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UNIVERSIDAD ANDRES BELLO

FACULTADDE
FACULTAD DECIENCIAS
CIENCIASBIOLÓGICAS
DE LA VIDA
DEPARTAMENTO DE CIENCIAS BIOLÓGICAS

LABORATORIO DE BIOLOGÍA CELULAR BIO-131


LABORATORIO BIOL131

GUÍA Nº 3:
MICROSCOPIA II
INTRODUCCIÓN

Cuando las ondas de luz son emitidas desde una fuente coherente (como un láser), las ondas
están en fase, o sea, los picos y los valles de las ondas coinciden. Esto tiene el efecto de
reforzar las ondas y crear una mayor amplitud, que percibimos como un aumento en el
brillo. Sin embargo, cuando las ondas de luz están fuera de la fase, se interfieren entre sí
reduciendo la amplitud y el brillo.

Cuando las ondas de luz pasan de una sustancia a otra, se curvan o se difractan y sus
trayectorias cambian ligeramente. Esta difracción altera las relaciones de la fase de las
ondas, dando como resultado cantidades variables de interferencia. La cantidad de
interferencia producida cuando la luz atraviesa las diferentes estructuras de una célula no es
grande, y el contraste que se detecta es escaso cuando la célula se observa con un
microscopio óptico común, lo cual por su puesto es la razón por la cual las células deben
teñirse. Sin embargo, en los microscopios de contraste de fase y de interferencia diferencial,
sistemas ópticos especialmente diseñados intensifican la escasa interferencia y
proporcionan un mayor contraste. La resolución de estos microscopios es limitada, como
ocurre en un microscopio óptico común, pero suministran una perspectiva diferente de la
célula viva, mostrando aspectos difíciles de detectar en otro sistema.

Otra técnica usada frecuentemente en las células vivas es la microscopia de campo oscuro,
en la cual el haz de iluminación llega a la muestra desde el costado y los sistemas de lentes
detectan la luz reflejada por el espécimen, que aparece como un objeto brillante
contra un fondo oscuro. Los rasgos de las células que son visibles en estas
fotomicrografías, a menudo adquieren un gran relieve.

Actualmente, ocurre un rápido progreso en el uso de otras técnicas microscópicas; por


ejemplo, acoplando cámaras de televisión a los microscopios ópticos es posible efectuar las
observaciones en la pantalla y grabarlas en una cinta de video. Ajustando los controles,
como puede hacerse en un aparato de televisión, el “ruido” de fondo puede reducirse,
mejorar el contraste e intensificar aspectos particulares.

Los constantes avances en la microscopía han permitido su utilización en muchos aspectos


de la biología celular, fisiología e incluso en patología humana, uno de éstos es la
determinación del tamaño celular así como también la determinación del número de
células en suspensión. Por ejemplo, en hematología humana no tan sólo es importante
conocer el tipo y características de las células presentes en la sangre, sino que además el
número de cada una de ellas presentes en un volumen determinado (por ej.: 1 ml o 1 mm3).

Objetivo del práctico:

En este laboratorio el objetivo principal es que el estudiante observe preparaciones frescas


generando un campo oscuro; conozca la técnica de recuento de glóbulos rojos a través de la
cámara de Neubauer y determine el tamaño celular en un frotis sanguíneo permanente.
Recuento de células en cámara de Neubauer:

Las cámaras de recuento se utilizan para determinar el número de partículas por unidad de
volumen de un líquido. Las partículas leucocitos, eritrocitos, trombocitos, bacterias,
esporas, polen etc. se cuentan visualmente con un microscopio.
La placa base fabricada en vidrio óptico especial tiene el tamaño de un portaobjetos (Fig.1
A). Las ranuras fresadas en la superficie de la placa base la dividen en dos zonas anchas
exteriores y 3 campos pequeños interiores. A diferencia de las zonas exteriores, que se
utilizan para rotulación, los campos interiores están esmerilados y pulidos (Fig.1 B). En el
campo central (= fondo cámara) están grabadas dos cuadrículas de recuento separadas una
de otra por una ranura. El fondo de la cámara del campo central es usualmente 0,1 mm
más bajo (= profundidad cámara) que ambos campos adyacentes. Entre el campo central y
el cubreobjetos ya colocado existe por tanto una ranura de 0,1 mm. La limitación lateral del
volumen a contar se forma mediante las superficies imaginadas por la proyección vertical
sobre las líneas exteriores de la cuadrícula de recuento.

Procedimiento para utilizar la


cámara: Se coloca un cubreobjeto
sobre una cámara Neubauer limpia
y seca, y se deposita una gota en
uno de los lados del cubreobjeto;
esta gota penetra por capilaridad y
rellena el retículo de la misma.
Una vez preparada se espera un
poco para que sedimenten las
células en reposo, y luego se
procede a colocar la cámara sobre
la platina del microscopio (no
colocar antes, pues el calor de la
fuente de luz comienza a evaporar
el líquido).

Fig. 1: Procedimientos en la utilización de una cámara de Neubauer.


Como determinar el número de células con cámara de Neubauer usando el cuadrado
central: Recuento de glóbulos rojos.

El cuadrado central posee 25 cuadrados grandes (cada uno subdivido en 16 cuadrados


menores) (Fig.1 C). Si cada uno de los cuadrados grandes posee 1/5 mm de lado, la
superficie de 1 cuadrado grande será:

= 1/5 1/5 = 1/25 2

Volumen de un cuadrado grande (1/10 mm de profundidad):

= 1/25 2 1/10 =1/250 3

Si contamos "a" glóbulos rojos en "n" cuadrados, el número de glóbulos por cuadrado será
“a / n”, y si en un cuadrado de volumen 1/250 mm3 hay “a / n” glóbulos rojos, en 1 mm3
habrá X.

= 250/

Siendo X el número de glóbulos rojos existentes por cada mm3 de sangre diluida.

Si la sangre se diluyó a 1/100 o 1/200, habrá que multiplicar el valor X por 100 o 200,
respectivamente, con lo cual obtendremos un nuevo valor, Y, que representa el número de
glóbulos rojos existentes por cada mm3 de sangre (sin diluir).

3
= 250/ = /

Fig. 2: Área de recuento de células rojas.


Para tener en cuenta:

1. Observe que en la grilla de la cámara de Neubauer las áreas de recuento de


eritrocitos y linfocitos son diferentes, debido a que los eritrocitos se encuentran en
mayor cantidad.
2. Mientras que los glóbulos rojos se cuentan en las áreas del cuadrado central, los
glóbulos blancos se cuentan en las áreas coloreadas de azul (los cuadrados L). (Fig.2)

3. Tenga en cuenta que la grilla central mide 1mm x 1mm de área, la cual se subdivide
en 25 cuadrados y cada uno de estos cuadrados mide 1/5 mm x 1/5 mm.
Para acelerar el conteo, se cuenta el número de glóbulos rojos (a) en los 5 cuadrados
(n) coloreados de rojo para calcular el nº glóbulos rojos/μl.
1μl (microlitro) = 1 mm3)

4. Cuando un eritrocito se sitúa en la mitad de las líneas superior y/o de la izquierda,


entonces es contabilizado. Pero no se contabiliza cuando se sitúa en la mitad de las
líneas inferior y/o de la derecha.

5. El rango normal de recuento de glóbulos rojos es el siguiente:


o Mujeres: 3.9-5.6 millones/µl.
o Hombres: 4.5-6.5 millones/µl.
ACTIVIDADES PRÁCTICAS.

A.- Campo Oscuro

Procedimientos y observaciones de muestras frescas

Si bien existen otros microscopios que incluyen en su mecánica la alternativa de realizar


observaciones por la técnica de microscopía de campo oscuro, el microscopio convencional
de campo claro puede ser adaptado para realizar una observación con esta técnica
de manera muy simple.
Prepare una muestra temporal de cabello humano y proceda a observar la muestra en el
microscopio de campo claro normal (a 40X). Luego, coloque un círculo d e c a r t ó n
n e g r o q u e l e s e r á e n t r e g a d o p o r e l p r o f e s o r sobre la fuente de luz en la parte
inferior del microscopio, de manera tal que la luz pase solo por los bordes del círculo.
¿Cuál es la diferencia en la observación con el microscopio de campo claro y el de
campo oscuro? ¿Cuál es el efecto obtenido?

Describa este cambio observando con el objetivo 40X y realice un dibujo de la muestra
observada en campo claro y otro dibujo de la muestra observada en campo oscuro. Ambos
dibujos deben estar dentro de un círculo de 8cm de diámetro, indicando a un costado de
éste, título de muestra; tipo de muestra (temporal o permanente); tinción; aumento objetivo;
aumento total y observaciones. Anote los nombres de las estructuras identificadas en su
observación.

B.-Reglilla

Dentro de las posibilidades de resolución del microscopio óptico, es posible medir


directamente los tamaños de células y estructuras (núcleos, vacuolas, cloroplastos).
Para realizar estas mediciones, se necesita tener una reglilla en el ocular del microscopio.
Esta reglilla posee una escala que contiene 100 rayas sin unidades (Fig. 3). Por lo tanto,
previo a medir una célula hay que calibrar la reglilla usando un cuadro de calibración, como
el que se muestra a continuación a modo de ejemplo:

Distancia en Distancia en Distancia entre


Objetivo
Ocular Patrón conocido 2 rayas
4X 0 a 80 rayas 1 mm 12,5 µm
10X 0 a 100 rayas 0,5 mm 5 µm
40X 0 a 80 rayas 0,1 mm 1,25 µm

La calibración se realiza usando un portaobjeto especial como patrón, que posee una lámina
de vidrio en la cual existe grabada una línea graduada de 1 mm de largo.
Fig. 3: Reglilla en forma de cruz, situada en el ocular.

Fig. 4: Diagrama de la reglilla situada en el ocular calibrada en el objetivo 4X.

Determine el tamaño celular promedio de un glóbulo rojo y de un glóbulo blanco en un


frotis sanguíneo permanente. Para ello realice la observación de la muestra con el
objetivo 40X y mida 3 células de cada tipo para establecer un promedio.
C.- Determinación del número de células

1) Su profesor le entregará una suspensión de eritrocitos cuyo número de células por µl o


por ml tendrá que ser determinado por Ud.

2) Saque una alícuota de 1µl de la suspensión de células y llévelos a 300 µl con suero o
PBS (ver preparación más abajo). Agite bien para obtener una mezcla homogénea.

3) Para determinar el número de células en una suspensión se usa una cámara de


NEUBAUER. La cámara se carga colocando primero un cubreobjetos sobre el
reticulado y posteriormente depositando una gota en la cámara, adyacente al
cubreobjetos para que entre por capilaridad. Espere unos 30 segundos para permitir que
las células sedimenten. Enfoque el reticulado de la cámara, primero con el lente de
menor aumento del microscopio y luego cambie al objetivo 40X. Cuente las células que
ve en cada uno de los cuadrados señalados anteriormente. Tenga presente que si
demora mucho en el conteo, el calor de la fuente de luz comenzará a secar el líquido
dentro de la cámara, afectando el resultado.

4) Saque el promedio de la cantidad de células por L. Si desea calcular el número de


células por ml, simplemente multiplique la cantidad obtenida por 1000 (1 ml = 1000
µl).

Preparación de 1 litro de PBS: Buffer de uso frecuente.

PBS Buffer de fosfatos pH 7.4

1) 8 g (137 mM) NaCl


2) 0.2 g (2.7 mM) KCl
3) 1.44 g (10 mM) NaHPO
4) 0.24 g (2mM) KH2PO
5) 800 ml agua bi-destilada
6) Ajustar pH a 7.4 con HCl
7) Aforar a 1 litro.

Nota: Conservar a 4-8 °C. Es estable por unos 3 o más meses.


BIBLIOGRAFÍA:

6. Buffer PBS. Labtox: Protocolos y técnicas de laboratorio. (http://labtox-


02.blogspot.com/2006/02/pbs-buffer.html)
7. Introducción a la biología celular 2a. ed. Alberts, Bruce, 1938. 2006.
8. Biología celular y molecular 4a. ed. Lodish, Harvey. 2002.
9. Biología celular y molecular de De Robertis. De Robertis, Eduardo M. F; 2000.

Materiales de laboratorio. Microscopía II


Materiales por grupo (3 alumnos por grupo)

Microscopios.
Porta objetos.
Cubreobjetos.
1 cámara Neubauer con cubre objeto.
1 círculo negro para generar campo oscuro.
Un frotis de sangre.

Materiales por Laboratorio.

1 microscopio con reglilla.


2 tubos con 9 ml de PBS estéril.
3 tubos de ensayo estériles.
1 micropipeta 1000 µl.
1 caja con puntas azules estériles.
1 vaso pp. con alcohol para desechos.
1 jeringa de 3 o 5 ml.
1 tubo con anticoagulante (EDTA) de 3 o 5 ml.

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