el promedio real de divisiones es mayor que N en un factor equivalente
a 1/ln 2. Resulta, entonces:
T= m·ln2 /(N-N0) = 0,69·m / (N-N0)

A pesar de lo sencillo de esta fórmula, el cálculo en la práctica de la tasa de mutación no es tan

fácil como ésta parece dar a entender. Ello se debe a que el parámetro m mide el número de
eventos de mutación en un lapso de tiempo, que no equivale al número de bacterias mutantes
medidas. Por lo tanto, y a pesar de lo fácil que suele ser cuantificar el número de mutantes, en el
experimento, en ese cantidad medida se incluyen los descendientes de eventos más o menos
antiguos de mutación a lo largo de ese experimento. Para calcular m hay que recurrir a ciertos
métodos estadísticos.

Por ejemplo, se puede combinar un experimento de tipo de Luria y Delbrück con la distribución de
Poisson. Imaginemos que sembramos 20 tubos independientes con la misma cantidad inicial de
bacterias sensibles a la estreptomicina e incubamos el mismo tiempo en las mismas condiciones,
de modo que la N-N0 sea 5.6X108; imaginemos que en esa prueba de las fluctuaciones en 11 de
los 20 tubos no han surgido mutantes resistentes al antibiótico. De acuerdo con la aproximación
de Poisson a la distribución normal, la probabilidad de tener cero (0) mutaciones en un cultivo
sería:

P0 = m0·e-m/0!

Aplicando esto a nuestro ejemplo:

P0 = 11/20 = 1·e-m/1

Y por lo tanto, podemos despejar y resolver el valor de m = -ln11/20 = 0.59. Ahora podemos
calcular la tasa de mutación:

T = 0.6·0.59/5.6X108 = 7.3·10-9

NOTA 2: Obsérvese que hemos definido la tasa de mutación respecto de un fenotipo. Esto significa
que aquellos fenotipos que dependan de varios genes tendrán tasas de mutación superiores a las
de aquellos que dependan de un solo gen. Por ejemplo, la tasa de mutación hacia auxotrofía para
la histidina o el triptófano (cuya biosíntesis depende de varios genes) está en torno a 10-7,
mientras que la tasa de mutación a resistencia a estreptomicina (que, como se recordará, depende
de la alteración del gen de la proteína ribosómica S12) es de sólo 10-10 o 10-11.
5 REVERSIBILIDAD DE LAS MUTACIONES BACTERIANAS

Las variaciones fenotípicas producidas por las mutaciones no-silenciosas son transmisibles a
la descendencia. Es decir, una vez producido el cambio, éste es permanente, pero no
necesariamente irreversible (como ya dijimos, solamente las grandes delecciones son
irreversibles).

La reversibilidad de las mutaciones suele deberse a una segunda mutación que restaura el
fenotipo original. Esta 2ª mutación puede ser de dos tipos principales, y varios subtipos:

1) Reversión (en sentido estricto), que restaura el genotipo original. Esto equivale a una
retromutación (“back-mutation”).

2) Supresión: la 2ª mutación suprime los efectos de la 1ª pero no restaura el genotipo original.

Por lo tanto, tras la mutación supresora, la célula queda con dos mutaciones. La supresión se
clasifica a su vez en:

a) Supresión indirecta: no se corrige el producto del primer gen, pero la 2ª mutación anula las
consecuencias fenotípicas. Ejemplos:

i) Se abre una nueva vía para la síntesis del producto afectado por la 1ª mutación.

ii) El producto mutado de la 2ª mutación puede sustituir al producto de la primera.

iii) Se provoca un cambio en el medio intracelular, que hace que el producto alterado de la
primera mutación vuelva a ser funcional.

b) Supresión directa: la 2ª mutación corrige el producto del primer gen mutado. Puede ser de
dos tipos principales:

i) Supresión intragénica: la 2ª mutación ocurre en el mismo gen donde ocurrió la primera.

ii) Supresión intergénica (= extragénica): la mutación supresora afecta a otro gen, que suele ser
uno de los genes implicados en la maquinaria de traducción del ARNm: ARNt y proteínas
ribosómicas.

5.1 BASES MOLECULARES DE LAS SUPRESIONES DIRECTAS INTRAGÉNICAS

1. Introducción de un desfase de signo opuesto al de la primera mutación à restauración de la

pauta de lectura alterada por una previa mutación de desfase de lectura (“frameshift”). La única
zona alterada tras la mutación supresora sería la que queda entre ella y la 1ª mutación. Si esta
zona es corta y no es esencial para la actividad biológica, se puede restablecer el fenotipo
primitivo.

2. Supresiones en el mismo codón que quedó afectado por la 1ª mutación, de modo que se
codifica un aminoácido distinto del silvestre y distinto del aa. del primer mutante, pero que
restaura la funcionalidad de la proteína. A este tipo de supresión se la denomina también
pseudorreversión.

3. Mutación puntual compensatoria en un sitio distante respecto de la primera mutación: la 2ª

mutación compensa a la 1ª, de modo que se restaura la estructura tridimensional y/o el centro
activo de la proteína.

5.2 BASES MOLECULARES DE LAS SUPRESIONES DIRECTAS INTERGÉNICAS

1) Por ARNt mutantes (= ARNt supresores)

a) supresores de mutaciones que introducen codones de parada de lectura (o sea, de codones

“sin sentido, nonsense”): son ARNt mutados en el anticodón, de modo que este anticodón mutado
puede emparejarse con alguno de los tres tipos de codones “sin sentido”, insertando ahora los aa.
correspondientes que transportan; por lo tanto, impiden la terminación prematura de la
traducción. Ejemplos: El codón sin sentido UAG (“ámbar”) puede ser suprimido por versiones
mutantes (supresoras) de los siguientes ARNt:

Tipo de ARNt supresor

Normalmente reconoce
ARNtSer

UCG

ARNtGln

CAG

ARNtTyr

UC

ARNtLys

AAG

(La letra sombreada indica la base que cambia en la mutación supresora).

b) El codón sin sentido UAA (“ocre”) puede ser suprimido por una versión mutante de ARNtGly
à GAA

c) Existen supresores más raros que suprimen mutaciones de sentido erróneo (“missense”):
Ejemplo: El ARNtGly cuyo anticodón es UCC, por mutación se convierte en un ARNt supresor cuyo
anticodón es UCU, que entonces reconoce al codón AGA (de la Arg). Por lo tanto, este supresor
inserta Gly frente a cada codón AGA.

d) supresores de desfases de lectura de +1 nucleótido: son ARNt mutantes que tienen un

anticodón con 4 nucleótidos, en lugar de los 3 habituales.Ejemplo: Existe un ARNtPhe que tiene un
anticodón que reconoce la secuencia UUUC.
2) Por proteínas ribosómicas mutantes: Los ribosomas derivados de la alteración por mutación
de determinadas proteínas adquieren zonas de conformación cambiada, de modo que reconocen
tripletas de forma errónea. Al introducir aminoácidos cambiados en codones que a su vez
proceden de mutaciones, pueden restaurar la funcionalidad de algunas proteínas
mutantes.Ejemplos:

a) mutaciones ram, que afectan a las proteínas S4 y S5 de la subunidad 30S del ribosoma, de
modo que éste puede suprimir una gran variedad de mutaciones sin sentido y por desfases. (El
nombre de ram corresponde a las iniciales de ribosomas ambiguos).

b) Mutaciones StrR: tienen afectada la proteína S12 del ribosoma. Hacen que las mutaciones sin
sentido sean menos defectuosas (“leaky” = débiles).

5.3 EFICACIA DE LAS MUTACIONES SUPRESORAS POR ARNt MUTANTES

Cada supresor tiene una eficacia característica de supresión, que se refleja en la proporción
de cadenas polipeptídicas mutantes que son terminadas de forma normal (en lugar de quedarse
truncadas). Esta eficacia depende, esencialmente de:

bullet

la concentración del ARNt supresor en la célula;

bullet

afinidad del ARNt supresor hacia la aminoacil-ARNt-sintetasa;

bullet

afinidad del aa-ARNt por el ribosoma, en competencia con los factores de terminación de
traducción que reconocen el mismo codón “sin sentido” (de parada de lectura).

La mutación supresora, por sí misma disminuye la velocidad de crecimiento de la bacteria,

debido a que, aparte de su capacidad supresora, introduce errores de lectura en los ARNm
normales.

Los supresores han de ser, por fuerza, poco eficientes, como para no hacer que la célula
muera por introducción de demasiados errores en la lectura de los ARNm normales (es decir, la
mayor parte de las veces, los supresores introducen el aminoácido correcto). Pero por otro lado,
han de ser suficientemente eficicientes como para poder introducir aminoácidos en codones
mutantes con la frecuencia adecuada para suprimir la mutación primaria. Normalmente, los
supresores típicos suprimen 5-10% de las veces. Es decir, la mayoría de las veces se introduce el
aa. correcto frente al codón correcto.

6 AGENTES MUTAGÉNICOS E INDUCCIÓN DE MUTACIONES

Anteriormente comentamos que el medio ambiente no induce mutaciones concretas (p. ej.,
el antibiótico no provoca la aparición de los mutantes resistentes). Ahora bien, lo que sí pueden
hacer determinadas condiciones ambientales es elevar la tasa global de aparición de mutaciones.

Determinados agentes ambientales físicos o químicos pueden dañar el ADN o interferir con
la maquinaria replicativa, de modo que provocan una mayor frecuencia de aparición de
mutaciones (y en este sentido hablamos de “mutaciones inducidas”). A dichos agentes se les llama
mutágenos o agentes mutagénicos. Así pues, en última instancia, los mutágenos causan alguna
alteración en el ADN que

bullet

bien no puede ser reparada convenientemente,

bullet

o bien es un daño tan extenso que sobrepasa la capacidad de los mecanismos celulares normales
de reparación (consultar en el tema 13 el apartado sobre “Mecanismos de Reparación de los
daños al ADN”).

6.1 AGENTES FÍSICOS

6.1.1 RADIACIÓN UV

Es el mutágeno físico más empleado en el laboratorio para obtener mutaciones en las

bacterias. Como ya estudiamos en su momento, su efecto principal es originar dímeros de
pirimidina intracatenarios (con creación de una anillo ciclobutano entre dos Py consecutivas). Las
proporciones de lesiones son las siguientes:

bullet

50% T-T

bullet

40% T-C

bullet

10% C-C
 Las mutaciones aparecen principalmente como consecuencia del mecanismo posreplicativo
de reparación propenso a error (o sea, el sistema SOS). Con menor frecuencia la luz UV ocasiona
hidratación de la C, lo que da origen a transiciones.

6.1.2 RAYOS X Y RADIACIONES IONIZANTES

Tienen mayor poder de penetración que los rayos UV, pero son de difícil manejo, por lo que
se emplean poco en bacterias. Los rayos X ocasionan daños reparables por el sistema SOS.

Las radiaciones ionizantes (p. ej., rayos g) provocan labilizaciones en el ADN, que terminan
en roturas en las hebras del ADN (por ataque al enlace fosfodiéster), que finalmente pueden
conducir a delecciones.

6.2 AGENTES QUÍMICOS

Se pueden agrupar en varias categorías:

1) Análogos de bases, que se incorporan durante la replicación del ADN.

2) Agentes hidroxilantes o desaminantes de las bases nitrogenadas.

3) Agentes alquilantes.

4) Agentes intercalantes, que se introducen en la doble hélice del ADN, entre pares de bases
consecutivas.

5) Bloqueadores del emparejamiento de las bases.

6.2.1 ANÁLOGOS DE BASES

Son sustancias con una estructura en anillo similar a las bases naturales de los ácidos
nucleicos, pero con propiedades químicas diferentes. Como ejemplos tenemos:

bullet
5-bromouracilo (5-BrU)

bullet

2-aminopurina (2AP).

Estas moléculas entran a las células y son convertidas a los correspondientes “dNTP”, de
modo que su estructura les permite ser incorporados durante la replicación del ADN.

1) El 5-BrU es análogo de la T. Propicia transiciones T:A àG:C debido a que experimenta frecuentes
cambios tautoméricos desde su forma ceto a su forma enol:

BUceto:AàBUenol:G

Si partimos de una pareja A=T y en la 1ª ronda de replicación la ADN-polimerasa introducen un

BUceto frente a la adenina, los acontecimientos hasta llegar a la mutación se pueden resumir así:

A:T à (la primera replicación incorpora BU) àA:BUceto à(tautomerización y 2ª replicación) à

G:BUenol à (3ª replicación) à G:C

2) La 2-AP es un análogo de la A. Provoca transiciones A:Tà C:G debido a sus frecuentes

tautomerizaciones (APamino à APimino). Veamos el proceso:

A:T à (primera replicación) à APamino:T à (tautemerización y 2ª replicación) à APimino:C à (3ª

replicación) à G:C

6.2.2 AGENTES DESAMINANTES O HIDROXILANTES

Alteran las Pu o las Py, de modo que:

bullet

causan errores en el emparejamiento, o bien

bullet

labilizan las bases, de modo que éstas espontáneamente se modifican químicamente con gran
frecuencia.
1) Ácido nitroso: provoca una desaminación oxidativa de A y C, lo que origina transiciones

bullet

sobre C à dU, que se empareja con la A.

bullet

sobre A (6-aminopurina) à hipoxantina (HX) (6-oxopurina), que en su forma ceto se empareja con
la citosina: A:T à HXceto:C à G:C

El nitroso también desamina oxidativamente a la G, pero en este caso no hay mutación: G à

xantina, que al igual que la G, se empareja con la C.

2) Hidroxilamina (NH2OH): actúa específicamente sobre la citosina, añadiéndole un hidroxilo a su

grupo -NH2.

6.2.3 AGENTES ALQUILANTES

Introducen radicales alquílicos en una cadena (los alquilantes monofuncionales) o en las dos
cadenas (los bifuncionales) del ADN, produciendo efectos letales y mutagénicos.

bullet

Los efectos letales fueron estudiados en el capítulo 19 (“Acción de los agentes químicos”).

bullet

Los efectos mutagénicos dependen sobre todo de la reacción con el O6 de la G.

Algunos agentes alquilantes empleados en laboratorio:

bullet

gas mostaza: mostazas nitrogenadas y sulfuradas, como por ejemplo:

bullet

Cl-CH2-CH2-S-CH2-CH2-Cl : di-(2-cloroetil)-sulfuro.

bullet
etil-etano-sulfonato (EES): CH3-CH2-SO2-O-CH2-CH3

bullet

etil-metano-sulfonato (EMS): CH3-SO2-O-CH2-CH3

bullet

nitrosoguanidina (NTG), que es la N-metil, N'-nitro, N-nitrosoguanidina.

Todos estos agentes, excepto la NTG, actúan tanto in vivo como in vitro. La NTG sólo actúa in
vivo, ya que su efecto lo ejerce sobre la horquilla de replicación del ADN. La NTG es uno de los
mutágenos más potentes que se conocen, pero es un agente “sucio”, en el sentido de que genera
varias mutaciones en la misma célula. Induce reparación SOS propensa a error, dando origen a
transiciones, transversiones y desfases del marco original del lectura.

Como hemos dicho, estos agentes originan un daño premutagénico principal consistente en
alquilación del O6 de la G. Ello provoca una gran distorsión en la doble hélice, que posteriormente
se plasma en transiciones del tipo G:C à A:T.

Sin embargo, muchas bacterias poseen un sistema específico para reparar las lesiones de la
O6-alquil-guanina, que funciona de la siguiente manera:

1) La bacteria posee una O6-alquil-glucosilasa, que rompe el enlace N-glucosídico entre la O6-
alquil-guanina y la desoxirribosa. Esto provoca la creación de un sitio apurínico (sitio AP).

2) El sitio AP es reconocido por una endonucleasa correctora (apurinasa), que rompe el enlace
fosfodiéster del lado 5' del sitio apurínico.

3) Se produce una reparación por escisión-resíntesis de un pequeño nº de nucleótidos, pero si

el daño es muy grande se produce una situación SOS que tiende a ser reparada por el sistema
propenso a error ya estudiado, lo que provoca introducción de errores, que conducen a
transiciones y transversiones.

6.2.4 SUSTANCIAS INTERCALANTES

Se introducen entre los pares de bases del ADN, dando origen a pérdida o ganancia de
nucleótidos (o sea, generan mutaciones de cambio de la pauta de lectura del mensaje genético).
Estas sustancias son moléculas planares con 3 o 4 anillos conjugados, que presentan un cierto
parecido con los pares de bases del ADN, pero no se pueden incorporar covalentemente al
esqueleto de éste, sino que se intercalan entre dos pares de bases consecutivas, con lo que
provocan distorsiones de la doble hélice.

Algunos ejemplos:

bullet

derivados de la acridina, como el naranja de acridina

bullet

bromuro de etidio (ver nota[3])

bullet

derivados de la flavina (como la proflavina).

Estabilizan emparejamientos erróneos durante la replicación y la recombinación del ADN,

dando origen a desplazamientos de la pauta de lectura.

Aplicaciones: Algunos se están ensayando en cuanto a su capacidad de inhibir tumores

cancerígenos, o como antivirásicos, o contra el protozoo causante de la malaria.

6.2.5 AGENTES QUE BLOQUEAN TOTALMENTE EL EMPAREJAMIENTO DE BASES

Este grupo incluye potentes carcinógenos como:

bullet

benzo-a-pireno

bullet

aflatoxina-B1

Modifican purinas, provocando grandes lesiones en el ADN, que inducen el sistema SOS de
reparación, lo que finalmente implica reparación propensa a error. Las aflatoxinas son unas
micotoxinas (producidas por hongos, como Aspergillus).

7 LAS BACTERIAS COMO INDICADORAS DE SUSTANCIAS MUTAGÉNICAS Y POTENCIALMENTE

CARCINOGÉNICAS
 Uno de los más claros indicios de que el cáncer surge a menudo como consecuencia de
fenómenos mutagénicos es que la mayoría de los carcinógenos son también mutágenos.

Ames y sus colaboradores desarrollaron, a finales de los años 70, una prueba rápida,
sencilla y económica por la que se pueden ensayar compuestos como posibles carcinógenos. Su
base consiste precisamente en ver si son mutágenos frente a bacterias (es decir, se comprueba si
tras el tratamiento de un cultivo bacteriano con la sustancia en cuestión, aumenta la tasa de
aparición de mutantes.

TEST DE AMES

Usa una serie de cepas his- de Salmonella typhimurium, muy bien caracterizadas a nivel
genético-molecular.

1) Una suspensión de la bacteria se siembra masivamente (unas 108) en placas Petri que llevan
un medio mímino (MM) -por lo tanto, sin aminoácidos- .

2) A continuación, en el centro de la placa se coloca un pequeño disco de papel de filtro

impregnado con la sustancia que se desea ensayar. Acto seguido, las placas se incuban en estufa a
la temperatura óptima de crecimiento de la bacteria (37oC).

3) Las placas se sacan de la estufa (a las 24 h., por ejemplo) y se cuentan las colonias surgidas en
cada placa, comparándolas con las colonias de una placa control que no llevaba la sustancia. Las
colonias habrán surgido por el crecimiento de bacterias que hayan experimentado reversiones
(=retromutaciones). Cada reversión en el alelo original his-- restituye el fenotipo silvestre His+, y
por lo tanto capacita a la bacteria a crecer y dividirse en el medio mínimo.

Si la prueba da resultado positivo (o sea, la sustancia induce altas tasas de mutación sobre
la bacteria), es muy probable que el compuesto ensayado sea también carcinógeno, por lo que
habrá que continuar estudiándolo a estos niveles. (El 90% de los compuestos que dan positivo en
el Test de Ames se ha demostrado que son carcinógenos).

Ulteriores mejoras en el test de Ames

 En los últimos años esta prueba ha sido modificada para mejorarla o adaptarla a situaciones
especiales. Veamos algunas de estas modificaciones:

bullet

uso de cepas de Salmonella defectivas en reparación (uvrA--, uvrB--, uvrC--, etc). En estas cepas,
cualquier daño al ADN no puede ser corregido con total eficiencia. Esto hace que estas cepas sean
más sensibles frente a sustancias con menor potencial carcinogénico.

bullet

Muchos agentes son mutágenos en humanos sólo tras su “activación” metabólica por el hígado,
pero son inactivas por sí mismas. Para detectar a estas sustancias, el test de Ames puede
modificarse incorporando un extracto microsomal estéril (fracción libre de células de hígado
animal o de cultivos de tejidos). El extracto microsomal posee oxigenasas que originan epóxidos a
partir de la sustancia a ensayar, y a su vez son estos derivados de tipo epóxido los que verifican la
acción mutagénica.

bullet

Algunas sustancias a ensayar no entran eficientemente a la bacteria debido al efecto de barrera de

la membrana externa de la pared celular. Para solventar esto, se recurre a emplear mutantes LPS--
de Salmonella (o sea, mutantes alterados en el lipopolisacárido, LPS), que facilitan la entrada de
moléculas hidrofóbicas.

8 ALGUNOS MUTANTES BACTERIANOS EMPLEADOS EN LABORATORIO

8.1 TIPOS Y EJEMPLOS DE MUTANTES EMPLEADOS EN LABORATORIO

8.1.1 MUTACIONES QUE AFECTAN A RASGOS MORFOLÓGICOS DE LAS COLONIAS:

Los rasgos culturales de las bacterias son muy fáciles de ver en los cultivos en placas de
Petri, por lo que igualmente es fácil detectar cambios en los aspectos de las colonias que pudieran
deberse a mutaciones. Antes de nada, vamos a describir brevemente tres tipos de colonias que
pueden darse en una misma especie:

bullet

colonias S (lisas): son circulares, de borde liso o continuo; convexas obtusas (plano-convexas);
superficie lisa y brillante; se dispersan fácilmente en agua, dando suspensiones homogéneas.

bullet
colonias M (mucosas): son parecidas a las S, pero son convexas más agudas; textura mucosa (al
cogerlas con asa de siembra, se arrastra un “moco”).

bullet

colonias R (rugosas): a menudo presentan un borde ondulado o festoneado; son planas; textura
rugosa, y aspecto mate (no brillante); no se dispersan bien en agua, dando grumos más o menos
gruesos.

Pues bien, en muchas especies bacterianas se pueden estudiar fenómenos de disociación

de tipos de colonias en cultivos, debido a mutaciones que alteran moléculas de las envueltas (p.
ej., de la membrana externa de las bacterias Gram-negativas, de la cápsula, etc.). Veamos algunos
ejemplos:

bullet

En algunas bacterias se puede observar una disociación M à S, que se suele deber a la pérdida de
la capacidad de sintetizar cápsula.

bullet

En algunas bacterias Gram-positivas la disociación S à R se debe a pérdida de la cápsula.

bullet

En bacterias Gram-negativas, las disociación S à R se debe a menudo a la pérdida de la capacidad

de sintetizar las cadenas laterales polisacarídicas del LPS (antígeno somático “O”).

Muchas de estas disociaciones tienen bastante interés clínico, ya que en bacterias

patógenas, el fenotipo mutado (sobre todo el rugoso) implica la pérdida de propiedades de
virulencia y de especificidad antigénica.

8.1.2 MUTACIONES QUE AFECTAN A REQUERIMIENTOS NUTRICIONALES

En estudios de genética bacteriana (p. ej., a la hora de elaborar mapas genéticos), es muy
habitual recurrir al empleo de mutantes auxotróficos (es decir, mutantes afectados en algún gen
de alguna ruta biosintética -de aminoácidos, bases nitrogenadas, vitaminas-). Por supuesto, estos
mutantes presentan interés por sí mismos, ya que su estudio permite “diseccionar” la base
genética de las vías metabólicas.

Veamos a continuación un par de maneras de aislar y seleccionar mutantantes bacterianos

auxotrofos:
1) Aislamiento de auxotrofos (sin enriquecimiento):

cultivo original à tratar con mutágeno à lavarà siembra placas de medio mínimo (MM)+
suplementos nutricionales à réplica a MM

Se comparan las colonias de la placa-matriz (medio con suplementos nutricionales) con las
colonias que hayan aparecido en la placa de réplica (carente de suplementos). La ausencia de
colonia en la placa de réplica en una posición en la que existe colonia en la placa-matriz incica que
la colonia de la placa matriz que no tiene “gemela” en la réplica es un mutante auxotrófico.

Una vez que sabemos que una colonia es un mutante auxotrófico, hay que determinar qué
requerimiento nutricional le hace falta (es decir, qué compuesto o compuestos no puede sintetizar
debido a la mutación). Para ello se realiza una sencilla prueba en placas de Petri, denominada
auxonograma.

Sin embargo, aun cuando tratemos a un cultivo con un agente mutagénico, la frecuencia de
aparición de un determinado fenotipo mutante es relativamente baja. Esto significa que en el
experimento anterior, tendríamos que sembrar y replicar numerosas placas con grandes números
de colonias, con objeto de alcanzar el umbral de probabilidad para detectar mutaciones
auxotróficas. Para solventar este inconveniente, se suele recurrir a una modificación del método
anterior basada en enriquecer en mutantes auxotrofos el cultivo tratado con el mutágeno:

2) Enriquecimiento por penicilina para el aislamiento de mutantes auxotróficos (resumen de un

protocolo):

cultivo original (bacteria silvestre, prototrofa)

tratamiento con el mutágeno

ß
mezcla de bacterias muertas (p. ej., el 90% del cultivo inicial) + bacterias vivas, entre ellas unos
pocos mutantes de diversos tipos

el cultivo se transfiere a un medio líquido rico, para permitir la recuperación y la expresión

fenotípica (lag fenotípico)

incubar unas cuantas horas

el cultivo se lava y se pasa a un medio líquido mínimo

añadir penicilina e incubar

la penicilina mata a los prototrofos, pero los auxotrofos no mueren, porque no crecen en MM
(muerte selectiva de los parentales prototrofos)

plaquear en medio sólido rico

ß

hacer réplica a medio sólido mímino

identificar los auxotrofos (no crecen en MM)

recuperar los auxotrofos de las placas de medio rico, y caracterizarlos (hacer auxonograma)

8.1.3 MUTANTES RESISTENTES A DROGAS Y A FAGOS

Los mutantes resistentes a antibióticos surgen por varios tipos de mecanismos, entre los
que se encuentran:

bullet

alteración de algún gen que codifica una diana (sitio de unión) del antibiótico;

bullet

alteración de algún gen responsable de permeabilidad al antibiótico.

Los mutantes resistentes a fagos surgen esencialmente por alteración de receptores de la

superficie celular, sobre los que se adsorben los fagos.

Ambos tipos de mutantes son de muy amplio uso para “marcar” cepas bacterianas en
experimentos de genética (especialmente los que implican algún proceso de transferencia de
material genético desde una estirpe donadora a otra receptora). Estos marcadores genéticos
permiten seleccionar directamente la cepa que los porte añadiendo al medio de cultivo el
correspondiente agente selectivo (antibiótico o fago), que obviamente mata o inhibe el
crecimiento de las cepas sensibles.

8.1.4 MUTANTES AFECTADOS EN EL USO DE AZÚCARES U OTRAS FUENTES DE C Y ENERGÍA

 Estos mutantes pierden la capacidad de metabolizar determinados sustratos, pero pueden
recurrir a otros alternativos. Para aislar estos mutantes se puede recurrir en muchos casos al uso
de medios diferenciales que incorporan indicadores de pH, que cambian de color en función del
uso o no del sustrato en cuestión.

Por ejemplo: si quisiéramos aislar mutantes Lac-- de E. coli, sembraríamos en Agar Mac Conckey.
Los mutantes Lac-- dan colonias transparentes, mientras que el fenotipo silvestre Lac+ da colonias
rojas opacas con un precipitado alrededor de sales biliares (recordar el uso de este medio en las
prácticas).

9 VARIACIONES BACTERIANAS POR CURACIÓN DE PLÁSMIDOS

Como ya sabemos, los plásmidos son material genético extracromosómico que se replican
independientemente del cromosoma (replicones autónomos), y que no son indispensables para la
viabilidad de la bacteria que los posee. Hay plásmidos crípticos que no dan ningún fenotipo
detectable (función desconocida), pero existen muchos plásmidos que codifican funciones como
resistencia a antibióticos o a metales pesados, virulencia a plantas o animales, capacidad de fijar
nitrógeno atmosférico, etc.

Como es lógico, el material genético plasmídico es susceptible de experimentar mutaciones.

Pero la posesión de plásmidos por muchas bacterias puede condicionar otro tipo de variaciones
genotípicas heredables: la curación, consistente en la pérdida del plásmido, lo que acarrea
obviamente la pérdida concomitante de las funciones y fenotipos codificado por aquel, sin que se
afecte la viabilidad de la bacteria.

Métodos de curación de plásmidos:

bullet

Sometimiento del cultivo bacteriano a altas temperaturas (cercanas a la temperatura máxima);

bullet

Tratamiento del cultivo con agentes químicos que se intercalan en el ADN, interfiriendo con la
replicación, estabilidad o reparto del plásmido a las células hijas (bromuro de etido, naranja de
acridina, etc.).

NOTAS
[1] Escherichia coli tiene un segmento de ADN invertido respecto de su pariente evolutivo
Salmonella typhimurium

[2] Algunas bacterias patógenas han sacado provecho adaptativo de su facilidad para revertir
mutaciones de desfase de lectura. Por ejemplo, el agente de la tosferina (Bordetella pertussis)
posee genes para algunos componentes de su envuelta cuya secuencia tiene abundantes
secuencias repetidas. Ello hace que se den frecuentes mutaciones de desfase y reversiones o
nuevas mutaciones. De esta forma, va esquivando la acción defensiva del sistema inmune del
huésped.

[3].- El bromuro de etidio (BrEt) se emplea rutinariamente para teñir los geles de electroforesis
de ADN y ARN. Los geles se tratan durante unos minutos con 1mg de BrEt, y luego se iluminan con
luz UV. El ADN se visualiza porque el BrEt intercalado en él produce una fluorescencia de color
anaranjado-rojizo.

[ Introducción e Historia ] [ Rasgos generales procariotas ] [ Tamaño y forma ] [ Estructuras

superficiales ] [ Paredes procariotas ] [ Síntesis peptidoglucano ] [ Membrana y transporte ]
[ Citoplasma y su contenido ] [ Apéndices filamentosos procariotas ] [ Diferenciaciones celulares ] [
Captación de energía ] [ Nutrición microbiana ] [ Ciclo celular y crecimiento ] [ Agentes físicos ]
[ Agentes químicos ] [ Regulación génica ] [ Mutaciones en procariotas ] [ Recombinación.
Transformación ] [ Conjugación ] [ Transducción ]

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Principal

A veces la PCR se usa para identificar determinados cambios en un gen o cromosoma que ayudan
a detectar y diagnosticar una afección genética o una enfermedad, como el cáncer. También se
usa para identificar trozos de ADN de determinadas bacterias, virus o microorganismos para
diagnosticar una infección. También se llama RCP y reacción en cadena de la polimerasa.

Durante una prueba de PCR, una pequeña cantidad de material genético de una muestra se copia
varias veces. El proceso de copia se conoce como amplificación. Si en la muestra hay patógenos, la
amplificación hace que sean mucho más fáciles de ver.

Nombres alternativos: reacción en cadena de la polimerasa (RCP), rtPCR, PCR de transcripción

inversa, qPCR, PCR cuantitativa, PCR en tiempo real
Las pruebas de PCR se usan para:

• Diagnosticar ciertas enfermedades infecciosas

• Identificar un cambio genético que puede causar una enfermedad

• Encontrar cantidades pequeñas de células cancerosas que podrían pasar desapercibidas en

otros tipos de pruebas

Desarrollo de Las pruebas de PCR se hacen al:

• Tomar una muestra de sangre, saliva, moco o tejido

• La muestra tiene su propio ADN y posiblemente el ADN de un patógeno o de una célula

cancerosa

• La muestra se introduce en una máquina especial. Se añade una enzima llamada

polimerasa a la muestra. Esto hace que la muestra produzca copias

• El proceso de copia se repite varias veces. Después de una hora, se hacen miles de
millones de copias. Si hay un virus o un agente patógeno, eso se indica en la máquina

• Algunos virus, como el que causa COVID-19, están formados por ARN en lugar de ADN. En
estos virus, el ARN se debe transformar en ADN antes de copiarse. Este proceso se conoce como
PCR de transcripción inversa (rtPCR).

• Las pruebas de PCR y de rtPCR detectan la presencia de un patógeno. Otro tipo de prueba
de PCR conocida como PCR cuantitativa (qPCR) mide la cantidad de patógenos en la muestra. La
qPCR se puede hacer al mismo tiempo que la PCR o la rtPCR.

Diluciones seriadas a 1/10

Diluciones 1/10, significan que, si la cantidad de (ml) de volumen total de un tubo es de 10 ml = 9

ml agua destilada + 1 ml solución madre; mientras que, el factor de dilución es de 10, permitiendo
que la serie de diluciones sea de: 1/10, 1/100, 1/1000, 1/10000, etc.

Del mismo modo, la cantidad total de cada tubo dependerá del volumen que se necesite, siempre
que se mantenga la relación 1/10 en cada tubo respecto al anterior.

La dilución en serie es la técnica más sencilla para obtener concentraciones manejables de un

microorganismo deseado y se complementa con el rayado y la propagación de la placa de Petri,
sólo dos de las muchas técnicas de chapado utilizadas por los microbiólogos. Este beneficio de este
enfoque es que el experimentador puede cosechar cepas puras de una sola especie o cepas
separadas de una población mixta.
Diluciones seriadas a 1/2

Diluciones de 1/2 significan que, si en un tubo hay 2 ml de volumen total, 1 ml es de solución

madre y 1 ml es de agua destilada. Por lo tanto, en cada tubo hay la mitad de concentración que
en el anterior. Por eso el factor de dilución es 2.

De igual forma que la dilución de 1/10, el factor permite que se continúen secuencias, pero en
este caso como el factor es 2, la secuencia va de la siguiente forma: 1/2, 1/4, 1/8, etc.

En conclusión, la muestra (suero, plasma, reactivo, etc.) puede ser diluida con los dos tipos de
diluciones. Pero, hay que considerar si la muestra que se busca diluir va a tener un solo valor
exacto se puede realizar una dilución simple. O sino, se puede ahondar más realizando una
dilución seriada para obtener un resultados específico.