Técnicas analíticas e instrumentales

TP N°4 –Turbidimetría

Objetivo general
Determinación de la biomasa por cuatro métodos distintos.

Objetivos específicos
Se determinará la biomasa de una suspensión celular de levadura para panificación
por cuatro métodos distintos:

1. Determinación por peso húmedo

2. Determinación por peso seco
3. Turbidimetría
4. Conteo de células

Los tres primeros métodos enunciados no informan acerca de la viabilidad celular. Es

decir, aquellas células que están vivas con su membrana celular íntegra. El conteo
celular informa de ello sólo si se utiliza algún colorante vital. Esto último se explicará
más adelante.

Procedimiento
Le será entregada una suspensión celular de levaduras a la cual deberá calcular el
contenido de biomasa

1. DETERMINACIÓN DE PESO HÚMEDO

a) Pesar los tubos limpios y secos: cada grupo tendrá en su mesada dos tubos de
vidrio cónicos los cuales deberán pesar en balanza analítica. Registrar el peso
(todos los decimales)
b) Tomar 5 mL de la suspensión original y colocar en los tubos
c) Centrifugar 10 min a 3000 rpm
d) Descartar el sobrenadante por vuelco directo en la pileta (movimiento neto y
rápido)
e) Escurrir los tubos boca abajo (contenidos en la gradilla y con papel absorbente
debajo
f) Pesar en balanza analítica. Registrar todos los decimales
g) Calcular el peso húmedo (g mh/mL gramos de materia húmeda por mililitro)
mediante la siguiente ecuación:
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(𝑃𝑒𝑠𝑜 𝑖𝑛𝑖𝑐𝑖𝑎𝑙 𝑑𝑒𝑙 𝑡𝑢𝑏𝑜 + 𝑚𝑢𝑒𝑠𝑡𝑟𝑎 ℎú𝑚𝑒𝑑𝑎) − (𝑃𝑒𝑠𝑜 𝑖𝑛𝑖𝑐𝑖𝑎𝑙 𝑑𝑒𝑙 𝑡𝑢𝑏𝑜 𝑣𝑎𝑐í𝑜)
𝑃𝑒𝑠𝑜 ℎú𝑚𝑒𝑑𝑜 =
𝑣𝑜𝑙𝑢𝑚𝑒𝑛 𝑑𝑒 𝑙𝑎 𝑚𝑢𝑒𝑠𝑡𝑟𝑎

Volumen de la muestra= 5mL

Expresar los pesos en gramos

h) Promediar los valores

2. DETERMINACIÓN DE PESO SECO

a) Llevar los 2 tubos anteriores a estufa toda la noche a 50°C

b) Pesar nuevamente los tubos
c) Calcular el peso seco (g ms/mL gramos de materia seca por mililitro)
mediante la siguiente ecuación:

(𝑃𝑒𝑠𝑜 𝑑𝑒𝑙 𝑡𝑢𝑏𝑜 + 𝑚𝑢𝑒𝑠𝑡𝑟𝑎 𝑠𝑒𝑐𝑎) − (𝑃𝑒𝑠𝑜 𝑖𝑛𝑖𝑐𝑖𝑎𝑙 𝑑𝑒𝑙 𝑡𝑢𝑏𝑜 𝑣𝑎𝑐í𝑜)
𝑃𝑒𝑠𝑜 𝑠𝑒𝑐𝑜 =
𝑣𝑜𝑙𝑢𝑚𝑒𝑛 𝑑𝑒 𝑙𝑎 𝑚𝑢𝑒𝑠𝑡𝑟𝑎

d) Promediar los valores

3. TURBIDIMETRÍA

Para la medición de turbidez se empleará un turbidímetro portátil.

a) Preparar diluciones de la suspensión original según el siguiente esquema:

Diluciones de susp. original 1/1 1/2 1/5 1/10 1/20 1/50 1/100
Volumen de suspensión (mL) alícuota pura 50 20 10 4 2 1
Agua estéril (mL)* x 50 80 90 96 98 99

*c.s.p. 100mL

b) Calibrar con suspensiones comerciales de formazina

c) Leer la turbidez en el equipo (unidades NTU)
d) Realizar los cálculos según la siguiente ecuación:
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𝐴 𝑥 (𝐵 + 𝐶)
𝑇𝑢𝑟𝑏𝑖𝑑𝑒𝑧 (𝑁𝑇𝑈) =
𝐶

Donde:

A= NTU encontradas en muestra diluida (lectura realizada)

B= volumen (mL) de agua en la dilución
C= volumen (mL) de la muestra tomada para dilución
B + C= 100mL

En relación a este ensayo:

1) ¿Qué puede decir respecto del diseño?

2) ¿Cree que está correctamente planteado?
3) ¿Considera que es válida la información obtenida? ¿Por qué?

4. CONTEO CELULAR

 Introducción teórica

La cámara de Neubauer (Fig. 1) es un portaobjetos especializado en el cual una retícula

es grabada con láser. Su construcción permite conocer el volumen de cualquier líquido
colocado sobre él y por debajo de su cubreobjetos. La retícula se encuentra compuesta
por nueve cuadros de 1 mm2 cada uno (cuadro azul, 1 de esos nueve en Fig. 2). Los
cuatro cuadros de 1 mm2 localizados en cada esquina poseen a su vez 16 cuadros de
0.0625 mm2 (Fig. 2). El cuadro central (también de 1 mm2) se encuentra compuesto
por 25 cuadros de 0.04 mm2 (en verde). Estos cuadros a su vez se encuentran
compuestos por cuadros menores de tan solo 0.0025 mm2 (en negro). Dada la
profundidad de la cámara de 0.1 mm, cada una de estas unidades corresponde a
volúmenes fijos conocidos, según se ilustra en la Fig. 2.

Figura 1. Cámara de Neubauer Figura 2. Zonas de conteo de células

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La cuenta celular para cada cuadrante externo (cuadros 4x4, Fig. 3A, uno de los cuales
es ampliado en la Fig. 3B) deberá oscilar entre 20-50 células, teniendo un total de
células para los cuatro cuadrantes 4x4 de 80-200 células. Las células localizadas en los
márgenes externos de cada esquina (marcados en rojo) NO deberán ser incluidas en
las cuentas

Fig. 3. Zona habitual de conteo de células

Cuando existe una densidad celular mayor a 50 células por cuadrante 4x4, se procederá
al conteo del cuadrante central o bien una nueva carga de la cámara con una dilución
mayor de la muestra.

Para calcular la concentración celular presente en la suspensión celular original, aquella

de la cual se tomó la alícuota, cuando se han utilizado los cuatro cuadros de 4x4
(azules, marcados como L) de la cámara (Fig. 4):

Fig. 4
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Concentración celular= N° de cél contadas ÷ 4 × factor de dilución × 10,000

Para calcular la concentración celular presente en la suspensión celular original cuando

se ha utilizado el cuadro central de 5x5 (verde) –habitualmente cuando el conteo total
es mayor a 200 células-:

Concentración= Cuenta de células ÷ 100 × factor de dilución × 10,000.

Para calcular el total de células presentes en la suspensión original de la cual se tomó

la alícuota:

Células totales = concentración celular × volumen total de muestra original

(aquel registrado al inicio del procedimiento)

La concentración óptima de la muestra para leer en cámara de Neubauer es en torno a

106 (1 millón) aplicando las diluciones correspondientes. Por debajo de 250.000
células/ml (2,5 x 105) la cantidad de células contadas no es suficiente para poder dar
una estimación lo suficientemente fiable dado que la probabilidad de cometer errores
de conteo crece demasiado. Por encima de la concentración 106 es conveniente diluir la
muestra para acercar la concentración al rango óptimo.

 Evaluación de la viabilidad celular con colorante vital (no se

hará en este TP pero deben conocer el tema)

El azul tripán (azul diamina, azul niagara, azul vital) es un colorante derivado de la
toluidina que posee la capacidad de teñir a tejidos y células muertas. Este colorante es
uno de varios empleados para evaluar la viabilidad de células por exclusión de
captación, ya que no puede penetrar y teñir a las células vivas con membranas
íntegras. El azul tripán no es necesario para realizar conteos simples de células, pero
sí es imprescindible para diferenciar entre las células muertas (con disrupción de
membrana) de las vivas con membranas íntegras. A pesar de que el protocolo original
estipulaba el uso de una mezcla isovolumétrica de azul tripán y suspensión celular
(digamos, 10 µL de suspensión celular y 10 µL de azul tripán), también se puede hacer
uso de otros tipos de diluciones, especialmente para suspensiones celulares muy
concentradas, siempre y cuando se considere el factor de dilución correspondiente en
los cálculos finales.

Para calcular viabilidad celular (expresada como el porcentaje de células que están
vivas):

Número total de células vivas (blancas) ÷ Número total de células vivas y

muertas (tanto blancas como azules) × 100
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Las células mezcladas con azul tripán deberán ser evaluadas inmediatamente. Incluso
las células vivas captarán el colorante tras exposiciones superiores a los 10 minutos.

 Procedimiento

a) Mezclar bien la suspensión celular correspondiente a la dilución 1/100 de la

suspensión original
b) Tomar una alícuota de 10ul y con el mismo tip llenar la cámara de Neubauer
(superior o inferior, pero solo una cámara)

c) Encender el microscopio y colocar el objetivo 10x (mejor sería 20x) en el

trayecto óptico del microscopio en campo iluminado
d) Colocar la cámara en el microscopio y localizar la retícula grabada
e) Permitir que las células se asienten durante 1 min aprox. y proceder al conteo
f) Contar las células birefringentes que sean observadas en el sector de cuadros
4x4
g) Realizar el cálculo correspondiente

Bibliografía
Conteo celular y evaluación de viabilidad; Standard Operating Procedures (SOPs) Laboratorio
de Genómica Viral y Humana, Facultad de Medicina UASLP

Wikipedia contributors. Hemocytometer. Wikipedia, The Free Encyclopedia.

http://en.wikipedia.org/wiki/Hemocytometer.