CARRERA DE INGENIERIA AGROINDUSTRIAL

BIOINGENIERIA Y BIOTECNOLOGIA AGROINDUSTRIAL

LABORATORIO 1. DETERMINACION DE BIOMASA: RECUENTOMICROSCÓPICO

DE LEVADURAS EN CÁMARA DE NEUBAUER.

I. OBJETIVOS

• Comprender el uso y lectura por cámara de Neubauer.

• Determinar la concentración de levadura utilizando la cámara de Neubauer en
el microscopio.
• Comparar los métodos de cálculo para el recuento microscópico.

II. FUNDAMENTO TEÓRICO

Una suspensión celular se caracteriza por presentar un número de partículas

microscópicas dispersas en un fluido. Habitualmente será necesario determinar
tanto la densidad de las células en la suspensión como el porcentaje de éstas que son
viables.
Tanto en la producción de cerveza como en cualquier otro producto, la calidad de los
insumos es de suma importancia. Aunque la levadura representa mucho menos de un
1% de la totalidad de los insumos, es la que hace el trabajo duro por mayor trabajo y
es una de las principales responsables del sabor y aroma final de la cerveza. De aquí
viene la importancia de estandarizar la calidad y cantidad correcta de levadura para
cada fermentación, se debe realizar el recuento de levaduras, paso fundamental para
asegurar una cerveza de calidad y estable en el tiempo.
Para determinar la densidad de las células se emplean diferentes técnicas, desde la
relativamente simple cámara de contaje celular de la que existen numerosas
variantes, entre ellas la que empleamos (cámara de Neubauer), hasta equipos
automáticos de contaje celular como el "Cell Coulter" de la empresa Beckman-
Coulter.

III. MARCO TEORICO

A. CÁMARA DE NEUBAUER

La cámara de Neubauer es una cámara de contaje adaptada al microscopio de campo

claro o al de contraste de fases. Se trata de un portaobjetos con una depresión en el
centro, en el fondo de la cual se ha marcado con la ayuda de un diamante una
cuadrícula como la que se ve en la imagen. Es un cuadrado de 3 x 3 mm, con una
separación entre dos líneas consecutivas de 0.25 mm. Así pues, el área sombreada
y marcada L corresponde a 1 milímetro cuadrado. La depresión central del
cubreobjetos está hundida 0.1 mm respecto a la superficie, de forma que cuando se
cubre con un cubreobjetos éste dista de la superficie marcada 0.1 milímetro, y el
volumen comprendido entre la superficie L y el cubreobjetos es de 0.1 milímetro
cúbico, es decir 0.1 microlitro.

Para contar las células de un cultivo líquido, se agrega una gota de este entre estas
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dos placas y observar al microscopio óptico la cantidad de células presentes en un

campo determinado de las grilla.

Figura 1. Cámara de Neubauer.

Figura 2. Manipulación de la cámara de Neubauer.

B. CONTEO EN CAMARA DE NUEBAUER

Para utilizar la cámara de Neubauer realice el siguiente procedimiento:

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• Limpie la cámara y la laminilla de cuarzo suavemente con alcohol.

• Revise la laminilla de cuarzo que no debe estar desbordada o quebrada.
• Coloque la laminilla de cuarzo sobre la cámara en forma vertical, esta debe quedar
centrada.
• Proceda a llenar la cámara. Este paso es muy importante y definitivo en la distribución
de las células. Es recomendable llenarla con micropipeta pequeña o con una jeringa ya
que la cámara se llena con una gota. El llenado debe ser continuo en un solo intento.
• La cámara no puede quedar seca esto se detecta porque en las esquinas del recuadro de
llenado se ven porciones secas. Tampoco se debe inundar, la apariencia en la cámara
esde líquido abundante en las terminaciones del recuadro.

Para el conteo: Lleve la cámara al microscopio y enfoque el cuadro de conteo con el

ocular de 4X. Al hacerlo observará en el campo una imagen parecida a la Figura 3.

Figura 3. Cámara de Neubauer en 4X.

• Si las células que va a contar son pequeñas como son las levaduras, bacterias, etc.,
ubicarse en la cuadricula central y pasar al ocular de 10X. Se visualizará de la siguiente
manera:

Figura 4. Cámara de Neubauer en 10X.

• En esta cuadricula se visualizan 25 cuadros, de los cuales se cuentan las células

presentes en 5 campos, generalmente se cuentan los cuadros de las esquinas y el
central, lo que garantiza un conteo aleatorio.

Figura 5. Cuadrados recomendados para conteo (cuadricula central).

• Para realizar el conteo se pasa al ocular de 40X, donde se visualiza cada uno de los

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campos y con ayuda del carro del microscopio se desplaza la cuadricula hasta contar
en todos los cuadros. El conteo en estos campos de la cámara se conoce como AP (alto
poder). Con el lente de 40X cada cuadro se ve de la siguiente manera:

Figura 6. Cámara de Neubauer en 40X.

• Las células se cuentan cuadro por cuadro y se hace un total. Se recomienda realizar
el conteo siguiendo las flechas para evitar que se cuenten las células dos veces o no
que no se cuenten. Alrededor de cada cuadricula se observa que hay tres líneas que
delimitan el cuadro, que son fundamentales en el momento del conteo ya que definen
cuales células son contables o cuales están fuera del campo de conteo. Las células que
no tocan la segunda línea son contables, si la tocan o están encima de ella no se
incluyen. Gráficamente se puede apreciar la forma correcta de conteo. Las células que
tiene una X son las que no se deben contar.

Figura 7. Conteo en cámara de Neubauer.

• Después de contar las células se procede a calcular el número de células por unidad
de volumen. Para esto se utiliza el área de cada cuadro, el espacio ocupado por el
líquido en el que están las células que es el mismo espacio que hay entre la cuadricula
de la cámaray la laminilla de cuarzo.

• Para el cálculo de número de levaduras, debemos sumar las células contadas en los 5
cuadrados y multiplicar por 5 para obtener un estimado de las células en el área del
cuadrado grande central de recuento. En caso de haber contado la totalidad del área
central, puedes obviar este paso.

• El volumen de líquido que contiene el cuadrado grande central de recuento es de

1/10,000 [mL], por lo que para calcular cuántas células hay en 1 [mL], habría que

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multiplicar por 104.

Para conocer el Factor de dilución, debemos utilizar la siguiente fórmula:

Fd = (Vm + Vd)/Vm (1)

donde Fd: factor de dilución, Vm: volumen de la muestra y Vd: volumen del disolvente (en
nuestro caso, agua).

Si se realizan varias diluciones, estas deben multiplicarse entre sí para obtener el valor
final del Fd. Por ejemplo, si se diluye primero 1/10 y luego 1/100, serian dos diluciones
en serie de 1/10. Para cada caso el Fd es 10, por lo tanto, Fd final = 10 x 10 = 100.

• Finalmente, la cantidad de células por mL del recuento (CR) sería el siguiente:

CR = CT x 50,000* x Fd [cel/mL] (2)

donde CT: células totales contadas y Fd: factor de dilución. En el caso que se cuente la
totalidad del área central, este valor se reemplaza por 10,000.

A modo de ejemplo, si se diluye una muestra de levaduras hasta un factor 1/100 y se

cuentan 280 células de levadura en 5 cuadrados tenemos lo siguiente:

CR = 280 x 50,000 x 100 = 1.4 x 109 células por mL

• Otro método para el recuento consiste en obtener el promedio (𝑋̅) de los 5 cuadros
y aplicar la siguiente fórmula:

𝑋̅ 𝑐é𝑙𝑢𝑙𝑎𝑠 400 𝑐𝑢𝑎𝑑𝑟𝑜𝑠 1000𝑚𝑚3

𝐶𝑅 = × × (3)
16 𝑐𝑢𝑎𝑑𝑟𝑜𝑠 0.1 𝑚𝑚3 1𝑐𝑚3 (𝑜 1 𝑚𝐿)

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IV. MATERIALES Y METODOLOGIA

A. MATERIALES
• Pipetas Pasteur.
• Lamina cubre objeto.
• Tubos de ensayos.
• Gradilla.
• Agua estéril.
• Levadura seca. (Saccharomyces cerevisiae).

B. EQUIPOS
• Microscopio.
• Cámara de Neubauer.

C. METODOLOGIA
1. Colocar 2 ml de agua estéril más la muestra de levadura L-51. Luego se realizará
diluciones 10-1 y 10-2.

Figura 8. Diluciones para conteo en cámara de Neubauer.

2. Colocar la lámina cubreobjetos sobre la zona central de la Cámara de Neubauer.

3. Con una jeringa o micropipeta tomar una determinada cantidad de la muestra 10-1 y
colocar en el borde del cubreobjetos de manera que el líquido entre por capilaridad
sin que se formen burbujas en la cámara.

4. Llevar la cámara al microscopio y con el objetivo 10x localizar en el campo visual el

cuadrante central, enfocar de tal forma que se observen nítidamente los cuadrantes
y luego se pasa al objetivo 40x.

5. El recuento se determina sumando el total de células presente en los 5 cuadros del

cuadrante central de la cámara y aplicando la fórmula 2. También puede determinarse
aplicando el promedio de células de los 5 cuadros y calcular utilizando la fórmula 3.

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V. REFERENCIA BIBLIOGRAFICA

Aquihuatl, M y Pérez, M. 2004. Manual de prácticas de laboratorio de microbiología

general. Primera edición. Editorial de la Universidad Autónoma Metropolitana-
Iztapalapa. México

Toro, R. 2005. Manual para la introducción al laboratorio de microbiología. Primera

Edición. Editorial de la Universidad de Caldas. Colombia.

Álvarez, R.2007. Estadística aplicada a las ciencias de la salud. Editorial Diaz de

Santos. España

Exebio, C. 2007.Curso de estadística. Definiciones básicas.

[Consultado el 18 de Abril del 2012]. Disponible en:
http://es.scribd.com/doc/6692651/DEFINICIONES-BASICAS

Estrada, N. 2000. La biodiversidad en el mejoramiento genético de la papa. Centro

de información para el desarrollo- CID. Plural Editores. Bolivia

Fuentes, X; Castiñeiras, M y Queraltó, J. 1998. Bioquímica Clínica y Patología

molecular. Segunda Edición. Editorial Reverté. España

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