[Escriba aquí] [Escriba aquí]

GUÍA DE LABORATORIO # 6
PROGRAMA TECNOLOGÍA EN AGROFORESTERÍA
CURSO FITOPATOLOGÍA GENERAL
CONTEO DE CÉLULAS CON HEMACITÓMETRO O CÁMARA DE NEUBAUER

INTRODUCCIÓN

Cuando se trata de evaluar la resistencia de las plantas a enfermedades o efectuar estudios específicos
(epidemiológicos) del patógeno, muchas veces es necesario recurrir a la inoculación artificial, ya sea en
invernadero o en campo. Para esto se utiliza inoculo a una concentración especifica (es decir, un número
determinado de esporas por mililitro), según el patógeno y hospedero en estudio, con la finalidad de
obtener una buena infección que permita observar las diferencias entre los materiales evaluados (Castaño-
Zapata. y Del Río Mendoza, 1997).

Para determinar la concentración se usa un hemacitómetro, con el cual se hacen conteos de esporas o
células bacteriales en campos de dimensiones conocidas, que darán el número de esporas por ml de la
suspensión inicial. De esta forma, por medio de diluciones se obtiene el inoculo en la concentración
deseada.

Existe diferentes técnicas para determinar el número de microorganismos o el peso seco (biomasa), de
las células microbianas presentes en un cultivo. Los métodos en general se agrupan en directos o
indirectos.

Uno de los métodos directos más utilizado a nivel mundial es con el uso del hemacitómetro o cámara de
Neubauer (Fig 1), es un dispositivo de precisión hecho de vidrio óptico especial. Se utiliza para contar
células u otras partículas en suspensiones bajo el microscopio. Las cámaras de recuento se utilizan
principalmente para el análisis de sangre (recuento de leucocitos, eritrocitos, trombocitos). Además, las
cámaras de recuento sirven para contar bacterias, espermatozoides y esporas de hongo. La cámara de
Neubauer es un grueso portaobjetos de cristal, dividido en tres secciones, la sección media a su vez
cuenta con un rayado fino formando una cuadrícula de 3 mm x 3 mm identificable fácilmente al
microscopio. Así mismo, esta sección está a exactamente 0.1 mm más bajo que las secciones laterales,
estableciendo un volumen fijo una vez colocado el cubreobjetos especial (cubre hematocimetro) (Fig 2).
(Baker, y Breach, 1990).
[Escriba aquí] [Escriba aquí]

Figura 1. Cámara de Neubauer

https://www.marienfeld-superior.com/camaras-de-recuento-3314.html

Figura 2. Profundidad de la cámara de Neubauer

Al observar al microscopio la sección central, podremos identificar un cuadrado de tres por tres, que en
conjunto mide 9 mm2.
En esta cuadrícula podemos localizar fácilmente los cuatro cuadrantes que están en los extremos, cada
uno de ellos divididos a su vez en un conjunto de 4 x 4, en el esquema correspondiente se muestran con
la letra A (Fig. 3). En la parte central se puede apreciar un cuadro central de 1 x 1 mm dividido en 25
cuadrantes de 0.2 x 0.2 mm, en la figura se encuentra delimitada por un recuadro e indicado por una
flecha (Fig. 4). Los cuadrantes denotados con la letra A, se utilizan para el conteo de células grandes y el
cuadro central se utiliza para el conteo de células pequeñas.
[Escriba aquí] [Escriba aquí]

Figura 3. Distribución de los cuadrantes de la cámara de Neubauer

La ventaja de este método está dada por la rapidez para el cálculo del número de células, pero solo debe
ser utilizado en muestras con poblaciones concentradas de células (>10 x 106 células/mL), pues con
menores poblaciones, la observación al microscopio es poco significativa estadísticamente. Para obtener
resultados más exactos, es recomendable tener un conteo entre 200 y 300 células por muestra.
OBJETIVOS.

Dar a conocer a los estudiantes los componentes del hemacitómetro y enseñar la manera
de determinar las concentraciones de soluciones con hongos.

Materiales y Equipos

Cámara de Neubauer Cajas Petri con crecimiento de hongos (Lab. anteriores)

Pipetas Pasteur (2 por grupo)
Beaker de 20 ml (1 por grupo)-
Magnetos para mezclar (dos por grupo)
Tubos de ensayo (3 por grupo)
Tween 80-Aceite dispersante de esporas
Pipetas de 1 ml (1 por grupo)
Asas bacteriológicas (1 por grupo).
Agua destilada
Gradilla- (uno por grupo)

PROCEDIMIENTO

1. Preparación de diluciones
[Escriba aquí] [Escriba aquí]

En un Beaker de 20 ml, medir 10 ml de agua destilada, adicionar el raspado superficial del cultivo del
hongo de la caja Petri con cuidado, para no mezclar con agar nutritivo, adicionar una gota de Tween 80
y colocar un magneto para mezclar en el vórtex. Esta sería la solución madre.
En tres tubos de ensayo, medir 9 ml de agua en cada uno. De la solución madre fúngica tomar un ml y
adicionarlo al primer tubo de ensayo y marcarlo como 10-1, mezclar en el vórtex. De este tubo de ensayo,
tomar 1ml y adicionarlo al segundo tubo, el cual será 10 -2 y de éste tomar un ml y adicionarlo al tercer
tubo, el cual será 10-3.
Tomar una gota con una pipeta Pasteur y colocarla en el centro del hemacitómetro, enseguida colocar el
cubreobjetos cuidando que no queden burbujas y que la gota no se derrame ni se salga de los campos de
conteo. Esto daría un dato erróneo, ya que el excedente arrastraría las esporas. Observe la distribución
de las esporas. Estas deben estar uniformemente distribuidas por todos los cuadros de la cámara.

El hemacitómetro consta de dos campos de conteo, cada uno con nueve cuadros que, a su vez, están
divididos en cuadros más pequeños (Figura 4). Tanto los cuadros grandes como los pequeños tienen
dimensiones conocidas, de tal modo que por medio de fórmulas se puede obtener el número de esporas
por ml.
[Escriba aquí] [Escriba aquí]

A B

1 2
E
5

3 4

C D

Figura 4 Campos y Dimensiones de la cuadrícula del hematocimetro

a) Conteo de células pequeñas

Estas se cuentan en el mm² central, el cual está compuesto de 25 grupos de 16 cuadrados pequeños.
Cada uno de estos mide 0.004mm². Se cuenta el número de esporas en los cuatro cuadros demarcados
con los números 1, 2, 3, 4 y 5.
El número de células pequeñas/ml se calcula de la siguiente manera:
0.2 mm x 0.2mm x 0.1 mm = 0.004mm³
X= E/5 x 1/0.004
X=Ex 50, donde X= № de células/mm³.
E= células en los 5 cuadrados de 0.04mm².
Como el Volumen de la muestra es conocido, se trabaja con un volumen de 1 ml y 1 ml (cc) = 1.000
mm³
[Escriba aquí] [Escriba aquí]

Entonces la formula final será X= Ex50x1000

Ejemplo de conteo de esporas

No de A B C D E SUMA
conteo
1 8 5 7 7 8 35
2 6 6 6 8 8 34
3 4 6 8 7 6 31
4 6 8 8 6 6 34
5 8 7 6 6 5 32
6 7 9 7 5 7 35
201
No promedio de células 201/6=33.5
Aplicacando la fórmula:
X=33.5x50x1000=1.675.000 esporas/ml
Esta concentración corresponde a la de la suspensión inicial.

Este conteo de células permitirá preparar la concentración de células, dependiendo de la concentración

de la solución madre aplicando la siguiente fórmula:
C1 V1 = C2 V2
Donde:
C1 = Concentración inicial (conocida en el conteo)
V1 = Volumen inicial (establecido arbitrariamente al preparar el inoculo)
C2 = Concentración final deseada (según el estudio a realizar)
V2 = Volumen final (desconocido)
Despejando:
C1 x V1
V2 = ————
C2
Si el volumen inicial era de 100 ml y se desea una concentración de 30,000 conidios/ml, entonces
concentración calculada x 100 ml
V2 = ———————————————— = volumen final (ml)
30,000
Con los datos que se obtengan:
a) Calcular la concentración del inóculo inicial.
b) Calcular la cantidad de líquido que se debe agregar a la suspensión de esporas preparada, para
obtener una concentración de 300 esporas por ml.
[Escriba aquí] [Escriba aquí]

b) Conteo de células grandes

Las células grandes se cuentan en los cinco 5 cuadrados denotados por las letras A, B, C, D y que tienen
1 mm de lado; Cada cuadro mide 1 mm². Para calcular el número de células en los cuatro (4) cuadrados
de las esquinas y el central. Sume el total de células en los cuadrados y calcule el número de células/ml
de la siguiente manera:
X=E/5 x 1/0.1
1 mm x 1 mm x 0.1 mm = 0.1 mm³
X= E x 2
X= № de células/mm³.
E= Células en los 5 cuadrados de 1 mm³.
1 ml (cc) = 1.000 mm³
X = E x 2.000
X= № de células/ml
V₁ C₁ = V₂ C₂
V₁ = Volumen inicial de la suspensión.
C₁ = Concentración inicial de células.
V₂ = Volumen final de la suspensión.
C₂ = Concentración final de la suspensión de células.
Cada grupo deberá realizar (6) lecturas de las suspensiones de hongos suministrados en el Laboratorio.
Realizar los cálculos correspondientes a concentración de inoculo realizando todos los cálculos
necesarios para determinar la concentración del inoculo.

BIBLIOGRAFÍA.
Aquiahuatl Ramos, M. A., y Pérez Chabela, M. L. 2004. Manual de prácticas del Laboratorio de Microbiología
General. Universidad Autónoma Metropolitana, Unidad Iztapalapa. México. Departamento de
Biotecnología. 116 p.

Baker, F. J., y Breach, M. R. 1990. Manual de técnicas de Microbiología Médica. Editorial Acribia. Zaragoza,
España. 676 p.
[Escriba aquí] [Escriba aquí]

Castaño-Zapata, J. y Del Río Mendoza, L. 1997. Manual para el diagnóstico de hongos, bacterias, virus
y nematodos fitopatógenos. Zamorano- Universidad de Caldas. 210 p.
Food and Drug Administration (2009) [en línea]. USA: Department of Health & Human Services FDA.
[consultadoene.,2011].Disponibleeninternet:
http://www.fda.gov/Food/ScienceResearch/LaboratoryMethods/BacteriologicalAnalyticalManualBAM/defaul
t.htm>

Madigan, M. T.; Martinko, J.M.; y Parker J. 2003. Brock: Biología de los Microorganismos. Editorial
Prentice Hall Hispanoamericana S.A. 10ª Ed. Madrid. 1011p.

Pareja, E.I. Microbiología y Biotecnología (2006) [en línea]. España: Universidad de Granada.
Departamento de Microbiología, Instituto de Biotecnología. [consultado ene., 2011]. Disponible en
Internet: < http://www.ugr.es/~eianez/>

Rojas Triviño, A. 2003. Guía práctica de morfología y tinciones simples. Universidad de Pamplona,
Facultad de Ciencias Naturales y Tecnológicas. Pamplona. 5 p.

Pelczar, M., y Chan, E.C.S. 1984. Elementos de Microbiología. Editorial MacGraw Hill, México.